張麗虹 趙小貞 王 瑋

（福建醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)系，臨床應(yīng)用解剖學(xué)研究室，腦老化與神經(jīng)變性疾病福建省高校重點實驗室，福州 350122）

精索靜脈曲張（varicocele，VC）是男性生殖系統(tǒng)中常見的疾病之一[1-6]。VC的病理學(xué)機制以及造成男性不育的機制包括由于血液循環(huán)受阻造成的睪丸高溫、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂、血-睪屏障（blood-testis barrier，BTB）損傷等[7-9]。巴戟天為茜草科藤狀灌木的根（拉丁名為Morinda officinalis F.C.How），中醫(yī)認(rèn)為巴戟天具有壯陽補腎、固精安神、強筋壯骨的功效[10]，巴戟天多糖（Morinda officinalis polysaccharide，MOP）是巴戟天中主要的生物活性成分之一，含量為11%～35%[11-12]。本課題組前期研究表明MOP能夠修復(fù)損傷的生精上皮和BTB，減少生殖細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)紊亂的激素水平趨于正常，減少血清抗精子抗體水平等[13-15]，但具體機制尚未明確。蛋白質(zhì)組指由一個基因組、一個細(xì)胞或組織、一種生物體所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)的總稱[16-17]。本研究將300 mg/kg MOP用于VC大鼠的治療，采用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（Tandem Mass Tag，TMT）分析法對左側(cè)睪丸組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，旨在從蛋白質(zhì)組水平闡述VC的致病機制以及MOP修復(fù)作用的機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

蛋白酶抑制劑（康成生物公司）； 三（2-羧乙基）膦（Sigma-Aldrich公司）；碘乙酰胺（Sigma-Aldrich公司）；三乙胺碳酸氫鹽（Sigma-Aldrich公司）；無水乙腈（Sigma-Aldrich公司）；C18液相色譜柱（Sigma-Aldrich公司）；羥胺（Sigma-Aldrich公司）；甲酸（Sigma-Aldrich公司）；Trypsin/Lys-C Mix（Promega公司）；脫氧膽酸鈉（生工生物工程公司）；乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P-40，生工生物工程公司）；Dextran（Sigma-Aldrich公司）。

1.2 MOP提取和化學(xué)指紋圖譜分析

1.2.1 MOP提取 巴戟天粉末200 g，用3倍量的95%乙醇沸水浴回流提取2 h，共3次，除去巴戟天藥材中的脂溶性成分以及寡糖；藥渣自然揮發(fā)至無醇味，用6倍量的雙蒸水沸水浴提取2 h，共3次；合并藥液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對巴戟天水提物進(jìn)行濃縮，至比重達(dá)到1.2 g/mL；加入無水乙醇，使乙醇含量達(dá)到60%，4℃過夜，收集沉淀，得到巴戟天粗糖；加等量水溶解，加入1/3體積的sevag試劑（氯仿∶正丁醇=1∶4），置于分液漏斗中，振搖，靜置分層1 h，除去下層氯仿和中間層變性蛋白質(zhì)，共3次，得脫蛋白的巴戟天總多糖；pH值調(diào)至9.0，采用30% H2O260℃除色30 min；加入無水乙醇，使乙醇含量達(dá)到60%，4℃過夜，收集沉淀；依次以無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀，烘箱干燥，得到MOP粉末，采用蒽酮硫酸法測定產(chǎn)物中多糖含量。

1.2.2 紅外光譜測定 取干燥MOP粉末1 mg，與適量干燥KBr粉末混合后在研缽中研磨至極細(xì)，經(jīng)壓片后測定紅外光譜。

1.2.3 高效凝膠柱法測定MOP分子量范圍 采用UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mm凝膠柱，流動相為0.1 mol/L硝酸鈉溶液，流速為0.8 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣20 μL；標(biāo)樣為已知分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品Dextran，分子量分別為2 000 000、133 800、36 800、9 700、2 700、180 Mw，檢測器為Waters 1525高效液相色譜儀（配2410示差折光檢測器和Empower工作站）。將已知分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品和MOP粉末分別用流動相配制成1.0 mg/mL的溶液，進(jìn)樣量為20 μL，記錄色譜圖。用Breeze GPC軟件以標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖分子量的對數(shù)（logMw）對洗脫時間（T）進(jìn)行回歸處理，最終得到的標(biāo)注曲線方程為logMw=13.5-0.51T，R2=0.99815。根據(jù)MOP的保留時間，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖分子量。

1.3 實驗動物與分組

18只健康雄性SD大鼠（200±20）g，購買和飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，將其隨機分為假手術(shù)組、VC模型組、VC+MOP給藥組，每組6只。假手術(shù)組：打開腹腔，暴露左腎靜脈，但不進(jìn)行結(jié)扎，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)12周后取材。VC模型組：VC手術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)8周，再給予生理鹽水灌胃4周后取材。VC+MOP給藥組：VC手術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)8周，再給予300 mg/kg MOP灌胃治療4周后取材。

1.4 精索靜脈曲張大鼠模型制作

采用部分結(jié)扎左腎靜脈的方法制作VC大鼠模型。各組大鼠腹腔注射氯胺酮進(jìn)行麻醉后，腹部備皮，乙醇消毒，腹部正中切口，顯露腹腔，將腹腔內(nèi)容物推向右側(cè)，暴露左腎、下腔靜脈、左腎靜脈和左側(cè)睪丸靜脈。鈍性分離左側(cè)腎靜脈注入下腔靜脈處的壁腹膜，將一根直徑為0.8 mm的金屬桿與左腎靜脈平行放置，與左腎靜脈一起結(jié)扎，結(jié)扎后將金屬桿撥出，將腹腔內(nèi)容物復(fù)位后，關(guān)腹，縫合，在切口處灑青霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組進(jìn)行相同的手術(shù)步驟，但不進(jìn)行左腎靜脈部分結(jié)扎。取材時采用氯胺酮腹腔注射麻醉大鼠，剖腹觀察，VC模型組和VC+MOP給藥組大鼠若出現(xiàn)左側(cè)精索內(nèi)靜脈擴張（左側(cè)精索靜脈直徑至少為右側(cè)精索靜脈直徑的3倍）且2個腎質(zhì)量相似，則表明手術(shù)成功。假手術(shù)組大鼠精索靜脈則未見擴張。隨后采用頸椎脫臼的方法處死大鼠，切開陰囊取左側(cè)睪丸組織，放入干冰中儲存。

1.5 蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法

TMT標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析實驗由康成生物公司完成，每組取3個樣本，共9個樣本。樣本采用RIPA裂解液提取樣本總蛋白，并采用BCA法測定總蛋白濃度。取100 μg總蛋白，加入三（2-羧乙基）膦和碘乙酰胺使二硫鍵還原和烷基化，加入丙酮沉淀蛋白，收集蛋白后采用100 mmol/L 三乙胺碳酸氫鹽重溶蛋白，用胰蛋白酶酶切蛋白得到多肽。采用TMT標(biāo)簽對9個樣品的多肽進(jìn)行標(biāo)記，隨后將所有樣品等量混合成一個樣品。采用甲酸沉淀，并離心去除脫氧膽酸鈉，C18液相色譜柱使樣品中的多肽脫鹽，隨后進(jìn)行LC-MS/MS分析和數(shù)據(jù)庫比對，鑒定出樣品中蛋白組成以及每個蛋白在9個樣品中的相對含量。取4 μg多肽樣品經(jīng)納升流速HPLC液相系統(tǒng)EASY-nLC1000 進(jìn)行分離，并使用在線質(zhì)譜儀 （QExactive） 進(jìn)行檢測。LCMS/MS原始數(shù)據(jù)使用MaxQuant （版本號：1.5.5.1）進(jìn)行搜庫和定量分析。蛋白數(shù)據(jù)庫為Uniprottaxonomy_10116 （Canonical & Isoform）。

1.6 生物信息學(xué)分析

將差異表達(dá)倍數(shù)＞25%，P＜0.05的蛋白視為顯著差異表達(dá)蛋白，并對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行后續(xù)基因本體（gene ontology，GO）、日本京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，運用在線 STRING（https://string-db.org/）蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素ANOVA分析及TukeyHSD法篩選差異表達(dá)蛋白。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MOP紅外光譜化學(xué)指紋圖譜分析

2.1.1 MOP紅外光譜圖 圖1A為MOP的紅外光譜圖，其中3 384 cm-1為 O-H的伸縮振動吸收峰；2 929 cm-1為C-H的伸縮振動吸收峰；1 644 cm-1為C=O的紅外吸收峰；1 417 cm-1、1 325 cm-1為 C-H的彎曲振動吸收峰；1 101 cm-1～1 023 cm-1為糖苷鍵-O-C的紅外吸收峰，873 cm-1可能為β-型糖苷鍵的特征吸收峰。綜上，MOP樣品的紅外光譜圖存在有糖類物質(zhì)的特殊吸收峰。

2.1.2 MOP的分子量范圍 如高效凝膠柱圖譜（圖1B）所示，MOP分別在14.70、17.63、20.49 min處出現(xiàn)3個峰，所占面積百分比分別為4.9%、19.7%、75.4%。MOP主要成分的平均分子量為1 506 Mw，面積歸一比例占75.4%。

圖1 MOP紅外光譜化學(xué)指紋圖譜分析

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

TMT標(biāo)記多肽的效率為96%，鑒定到的總多肽數(shù)為14 742，總蛋白數(shù)為2 510，可定量的蛋白數(shù)為2 412，3組間總差異表達(dá)蛋白數(shù)為57。VC模型組和假手術(shù)組相比差異蛋白總數(shù)為46個（表1），VC+MOP給藥組與VC模型組相比差異蛋白總數(shù)為21個（表2），VC+MOP給藥組與假手術(shù)相比差異蛋白總數(shù)為5個（表3）。差異表達(dá)蛋白采用對應(yīng)的基因名展示。組間差異表達(dá)的蛋白火山圖展示結(jié)果如圖2（見封三）所示，僅對差異表達(dá)倍數(shù)＞ 0.5的蛋白進(jìn)行注釋。層次聚類分析如圖3（見封三）所示，差異表達(dá)蛋白采用對應(yīng)的基因名展示。

圖2 組間差異表達(dá)蛋白火山圖。A：VC模型組與假手術(shù)組間差異表達(dá)蛋白火山圖；B：VC+MOP給藥組與VC模型組間差異表達(dá)蛋白火山圖；C：VC+MOP給藥組與假手術(shù)組間差異表達(dá)蛋白火山圖。紅點表示表達(dá)升高的蛋白，綠點表示表達(dá)降低的蛋白，僅對差異表達(dá)倍數(shù)＞0.5的蛋白進(jìn)行注釋.

圖3 組間差異表達(dá)蛋白層次聚類分析和差異表達(dá)蛋白相互作用分析。A：VC模型組與假手術(shù)組間差異表達(dá)蛋白層次聚類分析；B：VC+MOP給藥組與VC模型組間差異表達(dá)蛋白層次聚類分析；C：VC+MOP給藥組與假手術(shù)組間差異表達(dá)蛋白層次聚類分析；D：差異表達(dá)蛋白相互作用分析.

表1 VC模型組與假手術(shù)組間差異表達(dá)蛋白

表2 VC+MOP給藥組與VC模型組間差異表達(dá)蛋白

表3 VC+MOP給藥組與假手術(shù)組間差異表達(dá)蛋白

2.3 組間差異表達(dá)蛋白GO富集

GO富集通路包括細(xì)胞組成（cellular component，CC）、生物過程（biological process，BP）和分子功能（molecular function，MF）3種類別，組間差異表達(dá)蛋白GO富集結(jié)果見表4，僅展示與本研究相關(guān)的富集通路（P＜0.05），差異表達(dá)蛋白采用對應(yīng)的基因名展示。

表4 差異表達(dá)蛋白GO通路富集

2.4 差異表達(dá)蛋白KEGG通路富集

組間差異表達(dá)蛋白KEGG通路富集（P＜0.05）結(jié)果見表5，差異表達(dá)蛋白采用對應(yīng)的基因名展示。

表5 差異表達(dá)蛋白KEGG通路富集

2.5 蛋白質(zhì)相互作用分析

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)站分析結(jié)果顯示，53個基因間存在顯著富集的相互作用，分析結(jié)果總結(jié)如圖3D（見封三）所示，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用富集P值為0.0121，線條粗細(xì)代表互作強度，差異表達(dá)蛋白采用對應(yīng)的基因名展示。

3 討論

3.1 MOP減少由VC引起的睪丸組織內(nèi)差異表達(dá)蛋白數(shù)量

蛋白質(zhì)組學(xué)研究是近年新興的科研手段，不僅為揭示生命活動規(guī)律提供基礎(chǔ)，并且對于闡明疾病的病理機制以及尋找診斷和治療靶點具有重要意義。在前期的實驗中課題組發(fā)現(xiàn)300 mg/kg MOP對VC大鼠睪丸修復(fù)效果最佳。為進(jìn)一步闡述MOP的修復(fù)機制，本研究根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)篩選的差異表達(dá)蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，VC模型組和假手術(shù)組相比差異蛋白總數(shù)為46個，而VC+MOP給藥組與假手術(shù)組相比差異蛋白總數(shù)僅為5個；結(jié)合差異蛋白的火山圖和層次聚類分析結(jié)果，可見VC模型組與其他2個組相比差異蛋白數(shù)較多，蛋白表達(dá)水平差異較大。由此可見，MOP能使由VC引起組間的差異表達(dá)的蛋白數(shù)量減少，蛋白質(zhì)組成相似，蛋白質(zhì)表達(dá)水平趨于正常，這從蛋白質(zhì)整體水平反映了MOP對于VC引起的睪丸損傷的修復(fù)作用。

3.2 關(guān)鍵差異表達(dá)蛋白分析

通過對差異表達(dá)蛋白進(jìn)一步篩選和分析，顯示VC會引起Pla2g6蛋白表達(dá)升高；而給予MOP后，Pla2g6蛋白表達(dá)水平降低，提示MOP能逆轉(zhuǎn)由VC引起的Pla2g6蛋白表達(dá)水平升高，可能是VC和MOP修復(fù)作用中的關(guān)鍵蛋白分子之一。Pla2g6屬于一種胞質(zhì)內(nèi)非Ca2+依賴型磷脂酶A2[18-19]，能夠分解膜磷脂產(chǎn)生花生四烯酸和前列腺素，參與磷脂重塑和自殺相關(guān)蛋白（Fas蛋白）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號傳遞。Pla2g6分解膜磷脂產(chǎn)生的花生四烯酸和溶血磷脂廣泛參與了細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，影響蛋白質(zhì)磷酸化水平，例如參與動脈血管的松弛、血管平滑肌收縮等過程[20]。Pla2g6一直被認(rèn)為是鐵離子沉積性神經(jīng)變性病的致病基因之一[21]，由Pla2g6基因突變引起的疾病被稱為 Pla2g6相關(guān)性神經(jīng)變性，例如嬰兒神經(jīng)軸索營養(yǎng)不良和帕金森病[22-23]。而Pla2g6蛋白在睪丸組織中的生物學(xué)功能和參與雄性生殖系統(tǒng)疾病發(fā)生的機制及相應(yīng)的治療研究國內(nèi)外還未見報道。筆者推測Pla2g6組間表達(dá)水平差異可能與VC的病理機制和MOP的修復(fù)作用相關(guān)，并且可能是通過分解磷脂以及產(chǎn)生的代謝物，廣泛參與細(xì)胞內(nèi)信號傳遞過程、影響蛋白質(zhì)磷酸化水平、擾亂細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白骨架系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)、影響支持細(xì)胞緊密連接等過程實現(xiàn)的，但具體機制還需要進(jìn)一步實驗證實。此外，Akap8l、Aldh1a7、 Bcs1l、Cbr1、Efl1、Eif6、Hsd17b12、Rpl37a、Slc35f6、Yipf5蛋白在VC模型組和假手術(shù)組之間表達(dá)上調(diào)，而在VC+MOP給藥組和VC模型組之間表達(dá)下調(diào)，提示MOP能夠逆轉(zhuǎn)由VC導(dǎo)致的上述蛋白表達(dá)上調(diào)；Crp在VC模型組和假手術(shù)組之間表達(dá)下調(diào)，而在VC+MOP給藥組和VC模型組之間表達(dá)上調(diào)，提示MOP能夠逆轉(zhuǎn)由VC導(dǎo)致的Crp表達(dá)下調(diào)，這

些蛋白可能在VC和MOP的修復(fù)作用中扮演重要角色。

3.3 生物信息學(xué)分析

根據(jù)GO通路富集結(jié)果，VC模型組與假手術(shù)組間差異表達(dá)蛋白富集于凋亡信號通路的調(diào)控、激素水平調(diào)節(jié)、體液免疫應(yīng)答、睪酮反應(yīng)等通路，這與筆者前期實驗的結(jié)果基本一致，即VC能夠引起生精上皮和BTB損傷、生殖細(xì)胞凋亡、血清性激素水平紊亂以及增加血清抗精子抗體水平等[15]；VC+MOP給藥組和VC模型組間差異表達(dá)蛋白富集于凋亡信號通路的調(diào)控、類固醇脫氫酶活性等通路，同樣與課題組前期實驗的結(jié)果基本一致，即MOP能夠減少生殖細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)紊亂的血清性激素水平趨于正常、增加睪丸組織內(nèi)雄激素水平等[15]；VC+MOP給藥組和假手術(shù)組間差異表達(dá)蛋白富集于膜脂質(zhì)生物合成過程、正向調(diào)控蛋白激酶C信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、正向調(diào)節(jié)血液循環(huán)等通路，提示MOP的修復(fù)作用可能也與上述生物學(xué)過程相關(guān)。此外，差異表達(dá)蛋白主要富集于代謝相關(guān)的KEGG通路，提示VC和MOP可能對睪丸內(nèi)的物質(zhì)代謝過程產(chǎn)生影響，但物質(zhì)代謝對于精子發(fā)生過程的影響有待進(jìn)一步研究。