胡倩 趙嘉英 嚴(yán)宏莉

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性炎癥性疾病，其主要病理特征表現(xiàn)為滑膜細(xì)胞增殖、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及關(guān)節(jié)軟骨破壞等[1]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織中的成纖維樣滑膜細(xì)胞是滑膜炎性增生的主要效應(yīng)細(xì)胞，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2]。研究顯示，抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞增生和炎性反應(yīng)可有效阻礙滑膜炎癥及增生，延緩類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)展進(jìn)程。羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)是中藥紅花的主要活性成分之一，具有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗腫瘤等功效[3-5]。研究顯示，羥基紅花黃色素A可能通過抑制Notch信號(hào)通路減少骨關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子的表達(dá)，減輕軟骨損傷[6]；羥基紅花黃色素A可減輕H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[7]。然而，羥基紅花黃色素A能否影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞損傷還未知。研究顯示，miR-20a-5p在糖尿病性心肌病(DCM)大鼠心肌組織和高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9C2中表達(dá)降低，上調(diào)miR-20a-5p可改善DCM大鼠心臟功能，減少心肌細(xì)胞凋亡，并抑制心肌細(xì)胞炎性反應(yīng)，miR-20a-5p有可能成為DCM治療的分子靶點(diǎn)[8]；miR-20a-5p在卵白蛋白(OVA)誘發(fā)的哮喘小鼠肺組織中呈低表達(dá)，過表達(dá)miR-20a-5p可通過靶向抑制ATG7表達(dá)減少哮喘小鼠肺組織細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)[9]。然而，miR-20a-5p在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的作用還未知。Starbase靶基因在線軟件預(yù)測(cè)顯示，Toll樣受體4(TLR4)可能是miR-20a-5p的靶基因[10]。因此，本研究建立TNF-α誘導(dǎo)的成纖維樣滑膜細(xì)胞MH7A損傷模型，以miR-20a-5p/TLR4為切入點(diǎn)，主要探究了羥基紅花黃色素A對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞凋亡和炎性因子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 MH7A 細(xì)胞系，上海通派生物科技有限公司；HSYA，純度>98%，上海源葉生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)液、CCK-8試劑盒、雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒，北京索萊寶；LipofectamineTM 2000試劑盒，美國(guó)Invitrogen公司；miR-20a-5p模擬物(mimics)、模擬對(duì)照序列(miR-NC)、miR-20a-5p抑制劑(anti-miR-20a-5p)和陰性對(duì)照序列(anti-miR-NC)，上海吉瑪制藥技術(shù)；胎牛血清，杭州四季青；兔抗人TLR4和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體，美國(guó)Santa Cruz公司；miRNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:在超凈工作臺(tái)內(nèi)將MH7A 細(xì)胞復(fù)蘇，加含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)密度至90%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)期MH7A細(xì)胞接種至6孔板中(2.5×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)12 h后，棄培養(yǎng)基。用LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體法，分別將miR-20a-5p mimics、miR-NC、anti-miR-20a-5p和anti-miR-NC轉(zhuǎn)染至MH7A細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，棄培養(yǎng)液，重新加含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。再培養(yǎng)24 h，RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-20a-5p表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，并收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖:將MH7A細(xì)胞及轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimics、miR-NC、anti-miR-20a-5p和anti-miR-NC的MH7A 細(xì)胞均接種至96孔板中(2.5×104個(gè)/孔)，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)液，分組處理。MH7A細(xì)胞分為對(duì)照組、TNF-α組、不同劑量(0.1、1.0、10 μmol/L)HSYA+TNF-α組，其中對(duì)照組細(xì)胞用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，TNF-α組細(xì)胞用含10 ng/ml[1]TNF-α的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，不同劑量(0.1、1.0、10 μmol/L)HSYA+TNF-α組細(xì)胞分別用含0.1、1.0、10 μmol/L[7]HSYA與10 ng/ml TNF-α的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimics、miR-NC的MH7A 細(xì)胞處理同TNF-α組，并分別記為miR-20a-5p+TNF-α組、miR-NC+TNF-α組。轉(zhuǎn)染anti-miR-20a-5p、anti-miR-NC的MH7A 細(xì)胞處理同10 μmol/L HSYA+TNF-α組，并分別記為anti-miR-NC+10 μmol/L HSYA+TNF-α組、anti-miR-20a-5p+10 μmol/L HSYA+TNF-α。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加10 μl CCK-8。孵育2 h后，酶標(biāo)儀(λ=450 nm)測(cè)各孔光密度(OD)值。OD值越小，說明細(xì)胞增殖活性越弱。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:將MH7A細(xì)胞及轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimics、miR-NC、anti-miR-20a-5p和anti-miR-NC的MH7A 細(xì)胞均接種至6孔板中(1.0×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)液，分組處理，方法同1.2.2。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，棄培養(yǎng)液，收集各組細(xì)胞，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞2次。利用Annexin?V-FITC/PI試劑盒，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡率(%)=(早期凋亡數(shù)+晚期凋亡數(shù))/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β和IL-6表達(dá):將MH7A細(xì)胞及轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimics、miR-NC、anti-miR-20a-5p和anti-miR-NC的MH7A 細(xì)胞均接種至6孔板中(1.0×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)液，分組處理，方法同1.2.2。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心(3 500 r/min、5 min)后，取上清，分別利用IL-1β和IL-6試劑盒檢測(cè)上清中IL-1β和IL-6水平。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-20a-5p表達(dá):將MH7A 細(xì)胞及轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimics、miR-NC、anti-miR-20a-5p和anti-miR-NC的MH7A 細(xì)胞均接種至6孔板中(1.0×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)液，分組處理，方法同1.2.2。培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞，并用PBS清洗2次。然后用miRNA抽提試劑盒提取細(xì)胞中總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后，行PCR擴(kuò)增。引物序列：miR-20a-5p上游5’-TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG-3’，下游5’-GGTACGATAGCGATCGAAG-3’；U6上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。2-△△Ct法計(jì)算miR-20a-5p相對(duì)于U6的表達(dá)量。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)TLR4蛋白表達(dá):將MH7A 細(xì)胞及轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimics、miR-NC、anti-miR-20a-5p和anti-miR-NC的MH7A 細(xì)胞均接種至6孔板中(1.0×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)液，分組處理，方法同1.2.2。培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞，并用PBS清洗2次。然后用RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白，經(jīng)BCA法定量、電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉后，分別用TLR4(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)一抗4℃孵育過夜。洗膜后，再用山羊抗兔二抗(1∶2 000)37℃孵育1 h。加顯影液避光顯影，曝光拍照，Image J軟件分析TLR4相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):由上海吉瑪制藥技術(shù)公司根據(jù)Starbase靶基因在線軟件預(yù)測(cè)顯示的miR-20a-5p與TLR4的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，插入pmirGLO雙熒光素酶，構(gòu)建TLR4野生型載體(WT-TLR4)，同時(shí)將結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，擴(kuò)增后插入pmirGLO雙熒光素酶，構(gòu)建TLR4突變型載體(MUT-TLR4)。將MH7A 細(xì)胞接種至6孔板中(2.5×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)12 h后，棄培養(yǎng)液。用LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體法，分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-TLR4與miR-20a-5p mimics、WT-TLR4與miR-NC、MUT-TLR4與miR-20a-5p mimics、或MUT-TLR4與miR-NC至MH7A 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，棄培養(yǎng)液，重新加含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。再培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞。加裂解液將各組細(xì)胞充分裂解，離心(3 500 r/min、10 min)后，取上清，檢測(cè)熒光素酶活性，結(jié)果以螢火蟲與海腎的熒光強(qiáng)度比值表示。

2 結(jié)果

2.1 羥基紅花黃色素A對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞增殖活性及凋亡的影響 與對(duì)照組比較，MH7A細(xì)胞經(jīng)10 ng/ml TNF-α刺激24 h后，細(xì)胞增殖活性降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)；而羥基紅花黃色素A可增強(qiáng)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞增殖活性(P<0.05)，并降低細(xì)胞凋亡率(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見圖1、表1。

表1 HSYA對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞增殖活性和凋亡的影響

圖1 HSYA干預(yù)的TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞凋亡

2.2 羥基紅花黃色素A對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，MH7A細(xì)胞經(jīng)10 ng/ml TNF-α刺激24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和IL-6表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而羥基紅花黃色素A干預(yù)后，TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和IL-6表達(dá)水平降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 HSYA對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響

2.3 羥基紅花黃色素A對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞中miR-20a-5p和TLR4表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，MH7A細(xì)胞經(jīng)10 ng/ml TNF-α刺激24 h后，細(xì)胞中miR-20a-5p表達(dá)降低(P<0.05)，TLR4蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；而羥基紅花黃色素A干預(yù)后，TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞中miR-20a-5p表達(dá)升高(P<0.05)，而TLR4蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見圖2、表3。

表3 HSYA對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞中miR-20a-5p和TLR4表達(dá)的影響

圖2 HSYA干預(yù)的TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)

2.4 上調(diào)miR-20a-5p對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞增殖活性、凋亡及炎性因子表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimics的MH7A細(xì)胞中miR-20a-5p表達(dá)明顯高于轉(zhuǎn)染miR-NC的MH7A細(xì)胞及對(duì)照組MH7A細(xì)胞(F=665.214，P<0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-NC的MH7A細(xì)胞與對(duì)照組MH7A細(xì)胞中miR-20a-5p表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.342，P>0.05)，表明上調(diào)miR-20a-5p表達(dá)的MH7A細(xì)胞構(gòu)建成功。與TNF-α組或miR-NC+TNF-α組比較，miR-20a-5p+TNF-α組MH7A細(xì)胞增殖活性升高，而凋亡率及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和IL-6表達(dá)水平降低(P<0.05)，而TNF-α組與miR-NC+TNF-α組各檢測(cè)指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3，表4。

圖3 TNF-α誘導(dǎo)的上調(diào)miR-20a-5p的MH7A細(xì)胞凋亡

表4 上調(diào)miR-20a-5p對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞增殖活性、凋亡和炎性因子表達(dá)的影響

2.5 miR-20a-5p靶向負(fù)調(diào)控TLR4 Starbase靶基因軟件預(yù)測(cè)顯示的miR-20a-5p與TLR4的結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimics與WT-TLR4的MH7A細(xì)胞熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染miR-NC與WT-TLR4的MH7A細(xì)胞，而共轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimics與MUT-TLR4的MH7A細(xì)胞熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染miR-NC與MUT-TLR4的MH7A細(xì)胞比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明TLR4是miR-20a-5p的靶基因。同時(shí)，轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimics的MH7A細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)明顯低于轉(zhuǎn)染miR-NC的MH7A細(xì)胞及對(duì)照組MH7A細(xì)胞(P<0.05)。見圖4，表5，6。

圖4 miR-20a-5p靶向調(diào)控TLR4;A miR-20a-5p與TLR4的結(jié)合位點(diǎn)；B miR-20a-5p與WT-TLR4共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒

表5 雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果

表6 上調(diào)miR-20a-5p對(duì)MH7A細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)的影響

2.6 下調(diào)miR-20a-5p降低羥基紅花黃色素A對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞增殖活性、凋亡及炎性因子表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染anti-miR-20a-5p 的MH7A細(xì)胞中miR-20a-5p表達(dá)明顯低于轉(zhuǎn)染anti-miR-NC的MH7A細(xì)胞(t=107.331，P<0.05)，表明下調(diào)miR-20a-5p表達(dá)的MH7A細(xì)胞構(gòu)建成功。與10 μmol/L H-HSYA+TNF-α組或anti-miR-NC+10 μmol/L H-HSYA+TNF-α組比較，anti-miR-20a-5p+10 μmol/L H-HSYA+TNF-α組MH7A細(xì)胞增殖活性降低，而凋亡率、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和IL-6表達(dá)及細(xì)胞中TLR4蛋白光素酶活性降低；C 上調(diào)miR-20a-5p抑制細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，而10 μmol/L H-HSYA+TNF-α組與anti-miR-NC+H-HSYA+TNF-α組各檢測(cè)指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5，表7。

圖5 下調(diào)miR-20a-5p降低HSYA對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞凋亡及TLR4蛋白表達(dá)的影響;A 下調(diào)miR-20a-5p降低HSYA對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞凋亡的影響；B 下調(diào)miR-20a-5p降低HSYA對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)的影響

表7 下調(diào)miR-20a-5p降低HSYA對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞增殖活性、凋亡及炎性因子表達(dá)的影響

3 討論

滑膜細(xì)胞在炎性因子的刺激下，增殖能力明顯增強(qiáng)，且釋放多種炎性因子，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[11]。TNF-α是一種促炎因子，可引起成纖維樣滑膜細(xì)胞炎性損傷，促進(jìn)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)展進(jìn)程[12]。MH7A細(xì)胞來自于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的成纖維樣滑膜細(xì)胞，增殖速度較快，且可多次傳代，是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎研究的常用細(xì)胞[2]。本研究利用TNF-α刺激MH7A細(xì)胞，結(jié)果顯示，MH7A細(xì)胞經(jīng)TNF-α刺激24 h后，細(xì)胞增殖活性降低，凋亡數(shù)及炎性因子IL-1β和IL-6的分泌水平增加，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果[13]一致，提示TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞損傷模型建立成功。

近年來，中藥或其活性成分在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療中廣受關(guān)注。作為中藥紅花的主要活性成分，羥基紅花黃色素A具有多種藥理活性。研究顯示，羥基紅花黃色素A可抑制心肌缺血再灌注損傷大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP等炎性因子的表達(dá)，對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠發(fā)揮保護(hù)作用[14]；羥基紅花黃色素A可能通過下調(diào)miR-1表達(dá)降低H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2活性氧(ROS)的生成和細(xì)胞凋亡率，減輕心肌細(xì)胞氧化損傷[15]。本研究將一定劑量的羥基紅花黃色素A作用于TNF-α誘導(dǎo)的成纖維樣滑膜細(xì)胞MH7A后，發(fā)現(xiàn)其可提高TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞增殖活性，減少細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性；進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，羥基紅花黃色素A可呈劑量依賴性抑制TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞分泌IL-1β和IL-6炎性因子，這提示羥基紅花黃色素A可減輕TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞炎性損傷，其可能具有治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在價(jià)值。

miRNA可通過調(diào)控靶基因的表達(dá)影響細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)等生理或病理過程，參與多種疾病的發(fā)展進(jìn)程[16]。研究顯示，miR-23、miR-650和miR-143-3p等多種參與調(diào)控滑膜細(xì)胞的增殖、凋亡及炎性反應(yīng)，是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的潛在分子靶點(diǎn)[17]。本研究首先檢測(cè)了TNF-α對(duì)MH7A細(xì)胞中miR-20a-5p表達(dá)的影響，TNF-α能夠抑制MH7A細(xì)胞中miR-20a-5p的表達(dá)，提示miR-20a-5p可能參與TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞損傷；通過轉(zhuǎn)染miR-20a-5p模擬物至MH7A細(xì)胞，再用TNF-α刺激上調(diào)miR-20a-5p的MH7A細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖活性增加，而凋亡數(shù)及炎性因子IL-1β和IL-6的分泌減少，這表明上調(diào)miR-20a-5p可抑制TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞凋亡及炎性損傷，miR-20a-5p有可能成為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的分子靶點(diǎn)。本研究結(jié)果還顯示，羥基紅花黃色素A可呈劑量依賴性促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞中miR-20a-5p的表達(dá)，而下調(diào)miR-20a-5p降低羥基紅花黃色素A對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞凋亡及IL-1β和IL-6炎性因子的表達(dá)，提示羥基紅花黃色素A可能通過上調(diào)miR-20a-5p表達(dá)來抑制TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞凋亡及IL-1β和IL-6炎性因子表達(dá)。

為了進(jìn)一步探究羥基紅花黃色素A通過上調(diào)miR-20a-5p抑制TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞凋亡及IL-1β和IL-6炎性因子表達(dá)的分子機(jī)制，本研究證實(shí)了TLR4是miR-20a-5p的靶基因，且上調(diào)miR-20a-5p可降低MH7A細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)，說明miR-20a-5p靶向負(fù)調(diào)控TLR4。TLR4與炎性反應(yīng)密切相關(guān)，其與相應(yīng)配體作用后，可啟動(dòng)核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路，調(diào)控炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄翻譯和表達(dá)，產(chǎn)生和釋放IL-6和IL-8等炎性因子，而這些炎性因子又可作用于TLR4等信號(hào)通路，進(jìn)一步加劇炎性反應(yīng)[18]。本研究結(jié)果顯示，羥基紅花黃色素A可抑制TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)，而下調(diào)miR-20a-5p則降低了羥基紅花黃色素A對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)的抑制作用，進(jìn)一步提示羥基紅花黃色素A可能通過上調(diào)miR-20a-5p進(jìn)而抑制TLR4的表達(dá)來減少TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞凋亡及炎性因子表達(dá)，發(fā)揮對(duì)MH7A細(xì)胞的保護(hù)作用。