賈京晶 魏兵 李令雪 任夢(mèng)洋, 張世楠 劉俊 張宇璇,

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧沈陽(yáng) 110016；2.中國(guó)人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng) 110016）

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的慢性呼吸道疾病之一，以慢性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑為特征的異質(zhì)性疾病［1］。近年來(lái)，兒童哮喘呈起病年齡逐漸變小，患病率逐漸上升的趨勢(shì)。我國(guó)兒童哮喘患病率已經(jīng)從1990年的0.91%，上升為2010 的3.02%［2-3］。哮喘已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，然而哮喘的發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為其是由多種遺傳因素和環(huán)境因素間復(fù)雜的相互作用引起的［4-5］。腺苷酸環(huán)化酶9 （adenylyl cyclase Ⅸ，ADCY9）基因位于染色體16p13.3 區(qū)，該基因編碼一種膜結(jié)合酶，分布比較分散，在肺和其他組織中均廣泛表達(dá)。研究表明ADCY9基因可能與哮喘、瘧疾和鐮狀細(xì)胞病等具有相關(guān)性［6］。目前國(guó)外關(guān)于ADCY9基因多態(tài)性與兒童哮喘的關(guān)系僅有1 篇研 究，結(jié)果顯示ADCY9基 因rs2601814 和rs2601796 位點(diǎn)與巴西兒童哮喘易感性有關(guān)［7］，國(guó)內(nèi)暫無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。本研究為國(guó)內(nèi)外首次探討ADCY9基因rs1967309、 rs2230739、 rs2601814、rs2601825、rs2601796 和rs2283497 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）與中國(guó)兒童哮喘易感性及基因-環(huán)境交互作用的關(guān)系，以探索兒童哮喘的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究為病例-對(duì)照研究，選取2019年3月至2021年9月就診于中國(guó)人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院的哮喘患兒123例為哮喘組，均符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016 年版）》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。根據(jù)哮喘急性發(fā)作嚴(yán)重程度分為輕中度84例（68.3%），重度39 例（31.7%）。對(duì)照組兒童選取同期于我院健康體檢的兒童124例。所有入組兒童均為東北地區(qū)漢族兒童，三代內(nèi)無(wú)血緣關(guān)系，無(wú)自身免疫疾病和其他病史。哮喘組和對(duì)照組兒童性別、入組年齡及體重指數(shù)（body mass index，BMI）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［倫理Y（2020）054號(hào)］，所有患兒家屬均簽署知情同意書(shū)。

表1 研究對(duì)象基本情況

1.2 ADCY9基因SNPs的測(cè)定

分別采集2 組研究對(duì)象外周血3 mL 于真空靜脈采血管中，采用DNA 提取試劑盒（上海天昊科技生物有限公司）提取DNA，應(yīng)用Primer 3軟件設(shè)計(jì)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物（生工生物工程上海股份有限公司），利用引物對(duì)ADCY9基因6 個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，引物信息見(jiàn)表2。PCR 反應(yīng)體系包含10 倍PCR 反應(yīng)緩沖液，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP 混合液，1 U Tap酶，1 μL樣本DNA和1 μL多重PCR引物；反應(yīng)條件： 95℃2 min， 94℃20 s， 65℃40 s， 72℃1.5 min，共35 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物純化后采用ABI3730XL測(cè)序儀進(jìn)行基因測(cè)序，ADCY9基因6個(gè)位點(diǎn)電泳峰型見(jiàn)圖1~6。

圖1 rs1967309位點(diǎn)電泳峰型圖

表2 引物信息

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（Q1，Q3）］表示，2組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和構(gòu)成比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用logistic 回歸分析對(duì)ADCY9基因與兒童哮喘易感性進(jìn)行分析，以比值比（odds ratio，OR）及95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）評(píng)估相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度。應(yīng)用廣義多因子降維法（generalized multifactor dimensionality reduction，GMDR） 分 析ADCY9基因與環(huán)境因素的交互作用，得出最優(yōu)模型后，應(yīng)用二元logistic 回歸分析進(jìn)行驗(yàn)證。連鎖不平衡及單倍型分析采用Haploview 軟件，當(dāng)連鎖不平衡系數(shù)（D'）>0.8 時(shí)存在強(qiáng)連鎖不平衡。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 rs2230739位點(diǎn)電泳峰型圖

圖3 rs2601814位點(diǎn)電泳峰型圖

圖4 rs2601825位點(diǎn)電泳峰型圖

圖5 rs2601796位點(diǎn)電泳峰型圖

圖6 rs2283497位點(diǎn)電泳峰型圖

2 結(jié)果

2.1 ADCY9基因6個(gè)位點(diǎn)基因型及等位基因在哮喘組和對(duì)照組的分布

應(yīng)用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)ADCY9基因6個(gè)位點(diǎn)分布情況，結(jié)果顯示哮喘組及對(duì)照組符合遺傳平衡定律（均P>0.05），說(shuō)明研究對(duì)象具有良好的代表性。rs1967039 位點(diǎn)基因型和等位基因在哮喘組和對(duì)照組的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。經(jīng)logistic 回歸分析顯示rs1967039 位點(diǎn)中GA 和AA基因型兒童哮喘患病風(fēng)險(xiǎn)分別為GG基因型兒童的0.493、0.395 倍，攜帶A 等位基因兒童患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶G 等位基因兒童的1.755 倍（P<0.05）。rs2230739、rs2601814、rs2601825、rs2601796 和rs2283497 位點(diǎn)基因型及等位基因在哮喘組和對(duì)照組的分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。見(jiàn)表3。

表3 哮喘組和對(duì)照組的ADCY9基因6個(gè)位點(diǎn)基因型及等位基因比較 ［n（%）］

2.2 ADCY9基因6個(gè)位點(diǎn)基因型及等位基因與兒童哮喘急性發(fā)作嚴(yán)重程度的關(guān)系

ADCY9基因6 個(gè)位點(diǎn)基因型及等位基因在輕中度兒童和重度兒童的分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表4。

表4 ADCY9基因SNPs與不同哮喘急性發(fā)作嚴(yán)重程度的關(guān)系 ［n（%）］

2.3 ADCY9 基因6 個(gè)位點(diǎn)連鎖不平衡及單倍型分析

ADCY9基 因rs2601796 和rs2601814 位 點(diǎn)D'為0.98，表明2 位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖不平衡，構(gòu)成TA和GG 2 種單倍型。單倍型TA 和GG 在哮喘組和對(duì)照組的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。單倍型TA和GG在不同哮喘急性發(fā)作嚴(yán)重程度中的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表5~6。

表5 哮喘組和對(duì)照組單倍型TA和GG分布頻率比較［n（%）］

表6 不同哮喘急性發(fā)作嚴(yán)重程度單倍型TA和GG分布頻率比較 ［n（%）］

2.4 ADCY9基因6個(gè)點(diǎn)位間的交互作用分析

應(yīng) 用 GMDR 分 析 rs1967309、 rs2230739、rs2601814、rs2601825、rs2601796 和rs2283497 位點(diǎn)之間的交互作用， 結(jié)果顯示rs1967309、rs2230739、rs2601814、rs2601825、rs2601796 和rs2283497 位點(diǎn)交叉一致性為100%，為最佳模型，但6個(gè)位點(diǎn)間顯著性檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。見(jiàn)表7。

表7 ADCY9基因各位點(diǎn)間的交互作用GMDR分析結(jié)果

2.5 ADCY9基因與環(huán)境交互作用分析

采用GMDR 分析母乳喂養(yǎng)、變應(yīng)原接觸、環(huán)境煙草煙霧（environmental tobacco smoke，ETS）接觸、寵物接觸及城市居住地與rs1967309 位點(diǎn)的交互作用。由表8可以看出，二階模型及六階模型交叉一致性均為10/10，但二階模型檢驗(yàn)樣本準(zhǔn)確性（0.661）高于六階模型（0.600），故選擇二階模型為最佳模型（圖7）。二階模型交互作用顯著性檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），即rs1967309位點(diǎn)與變應(yīng)原接觸的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)ADCY9基因各位點(diǎn)間及其與環(huán)境交互作用交叉一致性為100%的模型進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析驗(yàn)證，結(jié)果顯示rs1967309 位點(diǎn)與變應(yīng)原接觸的交互作用使哮喘的患病風(fēng)險(xiǎn)增加（OR=1.585，P<0.05）。見(jiàn)表9。

表9 交叉一致性為100%的模型logistic回歸分析

圖7 ADCY9基因rs1967309位點(diǎn)與環(huán)境交互作用的GMDR分析結(jié)果最佳模型

表8 ADCY9基因rs1967309位點(diǎn)與環(huán)境交互作用GMDR分析結(jié)果

3 討論

近二三十年來(lái)，在全球范圍內(nèi)兒童哮喘的發(fā)生率迅速升高，尤其是經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的國(guó)家和地區(qū)［8］，嚴(yán)重影響了人們的身心健康。早期哮喘風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)兒童至關(guān)重要，若能進(jìn)行有效的早期評(píng)估，采取早期預(yù)防能很大程度降低高風(fēng)險(xiǎn)兒童哮喘的發(fā)病率。哮喘是多基因控制的呼吸系統(tǒng)慢性疾病，其發(fā)病受遺傳、環(huán)境等因素影響。ADCY9基因受G 蛋白耦合受體、蛋白激酶和鈣家族的調(diào)節(jié)， 催化三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）轉(zhuǎn)化為第二信使環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP），ADCY9基因表達(dá)的減少導(dǎo)致cAMP生成減少，進(jìn)而引起免疫調(diào)節(jié)失衡［9］。此外，β2腎上腺素能受體在ADCY9基因的介導(dǎo)下可被激活，該通道對(duì)平滑肌及肺功能調(diào)節(jié)起著重要作用［10-11］。

本研究對(duì)ADCY9基因6 個(gè)位點(diǎn)的SNPs 與兒童哮喘易感性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示rs1967309 位點(diǎn)檢測(cè)出GG、GA和AA 3種基因型，與Kim等［12］分析韓國(guó)輕中度哮喘患者ADCY9基因多態(tài)性相同，基因型及等位基因在哮喘組和對(duì)照組的分布差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明該位點(diǎn)是兒童哮喘的易感位點(diǎn)，其中AA基因型在哮喘組中的分布頻率低于對(duì)照組，次等位基因A降低了兒童患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)，提示其是兒童哮喘的保護(hù)因素。我們推測(cè)可能次等位基因A 參與了蛋白激酶A 的正向調(diào)控，cAMP 生成增多，使ADCY9活性增加。Teixeira等［7］研究了ADCY9基因多態(tài)性與1 309例巴西兒童哮喘和過(guò)敏的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)rs2601814 和rs2601796 位點(diǎn)的SNPs 增加了哮喘兒童的患病風(fēng)險(xiǎn)，rs2283497 位點(diǎn)與兒童過(guò)敏有關(guān)。本研究未發(fā)現(xiàn)rs2601814、rs2601796和rs2283497位點(diǎn)與兒童哮喘患病風(fēng)險(xiǎn)增加存在關(guān)聯(lián)，考慮可能受到地域、種族和樣本量的影響。此前有研究證實(shí)rs2230739 位點(diǎn)與瘧疾的患病有關(guān)［13-14］，目前暫無(wú)該位點(diǎn)與兒童哮喘的相關(guān)性研究，我們發(fā)現(xiàn)rs2230739 位點(diǎn)與兒童哮喘易感性無(wú)關(guān)。本研究中rs2601825位點(diǎn)檢測(cè)出TT、TC和CC基因型，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)不是兒童哮喘的易感位點(diǎn)。ADCY9基因位于β2腎上腺素能受體下游［9］，β2腎上腺素能受體與哮喘急性發(fā)作密切相關(guān)［15］，因此我們對(duì)ADCY9基因與哮喘急性發(fā)作嚴(yán)重程度進(jìn)行研究，結(jié)果顯示ADCY9基因6 個(gè)位點(diǎn)的SNPs與哮喘急性發(fā)作嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)。

連鎖不平衡指的是不同遺傳標(biāo)記間存在著的非隨機(jī)組合［16］，單倍型是共同出現(xiàn)在單條染色體上的遺傳變異位點(diǎn)的組合［17］。目前越來(lái)越多的學(xué)者致力于單倍型與復(fù)雜性疾病的研究［18-19］。我們是國(guó)內(nèi)外首次對(duì)ADCY9基因單倍型與兒童哮喘的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果顯示rs2601796和rs2601814位點(diǎn)共構(gòu)成TA和GG 2種單倍型，TA和GG單倍型在哮喘組和對(duì)照組中及在不同哮喘急性發(fā)作嚴(yán)重程度中的分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示這2種單倍型與兒童哮喘的發(fā)病及急性發(fā)作嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)。

哮喘是由基因-基因、基因-環(huán)境交互作用引起復(fù)雜性疾?。?0］，了解其交互作用，篩選出哮喘易感人群，避免環(huán)境觸發(fā)因素，能夠?qū)和M(jìn)行早期診斷及有效干預(yù)。有研究表明變應(yīng)原接觸、寵物接觸、ETS接觸、城區(qū)居住地及非母乳喂養(yǎng)均是兒童哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)因素［21-24］。本研究首次探討ADCY9基因與環(huán)境交互作用的關(guān)系，結(jié)果提示rs1967309、rs2230739、rs2601814、rs2601825、rs2601796 和rs2283497 位點(diǎn)不存在交互作用。對(duì)ADCY9基因易感位點(diǎn)rs1967309與環(huán)境因素進(jìn)行交互作用分析，結(jié)果提示rs1967309 位點(diǎn)與變應(yīng)原接觸間存在交互作用，經(jīng)logistic 回歸分析顯示該交互作用增加了哮喘發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，提示rs1967309 位點(diǎn)與變應(yīng)原接觸產(chǎn)生了協(xié)同作用。

綜上，ADCY9基因rs1967309是兒童哮喘的易感位點(diǎn)，該位點(diǎn)和變應(yīng)原接觸的交互具有協(xié)同致哮喘的作用。rs2230739、rs2601814、rs2601825、rs2601796和rs2283497位點(diǎn)并非兒童哮喘的易感位點(diǎn)。由于不同地區(qū)、種族差異和樣本量大小問(wèn)題導(dǎo)致同一疾病的發(fā)病的易感基因不同，并不能完全闡述ADCY9基因多態(tài)性與兒童哮喘的關(guān)系，需進(jìn)一步深入研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明無(wú)利益沖突。