楊振光，任洪冰，蘇舒，劉秉珍，李莉蓉*，曹建新*

1(昆明理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院，云南 昆明，650500)2(紅河宏斌食品有限公司，云南 紅河，654300)

藠頭是百合科的多年生宿根性草本植物，辣椒是茄科辣椒屬植物，在我國主要產(chǎn)地集中于云南四川和湖南等地，發(fā)酵后的藠頭和辣椒具有優(yōu)秀的抗菌、抗缺氧和免疫調(diào)節(jié)功能[1-2]。此外，發(fā)酵后產(chǎn)生的乳酸及有機(jī)酸能夠提高食欲，促進(jìn)胃腸消化[3]。泡藠頭與泡辣椒作為自然發(fā)酵的蔬菜制品，具有豐富的微生物群系，泡藠頭和泡辣椒中的微生物主要來源于環(huán)境和原料表面[4]。泡藠頭和泡辣椒中微生物種群的構(gòu)成與原料、環(huán)境以及制作工藝等因素密切相關(guān)[5]。研究表明，乳酸菌為主要優(yōu)勢菌群[4-6]，其對泡藠頭和泡辣椒風(fēng)味品質(zhì)的形成具有重要的作用[7]。乳酸菌及其混合發(fā)酵產(chǎn)生的酸和醇是形成酯類化合物 (藠頭香氣) 的主要來源[8]。研究發(fā)現(xiàn)，泡藠頭與泡椒發(fā)酵液中富含戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、食果糖乳桿菌(Lactobacillusfructivorans)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)等乳酸菌[9-11]。其中植物乳桿菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力與耐鹽性，可作為腌漬藠頭和辣椒的發(fā)酵菌種[12]。

相較傳統(tǒng)的純化培養(yǎng)技術(shù)，高通量測序技術(shù)實(shí)現(xiàn)了不同樣品間微生物菌群的比較分析。目前關(guān)于高通量測序技術(shù)在發(fā)酵辣椒和藠頭的微生物多樣性分析中的應(yīng)用報(bào)道較少，關(guān)于云南腌漬辣椒和藠頭的細(xì)菌和真菌多樣性研究更是尚未發(fā)現(xiàn)。

本研究采用高通量測序技術(shù)對昆明、文山和紅河地區(qū)的腌漬藠頭和辣椒中細(xì)菌和真菌菌落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以期為后續(xù)腌漬藠頭和辣椒等特色泡菜制品的微生物多樣性研究提供一定的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試樣品與試劑

1.1.1 供試樣品

腌漬藠頭、辣椒：采自云南省文山州、紅河州和昆明市的農(nóng)貿(mào)市場，共采集樣品5種，分別標(biāo)記為文山泡藠頭(WJ)、文山泡辣椒(WL)、紅河泡藠頭(HJ)、紅河泡辣椒(HL)、昆明泡藠頭(KJ)。

1.1.2 試劑

基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR試劑盒、Manual_XLR70試劑盒，Qiagen公司；TruSeq測序配套試劑，北京諾禾致源科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Illumina NovaSeq6000測序平臺(tái)、JY04S-3C型凝膠成像分析系統(tǒng)、JY600C型核酸電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；TGL-16aR型冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集

分別于云南省文山州、紅河州和昆明市的農(nóng)貿(mào)市場對腌漬藠頭和辣椒進(jìn)行采集，裝入樣品袋中低溫保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.3.2 基因組DNA提取

采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)或十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)提取的方法對樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，之后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。

1.3.3 PCR擴(kuò)增及Illumina測序

對樣品基因組進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)，806R(5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3～V4區(qū)。對樣品基因組擴(kuò)增，引物序列為5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和5′-TGCGTTCTTCATCG ATGC-3′擴(kuò)增真菌ITS1(ITS1～I(xiàn)TS2)區(qū)。

所有PCR反應(yīng)均使用15 μL Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix(New England Biolabs)、0.2 μmol/L正反向引物和約10 ng模板DNA進(jìn)行。PCR擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性30 s，循環(huán)1次，95 ℃變性15 s，60～72 ℃退火15 s，72 ℃延伸30～60 s，循環(huán)30次，最后72 ℃ 再延伸15 min。將等量的1×負(fù)載緩沖液(含SYB green)與PCR產(chǎn)物混合，使用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，寄往北京諾禾致源科技股份有限公司完成高通量測序，測序平臺(tái)為Illumina NovaSeq6000。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

測序完成后,按照目的片段的大小,剔除質(zhì)量不合格的原始序列,對合格的序列進(jìn)行拼接。按照97%相似度閾值進(jìn)行分類,建立操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)，通過核糖體數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目樸素貝葉斯算法鑒定OTU種系型?；诩?xì)菌群落的組成,在門和屬兩個(gè)水平上進(jìn)行樣品的細(xì)菌多樣性分析。同時(shí)，對OTUs進(jìn)行豐度、α多樣性計(jì)算等分析，以得到樣本內(nèi)物種豐富度和均勻度信息、不同樣本或分組間的共有和特有OTUs信息等。使用Origin 8.5軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡藠頭和泡辣椒的細(xì)菌菌落組成

通過對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣品門和屬水平的菌落組成，根據(jù)各樣品不同屬的細(xì)菌所占比例作圖,并將相對豐度<0.1%的部分合并為其他(other)。不同地區(qū)泡藠頭和泡辣椒細(xì)菌相對豐度占比如圖1和圖2所示。

圖1 泡藠頭和泡辣椒樣品中細(xì)菌門水平分布圖Fig.1 Phylum level distribution of bacteria in pickled Chinese onion and pickled pepper

圖2 泡藠頭和泡辣椒樣品中細(xì)菌屬水平分布圖Fig.2 Genus level distribution of bacteria in pickled Chinese onion and pickled pepper

如圖1所示，基于OTU結(jié)果表明，厚壁菌門(Firmicutes)、變形桿菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為泡藠頭和泡辣椒的主要共有菌門。其中，厚壁菌門和變形桿菌門為優(yōu)勢菌門，相對豐度占比分別為50.61%、58.07%、53.13%、99.20%、11.97% 和47.36%、35.63%、44.96%、0.58%、58.18%。此外，當(dāng)樣品中變形桿菌門相對豐度升高時(shí)，厚壁菌門相對豐度降低；其中WL中變形菌門比例最高，達(dá)到了58.19%；另外，WL中放線菌門和擬桿菌門相對豐度為16.83%和10.42%，與LIANG等[13]的研究結(jié)果一致。向凡舒等[14]運(yùn)用高通量測序技術(shù)對腌制蔬菜的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明其優(yōu)勢細(xì)菌門也為厚壁菌門。綜上所述，泡藠頭和泡椒的菌落結(jié)構(gòu)相似，但相對豐度差別較大。

如圖2所示，泡藠頭和泡辣椒樣品中相對豐度>1%的細(xì)菌有17個(gè)屬，包括乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳球菌屬(Lactococcus)和魏斯氏菌屬(Weissella)等乳酸菌和假單胞菌屬(Pseudomonas)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)等常見致病菌。其中，WJ中乳酸桿菌屬的相對豐度最高，占比為98.07%，明顯高于其他樣品；在不同地區(qū)的泡藠頭和泡辣椒樣品中明串珠菌屬相對豐度占比為0.02%～19.46%，KJ中明串珠菌屬相對豐度占比最高，為19.46%；在HL和HJ中魏斯氏菌屬相對豐度占比較高，分別為8.96%和17.70%。研究表明，乳酸菌在促進(jìn)蛋白質(zhì)分解為脂肪酸和改善風(fēng)味方面具有很大優(yōu)勢，這大大延長了泡辣椒和泡藠頭的貯藏期并且具有良好的風(fēng)味[15]。此外既往研究結(jié)果得出，發(fā)酵蔬菜中的乳酸菌大多數(shù)來自于乳酸桿菌屬，這與本研究結(jié)果相符[16-21]。另外JEONG等[22]研究表明韓國發(fā)酵蔬菜中乳酸桿菌屬、魏斯氏菌屬和明串珠菌屬豐度較高，造成不同地區(qū)泡藠頭中乳酸菌類群存在差異的原因除與原料種類有關(guān)外，還與地域和制作工藝等諸多因素有關(guān)。

2.2 泡藠頭和泡辣椒的真菌菌落組成

根據(jù)OTU結(jié)果，對泡藠頭和泡辣椒中每個(gè)樣品中真菌OTU進(jìn)行分類學(xué)分析，進(jìn)而研究泡藠頭和泡辣椒中的真菌菌落的組成，真菌綱水平和屬水平分析結(jié)果如圖3和圖4所示。

圖3 泡藠頭和泡辣椒樣品真菌綱水平的分布圖Fig.3 Class level distribution of fungi in pickled Chinese onion and pickled pepper

圖4 泡藠頭和泡辣椒樣品真菌屬的分布圖Fig.4 Genus level distribution of fungi in pickled Chinese onion and pickled hot pepper

如圖3所示，泡藠頭和泡辣椒樣品中真菌在綱水平上，共檢測到酵母菌(Saccharomycetes)、座囊菌(Dothideomycetes)和傘菌(Agaricomycetes)。其中，酵母菌在KJ、WJ、HJ和WJ中占比>75%。這表明，泡辣椒和泡藠頭樣品的優(yōu)勢真菌門為酵母菌，這可能與其較高的食鹽耐受力有關(guān)。李恒等[23]研究表明，發(fā)酵蔬菜樣品中優(yōu)勢真菌門為酵母菌，與本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果相同，酵母菌被認(rèn)為是傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中的主要真菌。

由圖4可知，泡藠頭和泡辣椒樣品中相對豐度>1%的真菌有8個(gè)屬，分別為接合酵母菌屬(Zygosaccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、阿薩希絲孢酵母屬(Trichosporon)、漢遜酵母屬(Hanseniaspora)、念珠菌屬(Candida)、孢子菌屬(Mycosphaerella)、環(huán)孢菌(Torulaspora)和枝孢菌(Cladosporium)。其中，WL、WJ、HJ和HL中接合酵母菌屬為優(yōu)勢菌種，相對豐度占比分別為60%；KJ中畢赤酵母屬為優(yōu)勢菌種。有研究報(bào)告指出，采樣地點(diǎn)不同和原料不同的發(fā)酵蔬菜樣品的優(yōu)勢真菌均為接合酵母菌屬[24]。而本研究也首次發(fā)現(xiàn)阿薩希絲孢酵母屬在泡藠頭或泡辣椒中作為主要真菌屬，阿薩希絲孢酵母屬多見于溫?zé)岬貐^(qū)，是一種常見致病酵母菌[25-26]，可能由于發(fā)酵時(shí)氣候炎熱，導(dǎo)致出現(xiàn)真菌感染，其在泡藠頭和泡辣椒的作用特性和危害有待進(jìn)一步探索。

2.3 OTUs分類學(xué)分析及多樣性分析

2.3.1 OTU聚類統(tǒng)計(jì)

如表1和表2所示，在OTU劃分的基礎(chǔ)上，所有真菌序列劃分為133個(gè)門、316個(gè)綱、488個(gè)目、851個(gè)科和1 342個(gè)屬；所有的細(xì)菌序列則被劃分為133個(gè)門、316個(gè)綱、488個(gè)目、851個(gè)科和1 342個(gè)屬。

表1 樣品真菌群落各分類地位數(shù)量 單位：個(gè)Table 1 Number of fungal communities in each taxonomic position

表2 樣品細(xì)菌群落各分類地位數(shù)量 單位：個(gè)Table 2 Number of bacterial communities in each taxonomic position

由圖5-a可知，5個(gè)樣品中共有真菌OTU數(shù)量為178，而樣品KJ、WL、WJ、HL和HJ中特有的真菌OTU數(shù)量分別為1 065、614、609、570和671，說明昆明地區(qū)的泡藠頭中的真菌群落多樣性高于其他2個(gè)地區(qū)。由圖5-b可知，5種泡菜樣品中共有細(xì)菌OTU有110個(gè)。在不同樣品組間獨(dú)有細(xì)菌OTU數(shù)量也存在差異，其中，WL的OTU數(shù)量最多，有341個(gè)，WJ的OTU數(shù)量最少，有17個(gè)；而HJ、HL和KJ的OTU數(shù)量分別為195、67和151個(gè)。表明在文山地區(qū)的的泡藠頭和泡辣椒間細(xì)菌種類存在差異。綜合分析，在3個(gè)地區(qū)的泡菜樣品中細(xì)菌的OTU數(shù)量明顯少于真菌的OTU數(shù)量。

a-真菌；b-細(xì)菌圖5 微生物群落維恩圖Fig.5 Venn diagram of microbial community

2.3.2 α-多樣性分析

α多樣性分析能夠表示樣品中微生物的豐富度與均勻度，其中Chao1指數(shù)能夠評價(jià)微生物菌落的豐富度，其值的大小隨著菌群豐富度的升高而增加；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在反應(yīng)微生物菌落豐富度的基礎(chǔ)上還能夠反應(yīng)樣品中菌落結(jié)構(gòu)均勻度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)隨著微生物菌落豐富度與均勻度的升高而增大[13]。

由表3可知，就真菌而言，在5種樣品中HJ的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)最高；KJ的Chao1指數(shù)最低，WL的Shannon指數(shù)最低。這說明HJ樣品具有最高的真菌物種多樣性和均勻度，而KJ樣品的真菌物種多樣性最低，WL的真菌物種均勻度最低。

表3 真菌生物多樣性指標(biāo)Table 3 Indicators of fungal biodiversity

由表4可知，通過Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)對泡藠頭和泡辣椒樣品中細(xì)菌的菌群多樣性和豐度進(jìn)行了比較。其中，WL的Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)均高于其他各樣品組，WJ的Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)最低；此外泡辣椒樣品的Shannon和Simpson指數(shù)均高于泡藠頭樣品。結(jié)果表明，泡藠頭中的細(xì)菌菌群豐度與多樣性高于泡辣椒，并且文山地區(qū)泡辣椒的細(xì)菌的菌群多樣性顯著高于其他地區(qū)。由此我們可以推斷，泡辣椒和泡藠頭中細(xì)菌菌群豐度和多樣性隨著環(huán)境原料的變化而改變，文山地區(qū)由于其環(huán)境因素，泡藠頭中的細(xì)菌多樣性顯著高于其他各組樣品。

表4 細(xì)菌生物多樣性指標(biāo)Table 4 Indicators of bacterial biodiversity

2.3.3 不同地區(qū)樣品間物種組成分析

為進(jìn)一步確定泡菜產(chǎn)地和泡菜種類對泡菜中細(xì)菌和真菌菌落結(jié)構(gòu)的影響因素，通過采用OTU水平非加權(quán)UniFrac距離的主成分分析(principal component analysis,PCA)和聚類堆疊樹狀圖對5種泡菜樣品的β多樣性進(jìn)行進(jìn)一步的比較分析。

PCA作為評價(jià)微生物群落相似性的可視化方法，樣本間的距離越近，微生物群落結(jié)構(gòu)越相似。真菌群落PCA結(jié)果如圖6所示，紅河地區(qū)的泡辣椒和泡藠頭樣品主要分布在第1象限；昆明地區(qū)泡藠頭樣品分布在第2象限；文山地區(qū)的泡辣椒和泡藠頭樣品分布在第3和第4象限。3個(gè)地區(qū)的泡辣椒和泡藠頭樣品在PCA圖中的距離相差較遠(yuǎn)，說明3個(gè)地區(qū)泡辣椒和泡藠頭樣品中細(xì)菌菌落的結(jié)構(gòu)存在較大差異，其中紅河地區(qū)與文山地區(qū)的辣椒和泡藠頭樣品中細(xì)菌菌落的結(jié)構(gòu)差異小于昆明地區(qū)泡藠頭樣品。

圖6 真菌主成分分析Fig.6 Principal component analysis of fungal

細(xì)菌群落PCA結(jié)果如圖7所示，3個(gè)地區(qū)的樣品間距離較遠(yuǎn)，說明這3個(gè)地區(qū)樣品間細(xì)菌群落相似性較低；樣品HL和HJ在圖中距離較近，表明2個(gè)樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高；樣品WL和WJ各自離散，說明2個(gè)樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性低。

圖7 細(xì)菌主成分分析Fig.7 Principal component analysis of bacteria

為了能更加清楚的反應(yīng)樣品中真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異，通過聚類堆疊樹狀圖對5種樣品進(jìn)行聚類分析。真菌聚類堆疊樹狀圖如圖8所示，5種樣品可分為2個(gè)大類，其中昆明地區(qū)泡藠頭為一類，而文山和紅河地區(qū)的泡辣椒和泡藠頭聚類為一類，該結(jié)果與PCA結(jié)果相似。

細(xì)菌聚類堆疊樹狀圖如圖9所示，5種樣品中，HL和HJ為一類，其余3種樣品各自為一類，這與PCA結(jié)果基本一致。從泡辣椒和泡藠頭真菌群落的β多樣性分析結(jié)果來看，不同地區(qū)的泡辣椒和泡藠頭相似度差別較大，這可能與地域差異性導(dǎo)致的微生物群落的核心類群不同有關(guān)。

圖9 基于OTU水平的細(xì)菌聚類分析Fig.9 Cluster analysis of bacteria based on OTU level

3 結(jié)論

本研究利用高通量測序技術(shù)分析了云南省昆明市、文山州和紅河州的泡藠頭和泡辣椒中細(xì)菌和真菌的菌群構(gòu)成及相對豐度。結(jié)果表明，樣品中優(yōu)勢細(xì)菌類群主要是由隸屬于厚壁菌門(Firmicutes)的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳球菌屬(Lactococcus)和魏斯氏菌屬(Weissella)構(gòu)成；優(yōu)勢真菌類群主要是由接合酵母菌屬(Zygosaccharomyces)和畢赤酵母菌屬(Pichia)構(gòu)成。通過對比昆明市、文山州和紅河州的泡藠頭和泡辣椒微生物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)文山州泡藠頭和泡辣椒細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)種類多樣性及豐度要顯著高于其他地區(qū)，紅河州的泡藠頭和泡辣椒真菌群落結(jié)構(gòu)種類多樣性及豐度要顯著高于其他地區(qū)。