孟 立 戎偉芳

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 200025）

痛覺(jué)信息傳遞和阿片類藥物鎮(zhèn)痛存在明顯的性別差異，女性對(duì)某些以疼痛為主要癥狀的疾病較男性更易感[1-2]。雌激素被認(rèn)為可能參與痛覺(jué)的調(diào)控，但具體機(jī)制不清楚。G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（G protein-coupled estrogen receptor，GPER）能夠介導(dǎo)雌激素的快速非基因組效應(yīng)[3-4]，有研究表明其在痛覺(jué)傳導(dǎo)通路中發(fā)揮作用[5-7]。延髓頭端腹內(nèi)側(cè)區(qū)（rostral ventromedial medulla， RVM）由中縫大核（nucleus raphe magnus， NRM）、網(wǎng)狀巨細(xì)胞核（nucleus reticularis gigantocellularis， Gi）及鄰近的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成[8-9]，在痛覺(jué)的下行調(diào)控和阿片類藥物鎮(zhèn)痛中起重要作用[10-11]，但其神經(jīng)元構(gòu)成和局部環(huán)路尚不清楚。本研究對(duì)大鼠的RVM區(qū)域GPER和5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）能神經(jīng)元標(biāo)志物色氨酸羥化酶（tryptophan hydroxylase，TPH）、兒茶酚胺能神經(jīng)元標(biāo)志物酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase， TH）、神經(jīng)元型一氧化氮合 酶（neuronal nitric oxide synthase， nNOS）、膽堿能神經(jīng)元標(biāo)志物膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（choline acetyltransferase， ChAT）以及腦啡肽（enkephalin，ENK）進(jìn)行雙重免疫組織化學(xué)顯色，旨在探究GPER在RVM的表達(dá)特征以及與上述多種神經(jīng)元的共定位關(guān)系，從而了解雌激素影響痛覺(jué)下行調(diào)控通路和阿片鎮(zhèn)痛效應(yīng)可能的結(jié)構(gòu)和分子基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡雄性SD大鼠，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)保持25°C恒溫，光照時(shí)間為早8∶00點(diǎn)至晚8∶00點(diǎn)，通風(fēng)良好，水食充足。實(shí)驗(yàn)操作均符合上海交通大學(xué)動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑

兔 源GRER抗 體（LifeSpan BioSciences Inc.，LS-A4272）；山羊源ChAT抗體（Millipore， AB144P）；鼠源Enkephalin抗體（Abcam， ab150346）；山羊源nNOS抗體（Abcam， ab1376）；鼠源TH抗體（Immunostar，22941）；鼠源TPH抗體（Sigma， T0678）；驢抗兔Alexa 488（Invitrogen， A21206）；驢抗羊Alexa 568（Invitrogen，A11057）；羊抗兔 Alexa 568（Invitrogen， A11036）；羊抗 鼠Alexa 488（Invitrogen， A11029）；羊抗鼠Alexa 568（Invitrogen， A11031）；羊抗兔 Alexa 488（Invitrogen，A11034）。

1.3 免疫熒光組織化學(xué)顯色檢測(cè)RVM內(nèi)GPER與多種神經(jīng)元的共定位關(guān)系

以60 mg/kg的劑量腹腔注射戊巴比妥麻醉大鼠，將動(dòng)物固定在解剖板上，剪開(kāi)胸腔暴露心，將連接灌流泵的注射針頭從心尖刺入，灌注生理鹽水的同時(shí)剪開(kāi)右心耳。血液沖洗干凈后，灌注預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液。灌流結(jié)束后，取出腦組織，置于4%多聚甲醛溶液中后固定過(guò)夜。更換預(yù)冷的30%蔗糖，放置于4°C使組織脫水，當(dāng)組織沉底后取出組織，切除大腦和小腦等多余組織，水平放置在盛有OCT的方形包埋盒中，放入干冰速凍，-80℃保存。常規(guī)冰凍切片，厚度30 μm。24孔板中加入預(yù)冷的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS），將切下的腦片依次放入孔內(nèi)，每孔6片。從RVM核心位置挑選腦片行常規(guī)免疫熒光組織化學(xué)顯色。加入封閉液（0.05 mol/L PBS+10% 羊血清/驢血清+1%Triton X-100），每孔400 μL，放置在搖床上慢搖，室溫1 h。棄封閉液，加入含有相應(yīng)濃度的一抗抗體稀釋液（表 1），每孔300 μL，放置在搖床上慢搖，室溫孵育2 h后置于4°C過(guò)夜。加入相應(yīng)的二抗和DAPI（1∶1 000）稀釋液，放置在搖床上避光慢搖2 h。將每孔組織切片轉(zhuǎn)移到盛有ddH2O的6 cm培養(yǎng)皿中，用毛刷將切片鋪展在載玻片上。待腦片晾干后，加適量封片劑，蓋上蓋玻片，使用熒光顯微鏡拍片或放入4°C冰箱暫存。

表1 一抗的稀釋比及對(duì)應(yīng)的二抗

2 結(jié)果

2.1 RVM腦區(qū)GPER與TPH無(wú)共定位

本課題組前期研究了RVM內(nèi)GPER與5-HT的共定位關(guān)系，顯示RVM內(nèi)有豐富的5-HT和GPER免疫活性，而5-HT陽(yáng)性神經(jīng)元不表達(dá)GPER。GPER與TPH雙標(biāo)記免疫熒光顯色結(jié)果顯示，GPER-ir和TPH-ir神經(jīng)元在NRM內(nèi)大量存在，兩者交錯(cuò)分布（圖1A～C，見(jiàn)封二），高倍鏡下可見(jiàn)在GPER-ir胞體周圍存在TPH-ir纖維（圖1D～F，見(jiàn)封二），說(shuō)明GPER-ir神經(jīng)元與5-HT能神經(jīng)元是2個(gè)獨(dú)立的神經(jīng)元亞群，但兩者之間可能存在突觸聯(lián)系。

圖1 RVM腦區(qū)GPER免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元不表達(dá)TPH。A～C：大鼠RVM腦區(qū)GPER與TPH免疫熒光共顯色代表圖，標(biāo)尺=40 μm；D～F：大鼠RVM腦區(qū)GPER與TPH免疫熒光共顯色代表圖，標(biāo)尺=20 μm。紅色熒光：GPER；綠色熒光：TPH；藍(lán)色熒光：DAPI.

2.2 RVM腦區(qū)GPER與ChAT沒(méi)有共表達(dá)

膽堿能神經(jīng)元在腦干有大量分布，這些神經(jīng)元向其他腦區(qū)發(fā)出投射纖維，組成腦干膽堿能系統(tǒng)。大鼠的RVM腦區(qū)組織GPER和ChAT免疫熒光顯色結(jié)果顯示，ChAT在RVM的核心區(qū)域NRM沒(méi)有明顯的陽(yáng)性表達(dá)（圖2A～C，見(jiàn)封二），ChATir神經(jīng)元主要分布在外側(cè)巨細(xì)胞旁核（nucleus paragigantocellularis lateralis， LPGi）（圖2D～F，見(jiàn)封二），與GPER沒(méi)有共定位。

圖2 RVM腦區(qū)ChAT與GPER無(wú)共表達(dá)。A～C：WT大鼠NRM腦區(qū)GPER與ChAT免疫熒光共顯色代表圖，標(biāo)尺=40 μm；D～F：WT大鼠PGi腦區(qū)GPER與ChAT免疫熒光共顯色代表圖，標(biāo)尺=40 μm。綠色熒光：GPER；紅色熒光：ChAT；藍(lán)色熒光：DAPI.

2.3 RVM腦區(qū)絕大多數(shù)GPER免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元不表達(dá)nNOS免疫活性

nNOS是一氧化氮合酶的一個(gè)亞型，能在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生NO。NO是一種氣態(tài)遞質(zhì)，通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)受體結(jié)合觸發(fā)多種信號(hào)通路。大鼠RVM腦區(qū)組織GPER和nNOS雙重免疫熒光顯色結(jié)果顯示，nNOS-ir神經(jīng)元主要分布在RVM偏上方的Giα區(qū)域，而GPER-ir則主要位于NRM區(qū)域。GPER免疫反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性神經(jīng)元不表達(dá)nNOS-ir，但少量GPER免疫反應(yīng)弱陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)nNOS-ir（圖3A～G，見(jiàn)封二）。

圖3 RVM腦區(qū)多數(shù)GPER免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元不表達(dá)nNOS免疫活性。A～C：大鼠RVM腦區(qū)GPER與nNOS免疫熒光共顯色代表圖，標(biāo)尺=40 μm。D～F：圖C中虛線框內(nèi)區(qū)域放大圖，紅色熒光：nNOS； 綠色熒光：GPER；藍(lán)色熒光：DAPI；D：大鼠RVM腦區(qū)GPER-ir神經(jīng)元與nNOS-ir神經(jīng)元分布模式圖；綠色：GPER，紅色：nNOS，黃色：GPER/nNOS。圖中箭頭所指為GPER免疫反應(yīng)弱陽(yáng)性神經(jīng)元共表達(dá)nNOS免疫活性.

2.4 GPER與TH在PGi有少量共表達(dá)

為明確GPER-ir神經(jīng)元是否可能釋放兒茶酚胺類遞質(zhì)，利用免疫熒光方法檢測(cè)RVM腦區(qū)GPER與TH的共表達(dá)情況。結(jié)果顯示，RVM核心區(qū)NRM內(nèi)未見(jiàn)TH-ir神經(jīng)元分布，但可見(jiàn)少量TH-ir纖維（圖4A～C，見(jiàn)封二）。TH免疫活性多表達(dá)在LPGi區(qū)域（圖4D～F，見(jiàn)封二），僅在少數(shù)TH-ir神經(jīng)元檢測(cè)到較弱的GPER免疫活性（圖4G～4I，見(jiàn)封二）。

圖4 GPER與TH在LPGi有少量共表達(dá)。A～C：大鼠NRM腦區(qū)GPER與TH免疫熒光共顯色代表圖，標(biāo)尺=40 μm；D～F：WT大鼠LPGi腦區(qū)GPER與TH免疫熒光共顯色代表圖，標(biāo)尺=40 μm；G～I(xiàn)： 圖F中虛線框內(nèi)區(qū)域放大圖，標(biāo)尺=20 μm；紅色熒光：TH；綠色熒光：GPER；藍(lán)色熒光：DAPI。圖中箭頭所指為GPER免疫反應(yīng)弱陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)TH免疫活性.

2.5 RVM腦區(qū)GPER陽(yáng)性神經(jīng)元周圍有大量ENK陽(yáng)性纖維分布

ENK是一種內(nèi)源性阿片肽，在疼痛調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要功能。對(duì)ENK與GPER的免疫熒光顯色結(jié)果顯示， RVM內(nèi)有密集的ENK免疫反應(yīng)（ENK-ir）陽(yáng)性纖維，一些ENK-ir纖維緊鄰GPER-ir神經(jīng)元胞體周圍（圖5A～C，見(jiàn)封二），這提示兩者之間可能存在功能上的聯(lián)系。在RVM內(nèi)未觀察到ENK免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元胞體，這可能是因?yàn)殡念愇镔|(zhì)在胞體內(nèi)合成后通過(guò)軸漿運(yùn)輸?shù)侥┥裔尫?，使得胞體內(nèi)ENK的濃度不足以呈現(xiàn)免疫反應(yīng)陽(yáng)性形態(tài)。

圖5 RVM腦區(qū)GPER免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元不表達(dá)ENK免疫活性，標(biāo)尺=10 μm。A～C：WT大鼠RVM腦區(qū)GPER與ENK免疫熒光共顯色代表圖； 綠色熒光：ENK；紅色熒光：GPER；藍(lán)色熒光：DAPI.

3 討論

腦干下行痛覺(jué)調(diào)控通路對(duì)脊髓背角的感覺(jué)信息傳遞發(fā)揮強(qiáng)大的下行調(diào)節(jié)作用。RVM作為下行調(diào)節(jié)通路中最后一個(gè)功能性核團(tuán)[12]，在痛覺(jué)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。RVM腦區(qū)內(nèi)ON細(xì)胞響應(yīng)傷害刺激表現(xiàn)出放電增強(qiáng)，OFF細(xì)胞表現(xiàn)放電減少[13]，分別促進(jìn)和抑制傷害性信息傳遞[14]，但目前仍缺乏直接證據(jù)。

雌激素參與生殖、神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫等系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，與腫瘤、認(rèn)知功能障礙等多種疾病的發(fā)展密切相關(guān)[15-16]。然而，無(wú)論是在生理還是病理?xiàng)l件下，雌激素隨周期變化的特性使得對(duì)其疼痛調(diào)節(jié)作用潛在機(jī)制的研究更加困難。RVM內(nèi)表達(dá)芳香化酶，可以局部合成雌激素[17]。課題組前期工作表明，GPER-ir神經(jīng)元在RVM大量存在，同時(shí)表達(dá)GABA能神經(jīng)元標(biāo)志物GAD67和μ型阿片受體，在在體電生理實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出ON細(xì)胞的電活動(dòng)特征。

5-HT能神經(jīng)元主要在NRM中分布，其向脊髓的投射是脊髓內(nèi)5-HT神經(jīng)末梢的主要來(lái)源。研究表明，鞘內(nèi)注射5-HT可產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛作用[18]，而選擇性激活5-HT神經(jīng)元可誘導(dǎo)持續(xù)疼痛敏化[19]，表明RVM內(nèi)5-HT系統(tǒng)對(duì)疼痛的調(diào)節(jié)十分復(fù)雜。本研究結(jié)果顯示，GPER-ir神經(jīng)元與5-HT能神經(jīng)元交錯(cuò)分布，5-HT能纖維在GPER-ir神經(jīng)元胞體附近分布。推測(cè)GPER-ir神經(jīng)元與5-HT能神經(jīng)元之間存在相互作用，影響脊髓內(nèi)5-HT的釋放，以及GPER-ir神經(jīng)元的活動(dòng)。

膽堿能神經(jīng)元在RVM中主要分布在巨細(xì)胞旁核（PGi），與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[20]，可介導(dǎo)抗傷害感受作用[21]。NO通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)受體結(jié)合觸發(fā)多種信號(hào)通路參與神經(jīng)系統(tǒng)的重要功能[22]。nNOS在抗傷害感受中發(fā)揮重要作用[23]。RVM中有豐富神經(jīng)元表達(dá)nNOS[24]。本研究結(jié)果顯示GPER的表達(dá)有強(qiáng)陽(yáng)性和弱陽(yáng)性，這可能是由抗體的非特異性引起，不能排除極少的弱陽(yáng)性GPER與nNOS、TH共表達(dá)，而RVM向脊髓的投射幾乎沒(méi)有nNOS陽(yáng)性和TH陽(yáng)性神經(jīng)元[24]，提示可能存在少量GPER陽(yáng)性神經(jīng)元在局部發(fā)揮作用。

ENK-ir神經(jīng)元在延髓腹側(cè)和腹外側(cè)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中有大量分布，并且部分向脊髓投射[25]。RVM內(nèi) GABA和ENK雙重陽(yáng)性的神經(jīng)元可能符合OFF細(xì)胞的特征，在下行調(diào)控中發(fā)揮抑制作用[26]。本研究結(jié)果顯示RVM區(qū)域內(nèi)有大量ENK-ir纖維分布，一些ENK-ir纖維緊鄰GPER-ir神經(jīng)元胞體，提示GABA和ENK雙重陽(yáng)性的神經(jīng)元可能通過(guò)局部釋放ENK作用于GPER-ir神經(jīng)元上的阿片受體，抑制GPER-ir神經(jīng)元的活動(dòng)從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

綜上所述，RVM內(nèi)GPER特異性表達(dá)在非5-HT能神經(jīng)元，5-HT能纖維以及ENK-ir纖維在GPER免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元鄰近分布，提示可能有突觸聯(lián)系的存在。筆者將進(jìn)一步采用電生理方法來(lái)探究其功能聯(lián)系，為研究雌激素調(diào)節(jié)痛覺(jué)和阿片鎮(zhèn)痛效應(yīng)的結(jié)構(gòu)和分子基礎(chǔ)提供新思路。