佟利惠，楊 敏，趙 峰，蘇來金，王珊珊，周德慶

（1 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海 201306 2 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室 山東青島 266071 3 重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院 重慶 404100 4 溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 浙江省水環(huán)境與海洋生物資源保護重點實驗室 浙江溫州 325035 5 溫州市特色食品資源工程技術(shù)研究中心 浙江溫州 325006）

諾如病毒（Noroviruses，NoVs）是世界范圍內(nèi)引起非細菌性急性胃腸炎的主要病原體[1]，可分為7 個基因簇（GI～GVII），其中GI、GII 和GIV 可感染人類，GI、GII 又可進一步分為9 個和22 個基因型[1-3]。NoVs 具有極強的傳染性，被感染者表現(xiàn)為腹瀉或嘔吐，常通過被污染的環(huán)境、水源及水產(chǎn)品如貝類等引起急性胃腸炎疫情暴發(fā)[4-6]。冬、春季節(jié)是諾如病毒疫情的高發(fā)期，近幾年我國及美國、日本、西歐等許多國家都出現(xiàn)過大規(guī)模諾如病毒暴發(fā)的報道[7-10]。素有“海洋牛奶”之稱的牡蠣是沿海地區(qū)重要的經(jīng)濟貝類，也是NoVs 的傳播媒介之一。牡蠣的棲息地主要在沿海河口，營固著生活，更容易受到污水等環(huán)境污染[11]。牡蠣屬于濾食性雙殼貝類，可在過濾海水時富集環(huán)境中的NoVs，體內(nèi)病毒濃度可比周圍環(huán)境中的高幾十到幾千倍[3，12-13]。徹底的加熱處理雖可有效滅活牡蠣中存在的NoVs，但會破壞牡蠣的鮮美風(fēng)味，人們傾向于生食或輕微烹煮。若牡蠣中存在NoVs 污染，就會增加感染NoVs 的風(fēng)險。

目前，食品中NoVs 的檢測主要采用反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR），此方法針對NoVs 的核酸進行檢測，部分NoVs 失活后，核酸仍然存在，然而，該方法不能很好地區(qū)分NoVs 的存活狀態(tài)，也就無法區(qū)分NoVs 是否具有感染性。研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的光激活染料 【疊氮溴化丙錠 （Propidium monoazide，PMA）和疊氮溴化乙錠（Ethidium monoazide，EMA）】、改進的光激活染料 （PMA 增強版——PMAxx，同時包含PMA 和EMA 的雙光激活染料PEMAX）及豬胃黏蛋白磁珠（Porcine gastric mucin magnetic beads，PGM-MB） 常用于消減處理后感染性NoVs 存活率的檢測[14-18]?，F(xiàn)報道較多的為PMAxx 和PGM-MB。Ye 等[19]用PGM-MB 對經(jīng)500 MPa/0 ℃HHP 處理的牡蠣中的GⅡ.4 型NoVs 進行檢測，NoVs RNA 拷貝數(shù)可減少4 lg（copies/μL）。PGM 包含多種組織血型抗原，可與不同基因型別的NoVs 特異性結(jié)合，然而其在商業(yè)化生產(chǎn)中存在較大的變異性，造成重復(fù)性較差。PMAxx 是一種高親和力的光反應(yīng)性核酸染料，雖不能進入衣殼蛋白完整的NoVs，但能夠穿透被破壞或損壞的衣殼，在強光照射下共價插入RNA，干擾RT-PCR 擴增[17]。在RT-qPCR 檢測前，利用PMAxx 對樣品進行預(yù)處理，可用來區(qū)分感染性NoVs。

非熱加工技術(shù)可在保證食品安全（殺滅有害病原體） 的條件下實現(xiàn)最小程度地影響食品原有營養(yǎng)、風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)等，在水產(chǎn)品加工中應(yīng)用較多的有超高壓 （High hydrostatic pressure，HHP）、臭氧、輻照及紫外照射處理等[20-22]。超高壓技術(shù)可用于牡蠣等雙殼貝類的脫殼，使殼與肉分離，保持營養(yǎng)成分基本不變，還能有效殺滅有害病原體，延長貯藏期[23]。Takahashi 等[24]對緩沖液、牡蠣勻漿、帶殼牡蠣3 種基質(zhì)中的鼠諾如病毒（Murine norovirus strain 1，MNV-1）進行HHP 處理，結(jié)果表明：HHP 對這3 種基質(zhì)中的NoVs 都有消減效果，在緩沖液、牡蠣勻漿、帶殼牡蠣中的消減效果依次降低，表明HHP 對MNV-1 的消減滅活效果與基質(zhì)有關(guān)，這可能是由于牡蠣中的蛋白質(zhì)、脂肪等成分可以保護MNV-1 不受HHP 影響。因人源諾如病毒難以進行體外培養(yǎng)，故現(xiàn)有的HHP 研究多采用MNV 進行，且在研究HHP 對NoVs 的消減作用時，僅使用病毒稀釋液，未考慮食品基質(zhì)對病毒消減的影響。同時，受RT-qPCR 的限制，無法區(qū)分NoVs 的感染性。

本文以PMAxx 檢測同RT-qPCR 相結(jié)合，評價該方法區(qū)分感染性NoVs 的效果；對牡蠣消化腺勻漿和緩沖液中GⅡ.4 型NoVs 在不同壓力下進行HHP 處理的效果，評估食品基質(zhì)對NoVs 耐受HHP 處理的影響，探究HHP 處理對GⅡ.4 型NoVs 的消減控制效果以及對牡蠣脂肪氧化和蛋白質(zhì)變性的影響，以期為HHP 技術(shù)在牡蠣加工中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

太平洋牡蠣（Crassostrea gigas），山東威海乳山市牡蠣養(yǎng)殖區(qū)；GⅡ.4 NoVs 樣品（經(jīng)測定GⅡ.4 NoVs RNA 拷貝數(shù)為5.0×108copies/μL），分離自腹瀉患者。

1.2 主要試劑

氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、25%戊二醛溶液、Triton X-100，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Trizol、病毒RNA 提取試劑盒，Evo M-MLV 一步法RT-qPCR 試劑盒，艾科瑞生物；PMAxx，美國Biotium 公司；丙二醛含量測定試劑盒、巰基含量測定試劑盒，北京索萊寶公司；RT-qPCR 所用引物如下：QNIF2 （FW）：ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA，COG2R （ REV ） ：TCGACGC CATCTTCATTCACA，QNIFs （PROBE）：FAMAGCACGTGGGAGGGCGAT CG-TAMRA，由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成；質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，博尚生物技術(shù)有限公司。

1.3 設(shè)備與儀器

BY-600-1 全自動高壓殺菌機，溫州濱一機械有限公司；JEM-1200EX 透射電子顯微鏡，日本電子株式會社；BYQ6094-550148 熒光定量PCR 儀，杭州博日科技有限公司；酶標(biāo)儀，Thermo 公司；H1650-W 高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；GR60DA 壓力蒸汽滅菌器，ZEALWAY公司；HH-4A 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；32990927 電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；F013300046 手持均質(zhì)機，DREMEL公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 PMAxx-RT-qPCR 檢測方法評價

1.4.1.1 熱處理 為了評價PMAxx-RT-qPCR 檢測方法區(qū)分NoVs 感染性的效果，取2 mL 1 000×稀釋的GⅡ.4 型NoVs 樣品，分別在沸水浴中加熱5，10，15，30 min 和濕熱滅菌（121 ℃，20 min）條件下處理，隨后均用PMAxx 處理。

1.4.1.2 PMAxx 處理 取400 μL 樣品于1.5 mL離心管中，設(shè)置平行組，對照組不做PMAxx 處理。避光操作，加入0.1 mmol/L PMAxx，使其在樣品中的終濃度為25 μmol/L，加入0.5% Triton X-100，在黑暗中室溫孵育10 min，在搖床上進行孵化，試管上覆蓋鋁箔[14]。立即將樣品暴露在60 W 藍光燈下，使PMAxx 與樣品反應(yīng)20 min，5 000×g 離心10 min，取上清用于后續(xù)RNA 提取。

1.4.1.3 RNA 的提取 按照RNA 提取試劑盒說明，對所有病毒樣品進行RNA 提取。

1.4.1.4 熒光定量RT-PCR 熒光定量RT-PCR反應(yīng)液采用50 μL 體系：25 μL 2×One Step RTqPCR 緩沖液，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，0.8 μL 探針，1 μL DNA 聚合酶，1 μL 逆轉(zhuǎn)錄酶，1 μL RNA 模板，并用無RNA 酶水補足至50 μL。熒光定量RT-PCR 反應(yīng)條件：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42 ℃、5 min，1 個循環(huán)；95 ℃、30 s，1 個循環(huán)。PCR 反應(yīng)95℃、5 s，60 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)。

1.4.1.5 NoVs 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線 利用NovoPro DNA 分子計量程序和公式（1）計算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)[25]。

式中，6.02×1014——阿伏伽德羅常數(shù)換算系數(shù)；質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為100 ng/μL。

1.4.2 牡蠣樣品前處理 牡蠣購買后置于過濾處理的海水中暫養(yǎng)，采用紫外殺菌內(nèi)循環(huán)裝置對養(yǎng)殖海水進行滅菌處理。隨機選取5 只牡蠣，經(jīng)RTqPCR 檢測無NoVs 后用于試驗。選取有活力的牡蠣，用無菌蒸餾水沖洗，吸水紙擦干表面水分，開殼后使用醫(yī)用手術(shù)刀切斷閉殼肌，去掉外殼，取出貝肉，在無菌環(huán)境取牡蠣消化腺部位，備用。

1.4.3 超高壓處理NoVs 樣品稀釋 每個試驗組設(shè)置3 組平行和對照組，所有樣品均置于冰上保存。

1.4.3.1 牡蠣消化腺勻漿 取50 g 牡蠣消化腺組織，用手持勻漿機進行勻漿處理，吸取2 mL 勻漿液于滅菌真空包裝袋內(nèi)，真空袋內(nèi)加入20 μL 用0.01 mol/L PBS 緩沖液稀釋的GⅡ.4 型NoVs 樣品，搖晃使其充分混勻，用封口機封口，GⅡ.4 型NoVs 終濃度為5.0×105copies/μL。

1.4.3.2 NoVs 稀釋液 吸取20 μL 用0.01 mol/L PBS 緩沖液稀釋的GⅡ.4 型NoVs 樣品于滅菌真空包裝袋內(nèi)，加入2 mL 0.01 mol/L PBS 緩沖液，用封口機封口。

1.4.3.3 透射電鏡樣品 吸取20 μL 未經(jīng)稀釋的GⅡ.4 型NoVs 樣品于滅菌真空包裝袋內(nèi)，用封口機封口。

1.4.4 超高壓處理 將封裝好的樣品置于HHP設(shè)備腔體中，控制加壓初始溫度為5 ℃左右，壓力大小分別設(shè)定為200，300，400，500 MPa，保壓時間設(shè)定為5 min。HPP 處理后按照1.4.1 節(jié)中的方法檢測。

1.4.5 透射電子顯微鏡觀察NoVs 形態(tài) 用2.5%戊二醛溶液對病毒樣品進行固定，將病毒樣品滴到蠟板上，把銅網(wǎng)有支持膜的一面與病毒液滴接觸，夾起后用濾紙輕輕將銅網(wǎng)邊緣多余液體吸干，滴加一滴1%磷鎢酸負染色3 min，濾紙吸干多余染液，室溫干燥30 min 后上機觀察。

1.4.6 丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量測定 稱取約0.1 g 牡蠣組織，加入1 mL 提取液進行冰浴勻漿；8 000 ×g、4 ℃離心10 min，取上清，置冰上待測。按照試劑盒說明方法配制樣品混合液，100 ℃水浴中保溫60 min，置于冰浴中冷卻，10 000×g，常溫，離心10 min。吸取200 μL 上清液于96 孔板中，測定個樣本在450，532 nm 和600 nm 處的吸光度。分別按△A450nm＝A450nm測定-A450nm空白，△A532nm＝A532nm測定-A532nm空白，△A600nm＝A600nm測定-A600nm空白進行計算。

1.4.7 蛋白質(zhì)巰基含量測定 參照索萊寶巰基含量測定試劑盒說明中的方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 GII.4 型NoVs 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

在NoVs 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為102～109copies/μL 范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，y=-3.0171x +41.109，G Ⅱ.4 型NoVs 樣本的濃度為5.0×108copies/μL。

2.2 PMAxx 區(qū)分感染性NoVs 效果評價

為了探究PMAxx 是否能有效區(qū)分感染性和非感染性NoVs，本試驗采用1 000×稀釋的GⅡ.4型NoVs（病毒濃度為5.0×105copies/μL），分別進行沸水加熱5，10，15，30 min 和濕熱滅菌（121 ℃，20 min）處理，而后分別使用PMAxx-RT-qPCR 和傳統(tǒng)RT-qPCR 方法進行檢測。結(jié)果顯示，不同加熱條件處理后，使用PMAxx-RT-qPCR 的定量值均低于傳統(tǒng)RT-PCR 方法，使用PMAxx-RTqPCR 在沸水加熱15，30 min 和濕熱滅菌條件下均未檢出NoVs，而傳統(tǒng)RT-qPCR 則均有檢出。由于熱處理對NoVs 有殺滅效果，在煮沸條件下加熱超過15 min NoVs 即可完全失活死亡，不具有感染性，因此傳統(tǒng)RT-PCR 具有假陽性的問題。上述結(jié)果表明，PMAxx-RT-qPCR 與傳統(tǒng)RT-qPCR 相比，可有效檢測出感染性NoVs，PMAxx-RT-qPCR方法可用于后續(xù)超高壓消減NoVs 試驗中感染性NoVs 的檢測。

圖1 GII.4 型NoVs 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of fluorescence quantitative of GII.4 NoVs

圖2 不同滅活方式下PMAxx-RT-qPCR區(qū)分感染性NoVs 效果評價Fig.2 The evaluation of PMAxx-RT-qPCR for distinguishing infectious NoVs under different inactivation methods

2.3 不同壓力水平超高壓處理對GⅡ.4 型NoVs的影響

由表1可知，對照組牡蠣消化腺勻漿和PBS緩沖液中的NoVs 濃度分別為9.18×104copies/μL和4.10×105copies/μL。經(jīng)HHP 處理5 min 后，牡蠣消化腺勻漿和緩沖液中的GⅡ.4 型NoVs 濃度均顯著降低（P<0.05）；NoVs 減少量隨著壓力水平的提高而增大。與未處理組相比，PMAxx 處理后牡蠣消化腺勻漿和緩沖液中的可檢出的感染性GⅡ.4型NoVs 濃度均減少。400 MPa HHP 處理下緩沖液中的GⅡ.4 型NoVs 濃度降低到檢測限（102copies/μL）以下，經(jīng)過500 MPa HHP 處理后，牡蠣消化腺勻漿和緩沖液中的GⅡ.4 型NoVs 減少量分別超過2.96 lg （copies/μL） 和3.61 lg（copies/μL），牡蠣消化腺勻漿和緩沖液中的GⅡ.4 型NoVs 濃度均降至可檢測水平限以下。結(jié)果表明HHP 處理可有效消減牡蠣消化腺勻漿和緩沖液中的GⅡ.4 型NoVs。

表1 不同HHP 對GⅡ.4 型NoVs 的消減效果Table 1 The inactivation effect of GⅡ.4 NoVs under different HHP

在200～500 MPa 的HHP 處理下，緩沖液中的NoVs 消減效果優(yōu)于牡蠣消化腺勻漿中。Ye 等[26]研究發(fā)現(xiàn)于6 ℃/500 MPa/5 min 條件下處理的牡蠣勻漿上層清液以及6 ℃/600 MPa/5 min 條件下處理的牡蠣勻漿中的NoVs 濃度均可達到檢測限水平以下[19]，與本文的結(jié)果類似。通過比較2 種基質(zhì)中NoVs 拷貝數(shù)減少量的差異，可以看出HHP 處理對緩沖液中NoVs 的消減效果比牡蠣消化腺勻漿中的效果好，這可能是因為HHP 處理的效果與食品基質(zhì)等環(huán)境條件密切相關(guān)，牡蠣勻漿中含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)，在HHP 處理過程中，這些物質(zhì)會對NoVs 形成保護作用，保護病毒顆粒不受壓力影響，從而降低HHP 處理效果。

在200 MPa HHP 條件下處理5 min 后，與未經(jīng)HHP 處理的樣品相比，牡蠣消化腺勻漿中的NoVs 濃度可減少1.30 lg（copies/μL）；緩沖液中的NoVs 濃度可減少1.68 lg（copies/μL），此壓力水平和保壓時間下可以實現(xiàn)牡蠣的部分脫殼。研究表明300 MPa HHP 處理下保壓1 min，牡蠣脫殼效果最好[27]，而此試驗結(jié)果顯示，300 MPa HHP 下牡蠣中的NoVs 也有顯著減少，因此，HHP 技術(shù)解決了牡蠣加工中的兩大難題，在脫殼的同時又可有效消減體內(nèi)的病毒。

2.4 不同HPP 壓力處理后GII.4 型NoVs 的透射電鏡觀察

為了探究HHP 處理對NoVs 形態(tài)產(chǎn)生的影響，采用透射電子顯微鏡 （Transmission electron microscope，TEM）觀察HHP 處理后NoVs 形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生的改變。結(jié)果顯示，與未經(jīng)HHP 處理的GⅡ.4 型NoVs 相比，在200～500 MPa HHP 下處理的GⅡ.4 型NoVs 的邊界模糊不清或形狀改變，不再呈現(xiàn)一個飽滿完整的球形，表明HHP 對NoVs 造成了很大的損害，破壞了病毒衣殼蛋白。由圖3看出，GⅡ.4 型NoVs 經(jīng)HHP 處理后數(shù)量明顯減少，這與表1結(jié)果吻合，NoVs 的消減效果與壓力水平大小呈正相關(guān)；超高壓的作用主要是破壞病毒衣殼和受體結(jié)合活性，使得蛋白質(zhì)擠壓變形，暴露出病毒RNA，促使病毒發(fā)生降解[28-29]。圖3f 為65 ℃加熱4 min 處理的NoVs，處理后部分NoVs 出現(xiàn)降解，但大部分NoVs 顆粒仍可保持衣殼蛋白完整，說明65 ℃加熱4 min 對NoVs 的消減效果并不顯著。

圖3 GⅡ.4 型NoVs 透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscope image of GⅡ.4 NoVs

2.5 HHP 處理對牡蠣中脂肪和蛋白質(zhì)的影響

牡蠣肉中的富含多不飽和脂肪酸，容易發(fā)生氧化反應(yīng)。圖4a 和4b 分別為HHP 對牡蠣脂肪和蛋白質(zhì)的影響，可以看出HHP 處理后MDA 含量顯著增大（P<0.05），且隨著壓力水平的增大，脂肪氧化的程度也在增大，這可能是因為牡蠣中鐵和銅含量較多，壓力可以促進游離金屬離子鐵和銅的釋放，這些離子會促進脂肪的氧化反應(yīng)。加熱處理組比HHP 處理組MDA 值的變化幅度更大，這是因為高溫使脂肪發(fā)生了很大程度的氧化和聚合。

二硫鍵是維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)及天然構(gòu)象重要的共價鍵，斷裂會形成巰基，蛋白質(zhì)巰基含量可以反映蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化情況。由圖可知，HHP 和加熱處理下，牡蠣蛋白巰基含量均隨處理壓力和加熱時間的增大而增加，HHP 處理組的牡蠣蛋白巰基含量的增幅整體小于加熱處理組。HHP 處理組300～400 MPa 下，巰基含量基本不變，說明處理壓力大于300 MPa 后，牡蠣蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵開始斷裂產(chǎn)生大量的巰基。

蒸、煮超過15 min，牡蠣中的NoVs 才能得到有效的消減。在HPP 處理下，500 MPa 處理5 min即可使牡蠣中的NoVs 消減到無法檢出的水平，在保證NoVs 消減效果的前提下，與加熱處理相比，HHP 處理雖使牡蠣發(fā)生脂肪氧化和蛋白質(zhì)變性，在一定程度上降低了牡蠣品質(zhì)，但對脂肪和蛋白質(zhì)的負面影響仍遠優(yōu)于加熱處理 （如圖4c，d 所示）。

圖4 超高壓和加熱處理對脂肪和蛋白質(zhì)的影響Fig.4 Effects of HHP and heating treatments on fat and protein

3 結(jié)論

超高壓處理對牡蠣消化腺勻漿和緩沖液中的GⅡ.4 型NoVs 的消減控制效果與壓力水平的大小呈正相關(guān)。當(dāng)壓力為500 MPa 時，兩種基質(zhì)中NoVs 含量均可降至檢測限以下。牡蠣消化腺勻漿中的蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)在超高壓處理對NoVs具有一定的保護作用。超高壓處理雖會使牡蠣脂肪的氧化和蛋白質(zhì)變性，但影響程度遠小于加熱處理。500 MPa/5 ℃HHP 處理5 min 可將牡蠣中NoVs 消減到無法檢出的水平。