潘 程，劉曉萌，張云鵬，鄒球龍，張曉琳，陳 新，印 鐵

(北京市畜產品質量安全源頭控制工程技術研究中心；中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司1，北京 102209) (武漢輕工大學生物與制藥工程學院2, 武漢 430023)

赭曲霉毒素A(OTA)是一類由氯化的異香豆素類似物和苯丙氨酸通過酰胺鍵連接而成的無色透明晶體化合物。OTA污染在玉米、小麥、大麥、花生等農作物中時有發(fā)生[1]。OTA主要由曲霉菌(Aspergillus)和綠青霉菌(Penicillum)產生，而造成OTA產生的主要因素為作物種植、運輸、儲存過程中環(huán)境溫度過高或濕度過大，導致霉菌滋生[2,3]。毒理學研究表明，高劑量的OTA通過消化道進入人體和動物體后，會嚴重破壞機體肝臟、腎臟等多個器官，造成機體的免疫能力下降，生殖能力降低，同時還會引起DNA損傷，具有致癌、致畸、致突變等危害[4]，因此國際癌癥研究機構(IARC)將其列為可能致癌物質(IIB類)[5]。GB 2761—2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》規(guī)定食品中OTA的限量為5 μg/kg[6]。

目前，常用的OTA檢測方法有熒光光度法、高效液相色譜法(HPLC)、免疫膠體金法、酶聯免疫法等[7-10]。由于OTA在樣品中痕量存在，檢測過程中樣品的前處理技術尤為重要。常用的樣品前處理技術包括固相萃取(SPE)、液-液萃取(LLE)、免疫親和柱(IAC)以及QuEChERS，然而這些前處理技術普遍存在操作繁瑣、耗時長、有機溶劑消耗量大、重復性低、假陽性率高、成本高等問題。

核酸適配體(APT)是一段具有高特異性、高親和力、化學性質穩(wěn)定、易于結構修飾的單鏈寡核苷酸序列，長度通常為10～100 bp，目前主要通過指數富集系統(tǒng)進化技術(SELEX)篩選得到?？稍隗w外與配體(細胞、蛋白、真菌毒素、食源性致病菌、重金屬離子、藥物殘留、食品添加劑)通過氫鍵、靜電力、堿基互補配對等方式特異性結合，形成復雜的三維空間構象，如假結、G-四分體、凸環(huán)等[11-18]。因其作用與抗體相似，常被稱作“化學抗體”，在真菌毒素檢測領域受到廣泛關注[19-21]。Wang等[22]基于Cy5熒光標記的適配體與靶標物特異性結合的原理, 建立了基于適配體互補鏈同時檢測OTA和黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)的方法；Zhao等[23]以特異性的核酸適配體作為識別元件,制備了黃曲霉毒素B1(AFB1)的適配體親和柱(AAC)，用于AFB1的特異性識別和富集；Tan等[24]基于介孔二氧化硅納米粒子(MSN)和核酸適配體特異性，設計一種新穎、簡單的AFB1檢測方法。細菌磁小體(BMs)是一種由趨磁細菌(Magnetospirillumgryphiswaldense)合成的具有細胞質膜包被的生物納米磁性材料，具有粒徑均一、分散性好、趨磁性、易修飾、無細胞毒性等優(yōu)點，在藥物靶向治療、生物工程、檢疫檢測和環(huán)境治理等領域具有廣闊的應用前景[25]。

本實驗選用細菌磁小體和核酸適配體復合體作為吸附材料，建立了一種富集和純化OTA的新方法。將氨基修飾過的核酸適配體連接到細菌磁小體表面，利用功能性細菌磁小體對OTA進行富集和純化，并結合HPLC對細菌磁小體上的OTA進行定量檢測，并對影響萃取效率的各個因素進行優(yōu)化。與免疫親和柱法對比，該方法具有操作簡便，檢測成本低等優(yōu)勢，在樣品前處理技術領域具有較大的研發(fā)潛力。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

5810R型高速離心機，AL140型電子分析天平，冷凍干燥機，超聲破碎儀，凝膠電泳儀，全向動立式高壓滅菌鍋，-80 ℃冰箱。

OTA的適配體序列5′-NH2-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATC GGACAGATTG-3′、赭曲霉毒素A、趨磁細菌MSR-1、超純水、Tris、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、乳酸鈉、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、酵母提取物、硫代乙醇酸鈉、氯化銨、氨三乙酸、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸亞鐵、硫酸鈷、氯化鈣、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸鋁鉀、硼酸、鉬酸鈉、氯化鎳、亞硒酸鈉、三水氯化鐵、飽和氨水溶液、菲啰嗪、鹽酸羥胺、檸檬酸鐵等。

1.2 趨磁細菌MSR-1的發(fā)酵培養(yǎng)及細菌磁小體的制備

1.2.1 趨磁細菌種子培養(yǎng)基(1 L)

乳酸鈉(>60%)1.5 g，磷酸氫二鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.1 g，酵母提取物0.1 g，硫代乙醇酸鈉0.05 g，10×礦質元素混合液 0.5 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min。

1.2.2 趨磁細菌發(fā)酵培養(yǎng)基(4.5 L)

乳酸鈉(>60%)4.0 g，氯化銨1.0 g，磷酸氫二鉀3.0 g，七水硫酸鎂1.2 g，酵母提取物3.0 g，10×礦質元素混合液 3.5 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min。

1.2.3 發(fā)酵補料培養(yǎng)基(1 L)

乳酸(>95%)200.0 g，飽和氨水溶液36.0 mL，磷酸氫二鉀6.0 g，七水硫酸鎂2.4 g，酵母提取物6.0 g，10×礦質元素混合液7.0 mL，三水氯化鐵4.0 g，121 ℃滅菌30 min。

1.2.4 10×礦質元素液(1 L)

氨三乙酸15.0 g，七水硫酸鎂30.0 g，硫酸錳5.0 g，氯化鈉10.0 g，硫酸亞鐵1.0 g，硫酸鈷1.8 g，氯化鈣1.0 g，硫酸鋅1.8 g，硫酸銅0.1 g，硫酸鋁鉀0.2 g，硼酸0.1 g，鉬酸鈉0.1 g，氯化鎳0.25 g，亞硒酸鈉0.003 g，121℃滅菌30 min。

1.2.5 趨磁細菌MSR-1(MagnetospirillumgryphiswaldenseMSR-1)發(fā)酵培養(yǎng)

趨磁細菌MSR-1發(fā)酵種子活化：5 mL保存于-80 ℃冰箱中的趨磁細菌MSR-1接種于50 mL趨磁細菌種子培養(yǎng)基(分裝于容積130 mL血清瓶中)，30 ℃，100 r/min培養(yǎng)24 h?；罨?次后，將50 mL菌液接種于500 mL種子培養(yǎng)基(分裝于1 L三角瓶)，30 ℃，120 r/min培養(yǎng)24 h至OD600≈0.8。

趨磁細菌MSR-1發(fā)酵培養(yǎng)：將500 mL趨磁細菌MSR-1種子培養(yǎng)液全部接種于滅菌后的發(fā)酵罐中，初始培養(yǎng)條件為：通氣0.3 L/min，100 r/min攪拌，以補料培養(yǎng)基作為酸溶液控制pH=6.9。接種后培養(yǎng)約10 h至DO≈10%，調通氣量至0.5L/min，待DO降至<1%，緩慢增加轉速及通氣量，控制DO<1%。每隔2 h取1次樣，發(fā)酵36 h左右，至Cmag值開始明顯下降作為發(fā)酵培養(yǎng)重點。

1.2.6 細菌磁小體的制備

將獲得的趨磁細菌濕菌體與10 mmol/L PBS 緩沖液以1∶10混合，重懸細胞，250 W超聲破碎30 min，超聲3 s，間隔5 s。破碎后的細胞置于釹鐵硼磁鐵上靜置過夜，棄去上清；加入100 mmol/L 10 mmol/L PBS緩沖液，重復該過程，直至光學顯微鏡100倍物鏡下未見明顯的細胞碎片，將純化制備的細菌磁小體冷凍干燥，于-20 ℃保存。

1.2.7 趨磁細菌磁響應能力(Cmag)測定

使用經改裝后的分光光度計(在分光光度計檢測樣品室周圍添加線圈，以添加垂直于管路和平行于光路的磁場)檢測發(fā)酵菌液在565 nm處的吸光度。以水作為空白對照，分別測量發(fā)酵菌液在垂直于光路磁場(OD⊥)和平行于光路磁場(OD∥)下的吸光度值，Cmag=(OD⊥/ OD∥)-1(OD⊥：垂直光路磁場條件下測定波長600 nm處樣品的吸光度，OD∥：平行光路磁場條件下測定波長600 nm處樣品的吸光度)。

1.3 核酸適配體修飾的功能性細菌磁小體的構建

將冷凍干燥后的細菌磁小體懸浮于1 mL 0.01 mmol/L PBS(pH 7.4)中，配制成1 mg/mL的細菌磁小體混懸液，分別移取1 mL細菌磁小體混懸液，1 mL 25%戊二醛溶液和3 mL 0.01 M PBS于10 mL離心管中，使用超聲波清洗器對混合液進行超聲處理(超聲1 min，間隔4 min，重復12次)，反應結束后，將離心管置于磁力架上分離上清液，用1 mL PBS清洗3次后棄上清。加入含有1 nmol OTA適配體和10 μL 5 μg/kg OTA的混合物，加PBS至終體積為100 μL超聲混勻(超聲1 min，間隔4 min，重復12次)，取上清液檢測OTA殘留量，計算該復合物對OTA的吸附效果。

1.4 高效液相色譜檢測條件

色譜柱為C18反相色譜柱，250 mm×4.6 mm，粒徑 5 μm；柱溫：40 ℃；流動相：乙腈∶水∶乙酸=48∶51∶1；激發(fā)波長：333 nm，發(fā)射波長：460 nm；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min。

1.5 數據分析

使用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。采用最小方差分析法比較概率水平為0.05時，不同處理的平均值的顯著性差異。

圖1 發(fā)酵過程中趨磁細菌MSR-1生長曲線，溶氧值及磁響應水平的變化

2 結果與討論

2.1 趨磁細菌MSR-1發(fā)酵培養(yǎng)及細菌磁小體的制備

發(fā)酵培養(yǎng)時間為40 h，在培養(yǎng)過程中每隔2 h取1次，使用紫外分光光度計檢測趨磁細菌MSR-1生長情況及磁響應情況。結果如圖1所示，發(fā)酵至10 h后發(fā)酵培養(yǎng)基中溶氧值(DO)降至1%以下，趨磁細菌細胞進入磁小體快速合成階段，細胞磁響應值迅速上升，至發(fā)酵第24 h磁響應值達到最高。發(fā)酵至34 h時，細胞磁響應值開始下降，至40 h發(fā)酵培養(yǎng)結束。將發(fā)酵液高速離心(4 000 r/min，15 min)收集細胞，按1.2.6所述方法純化細菌磁小體，冷凍干燥后保存于-20 ℃冰箱待用。

2.2 OTA標準曲線的制定

用流動相稀釋OTA標準品母液，使OTA的濃度分別為0.5、1、2、3、5、8、10、15、20 μg/L，利用HPLC進行檢測，繪制標準工作曲線。以峰面積為Y，對OTA的濃度為X軸繪制線性回歸曲線，以信噪比S/N=3確定方法的檢出限，信噪比S/N=10確定方法的定量限。OTA標準曲線參數見表1。

表1 OTA的標準曲線參數

2.3 核酸適配體修飾的功能性細菌磁小體的構建及優(yōu)化

新型核酸適配體修飾的細菌磁小體的制備采用氨基-醛基-氨基交聯的固定化方法，即先將一定量的戊二醛吸附到表面含有氨基的載體上，再添加經過氨基修飾的APT，通過胺醛縮合反應形成BMs-戊二醛-APT復合物。反應原理及流程見圖2。

注：a 帶氨基的BMs；b 戊二醛；c BMs-戊二醛復合物；d 氨基修飾的APT；e OTA；f BMs-戊二醛-APT-OTA復合物。圖2 磁小體-戊二醛-適配體復合物結合過程

2.3.1 核酸適配體修飾功能性細菌磁小體構建方式的優(yōu)化

為促進APT與OTA的結合，本實驗首先對復合物的構建方式進行了優(yōu)化。首先，制備兩個BMs-戊二醛的復合物，分別標記為A和B，在A管中先加入含量為0.1 nmol APT，超聲處理使APT連接在細菌磁小體上，再加入10 μL 50 μg/kg OTA標準品，加入PBS緩沖液至終體積為100 μL，超聲處理12次后，將離心管置于磁力架上，待磁小體全部吸附于管壁時，取上清液進行HPLC分析；先將APT與OTA進行結合(體系與A管體系相同)，隨后將混合液移至B管中，加入PBS緩沖液至終體積為100 μL，超聲混勻后，置于磁力架上靜置，取上清液進行HPLC分析。結果顯示，BMs-戊二醛復合物依次與APT和OTA結合時，復合物對OTA的吸附效果較差，吸附率僅為57%；當戊二醛-BMs復合物與APT-OTA的混合液結合時，復合物對OTA的吸附效果較好，吸附率為83%，其吸附效果顯著高于BMs-戊二醛復合物依次與APT和OTA結合的處理方式(P<0.05)。因此，本研究中核酸適配體修飾功能性細菌磁小體構建方式為：先將APT和OTA結合，再與BMs-戊二醛復合物反應。

2.3.2 APT添加量的優(yōu)化

APT是特異性識別與吸附OTA的關鍵組分，其含量的確定對復合物的富集效果有較大影響。選擇APT添加量分別為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 nmol，研究其對OTA吸附率的影響，結果如圖3所示，隨著APT物質的量的增加，該復合物對OTA的吸附效果逐漸升高隨后降低，當APT的添加量為1 nmol時，該復合物對OTA的吸附效果最好，吸附率達到96%。因此選擇1 nmol作為最佳APT含量。

圖3 不同因素對OTA吸附效果的影響

2.3.3 戊二醛含量的優(yōu)化

使用戊二醛作為雙功能試劑分別連接細菌磁小體和APT，以實現APT的固定化及溶液中OTA的回收。如圖3所示，一定范圍內，隨著戊二醛濃度的提高，BMs-APT復合物對OTA的吸附率增大，當戊二醛體積分數為25%時，APT在細菌磁小體上的固定化效果最好，BMs-APT復合物對OTA的吸附量最高達到95%。

2.3.4 BMs含量的優(yōu)化

由于BMs為納米磁性顆粒，其自身具有磁性聚沉的特性，過多的BMs添加量可能會導致聚沉嚴重，減少復合物有效表面積，因此合理優(yōu)化BMs添加量具有重要意義。如圖3所示，當BMs的添加量在0.1～1.5 mg/mL范圍內時，BMs-APT復合物對OTA的吸附效率呈上升趨勢；當BMs的質量濃度大于1.5 mg/mL時，BMs-APT復合物對OTA的吸附效率逐漸趨于平穩(wěn)狀態(tài)，因此選用1.5 mg/mL作為BMs的最佳添加量。

2.3.5 戊二醛與BMs連接次數的優(yōu)化

BMs表面豐富的亞氨基殘基，是對其進行表面修飾的關鍵位點。基于BMs-APT復合物構建原理，推測BMs表面連接的戊二醛越多，捕獲APT-OTA復合體能力越強。研究連接次數對OTA吸附率的影響，將1 mg BMs與25%戊二醛混合，超聲混勻1 min，靜置4 min，重復操作12次記為連接1次；結果表明，隨著連接次數的增加，BMs吸附APT-OTA復合物的效率逐漸降低。推測可能原因：由于BMs為單磁籌納米磁性顆粒，在每一次連接后更換戊二醛溶液的過程中，部分BMs隨溶液流失，導致溶液中磁小體總量不斷減少，從而導致APT-OTA復合物對OTA吸附率下降。

2.3.6 洗脫液的選擇及洗脫條件優(yōu)化

為將結合在BMs-APT復合物上的OTA釋放出來，以便于OTA的回收與檢測，利用沸水浴、甲醇洗脫、NaOH洗脫及DNaseI酶解4種方式處理結合OTA后的BMs-APT復合物，通過對BMs細胞膜或APT結構進行破壞，達到釋放OTA的目的。結果顯示，沸水浴10 min并不能有效釋放OTA(OTA回收率僅20%，其中回收率=OTA檢測濃度/富集前OTA濃度×100%)，經過甲醇及NaOH洗脫、OTA回收率分別為65%、50%，經DNaseI酶解后，OTA回收率為57%。沸水浴、甲醇洗脫、NaOH洗脫方式均通過破壞BMs細胞膜的方式進行OTA的釋放，DNaseI酶解則通過破壞APT結構的方式釋放OTA，綜合考慮，通過甲醇洗脫與DNaseI酶解相結合的方式可能會達到較好的效果。

分別以沸水浴、甲醇、NaOH溶液、DNaseI酶進行2次洗脫，計算OTA回收率；先用DNaseI酶對BMs-APT-OTA復合物進行酶解(反應條件：37 ℃，2 h)，再用沸水浴、甲醇、NaOH分別對酶解后BMs進行處理，計算OTA回收率。結果如圖4所示，沸水浴洗脫2次回收率為27%；甲醇洗脫2次回收率為72%；NaOH溶液洗脫2次回收率為54%；通過DNaseI酶解2次回收率為72%；DNaseI酶+甲醇(1次)洗脫回收率為91%；DNaseI酶+甲醇(2次)洗脫回收率為96%；DNaseI酶+NaOH(1次)洗脫回收率為57%；DNaseI酶+NaOH(2次)洗脫回收率為62%。因此選擇DNaseI酶+甲醇(2次)作為最佳洗脫條件。

注：1.沸水浴2次；2.甲醇洗脫2次；3.NaOH溶液洗脫2次；4.DNaseI酶解2次；5.DNaseI酶+甲醇(1次)；6.DNaseI酶+甲醇(2次)；7.DNaseI酶+NaOH(1次)；8.DNaseI酶+NaOH(2次)。圖4 不同洗脫條件對OTA的洗脫率的影響

2.3.7 BMs-APT復合物與免疫親和柱吸附/回收效果對比

以免疫親和柱為對照，評估BMs-APT復合物對OTA的吸附/回收性能。結果如圖5所示，在低濃度(<0.5 μg/L)條件下，免疫親和柱對OTA的吸附及回收效果優(yōu)于BMs-APT復合物；當溶液中OTA濃度高于1 μg/L，BMs-APT復合物與免疫親和柱對OTA吸附/回收性能基本相當。

圖5 不同吸附劑對OTA的吸附效果

3 結論

建立了一種以APT和BMs為基礎，用于富集純化樣品中OTA的前處理方法。研究了核酸適配體、戊二醛及細菌磁小體的添加比例及它們之間的最優(yōu)結合方式、反應條件及洗脫條件。通過優(yōu)化，本方法對OTA的最高吸附率為96%，回收率為96%，相對標準偏差為12.5%；同時將BMs-APT復合物對OTA吸附效果與市售免疫親和柱進行比較，發(fā)現其對OTA吸附/回收性能于市售免疫親和柱基本相當，證實了本方法的可行性。利用BMs-APT復合物對OTA進行吸附，操作簡單、成本低、快速高效、特異性強，為OTA的富集和純化提供了新的研究方向。