劉書言，鄧妮妮，陳金卯，田 奇，彭鳳蘭

（1. 廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧 530021；2. 玉林愛爾眼科醫(yī)院，玉林 537000；3. 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，南寧 530021；4. 中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究中心，長沙 410008；5. 長沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，長沙 410205）

近視主要表現(xiàn)為屈光不正以及眼軸延長，占全球視力損傷患者總數(shù)的48.7%［1-2］，是最常見的人類眼部疾病之一。從世界范圍看，美國和歐洲人群中近視發(fā)生率在20%～30%，而亞洲人群中近視的發(fā)生率高達(dá)70%［3-7］。高度近視也稱病理性近視，主要是指近視度數(shù)小于或等于-6.00 m-1或眼軸長度超過26 mm的屈光不正，且伴有進(jìn)行性眼軸延長，眼底視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜呈萎縮性退行性病變［8-10］。流行病學(xué)資料表明，高度近視在亞洲國家更為普遍，其發(fā)病率高達(dá)10%～24%，遠(yuǎn)高于西方國家的2.8%～4.6%［11］。我國近視人數(shù)多達(dá)6億，其中高度近視患者占總近視人數(shù)的近30%［12］。

高度近視的高發(fā)病率、高致盲率及其嚴(yán)重危害性一直是國際社會研究的熱點(diǎn)。目前對于近視的病因?qū)W研究尚無肯定的結(jié)論，主要以環(huán)境因素和遺傳因素為主［8，13］。家系研究表明，父母近視的發(fā)生率與子代近視的發(fā)生率呈正相關(guān)，而雙生子研究證明，近視的遺傳度在0.50～0.96之間，且同卵雙生子的屈光不正和屈光因素一致性比異卵雙生子高［14-16］。這些數(shù)據(jù)提示，高度近視具有明顯的遺傳基礎(chǔ)。高度近視具有多種遺傳方式，包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳以及伴X連鎖遺傳，且具有高度的遺傳異質(zhì)性。傳統(tǒng)的研究方法是通過連鎖分析定位遺傳性疾病家系的致病基因位點(diǎn)區(qū)間，基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），尋找與家系疾病共分離的基因突變。這種方法存在耗時長、人力物力損耗大、無法大規(guī)模高效富集基因組片段等諸多弊端。隨著新一代測序技術(shù)的進(jìn)步，外顯子組測序和靶向外顯子捕獲測序得到了快速發(fā)展，為尋找高度近視致病基因及其突變位點(diǎn)提供了契機(jī)。

外顯子組測序是利用序列捕獲技術(shù)，將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量DNA測序的基因組分析方法。它只需針對外顯子區(qū)域的DNA序列即可，且對常見和罕見變異具有高靈敏度，可發(fā)現(xiàn)絕大部分疾病外顯子區(qū)域的相關(guān)變異，僅需要對約1%的基因組進(jìn)行測序，覆蓋度更深、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性更高，更加簡便、經(jīng)濟(jì)、高效，被認(rèn)為是鑒定孟德爾疾病致病基因最為有效的策略之一，也被運(yùn)用于尋找單基因病及多基因復(fù)雜疾病的致病基因和易感基因等的研究和臨床診斷中。目前，已通過外顯子組測序確定的高度近視致病基因主要有ZNF644、SCO2、LEPREL1、LRPAP1、CTSH、SLC39A5、P4HA2和GLRA2［17-27］。

人類NYX基因位于Xp11.4染色體上，有2個外顯子，編碼長度為481個氨基酸的糖基化磷脂酰肌醇錨錠蛋白（nyctalopin），屬于亮氨酸富集蛋白（small leucine-rich proteoglycan，LSRP）家族成員［28-30］。nyctalopin主要在視網(wǎng)膜突觸層表達(dá)，對轉(zhuǎn)化受體電位陽離子通道亞家族M成員1（transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 1，TRPM1）的正常表達(dá)很重要［31］。有研究報道，NYX基因突變可能導(dǎo)致先天性靜止性夜盲癥（congenital stationary night blindness of the complete，CSNB1）；也有研究發(fā)現(xiàn)，NYX基因的突變與高度近視相關(guān)［22，28，32-36］。本研究中，我們收集到一個遺傳三代的高度近視家系，通過外顯子測序鑒定出NYX基因一個新的錯義突變c.790A＞T（p.N264Y）在該家系中與高度近視表型共分離。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究的家系來自中國廣西一個具有X連鎖遺傳的三代高度近視家庭。先證者在南寧愛爾眼科醫(yī)院進(jìn)行了視力、屈光、裂隙燈、眼底檢查和視網(wǎng)膜電圖（electroretinogram，ERG）等一系列的眼科檢查。其他家庭成員的視力、屈光、裂隙燈檢查和抽血均由專業(yè)的醫(yī)生和護(hù)士上門完成。所有成員均沒有其他已知的眼部疾病或系統(tǒng)性疾病，并排除了早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、馬凡綜合癥和Stickler綜合癥等能導(dǎo)致近視表型的遺傳性疾病。

1.2 外顯子測序分析

采用苯酚-氯仿法從全血樣本中提取DNA［25］。選取先證者的DNA進(jìn)行全外顯子組測序，對測序的結(jié)果進(jìn)行嚴(yán)格的生物信息學(xué)分析。將外顯子組測序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)比對到參考基因組hg19上［37］，然后用SAMTOOLS（http://SAMTOOLS.sourceforge.net/）進(jìn)行單核甘酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）和插入缺失標(biāo)記（insertion-deletion，INDEL）檢測［38］。過濾過程如下 ：1）刪除數(shù)據(jù)庫中高頻率變異；2）刪除純和變異；3）刪除對照中的變異；4）保留兩個患者共有而正常對照沒有的變異。

1.3 突變的篩查與驗(yàn)證

對外顯子組測序得到的候選基因突變位點(diǎn)序列設(shè)計引物，利用Sanger測序驗(yàn)證所有家族成員中該突變位點(diǎn)與表型的共分離狀態(tài)，并在正常對照、1000Genomes、 ESP6500和ExAc等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行突變篩查，排除攜帶該位點(diǎn)的突變。使用primer3（http://primer3.ut.ee/）設(shè)計PCR引物［39］。測序結(jié)果與參考基因組hg19進(jìn)行比對（http://genome.cse.ucsc.edu）［40-41］。錯義突變的功能預(yù)測及潛在的疾病風(fēng)險預(yù)測工具為Polyphen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）［42］、SIFT（scale-invariant feature transform，http://sift.jcvi.org/www/SIFT_seq_submit2.html）［43］和Mutation Taster（http://www.mutationtaster.org/）［44］。

2 結(jié)果與分析

2.1 家系臨床特征分析

本研究共采集該高度近視家系17個成員的DNA樣本（圖1）。家系中沒有女性患者，所有的男性患者在10歲以前都有近視史，近視度數(shù)從-5.25～-8.00 m-1不等。家系圖提示可能為X連鎖遺傳。先證者（M33022）表現(xiàn)出視乳頭周圍萎縮斑、視網(wǎng)膜變薄呈現(xiàn)豹紋狀眼底、可透見脈絡(luò)膜粗大血管、中心凹光反射消失等典型的高度近視眼底特征（圖2）。同時，先證者患有嚴(yán)重的弱視和眼球震顫，我們兩次檢測都無法獲得穩(wěn)定的視網(wǎng)膜電圖。先證者及家人沒有夜盲癥的臨床表現(xiàn)。除了M33029個體患有內(nèi)斜視外，其他受試者的視光檢查均正常（表1）。

圖1 X-連鎖遺傳高度近視家系的系譜結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 The pedigree structure of the family with X-linked high myopia

圖2 先證者（M33022）眼底照片F(xiàn)ig. 2 Fundus photographs of the proband (M33022)

表1 高度近視家系成員的臨床特征Tab. 1 Clinical features of the family members with high myopia

2.2 突變篩查結(jié)果

通過對先證者（M33022）進(jìn)行外顯子測序發(fā)現(xiàn)，位于Xp11.4上NYX基因2號外顯子790位點(diǎn)的A突變?yōu)門，該變異導(dǎo)致nyctalopin第264位的Asn突變?yōu)門yr。對家系成員進(jìn)行PCR測序，發(fā)現(xiàn)NYX基因c.790A＞T突變與家系中高度近視患者共分離（圖3）。同時，測序未發(fā)現(xiàn)其他已知高度近視致病基因在家系中共分離。對100例對照進(jìn)行PCR，然后測序，查詢1000Genomes、ESP6500和ExAc數(shù)據(jù)庫，排除該突變?yōu)橐阎猄NP。通過對人類、東非狒狒、普通狨猴等17個物種NYX基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)第264位的Asn在不同物種中都是保守的（圖4）。SIFT軟件預(yù)測p.N264Y是有害的，而polyphen-2軟件也預(yù)測其可能有害。因此，我們認(rèn)為NYX基因c.790A＞T（p.N264Y）的突變可能是導(dǎo)致這個家族高度近視的原因。

圖3 正常人、攜帶者和高度近視患者在NYX基因c.790A＞T位點(diǎn)的測序結(jié)果Fig. 3 Sequence of the region encompassing the NYX c.790A＞T mutation in unaffected individual, obligatory carrier, and affected individual

圖4 不同物種NYX基因編碼氨基酸序列比對Fig. 4 Multiple sequence alignment for the NYX amino acid sequence

3 討論

在該高度近視家系中，我們檢測出NYX基因的一個新突變c.790A＞T（p.N264Y），該突變在家系中與高度近視患者共分離。其中，M33016右眼近視度數(shù)為 -2.75 m-1，左眼近視度數(shù)為 -3.25 m-1，未達(dá)到高度近視的診斷標(biāo)準(zhǔn)，由于樣本采集時僅為6歲，推測其高度近視表型可能還未充分顯現(xiàn)。另外，M33030個體測序顯示其在該位點(diǎn)序列為野生型，樣本采集時年齡為13歲，但是他的右眼為 -4.00 m-1，左眼為 -3.75 m-1，屬于中度近視。據(jù)監(jiān)護(hù)人反映，該個體長期沉迷網(wǎng)絡(luò)游戲，這可能是其近視的主要原因。

NYX基因編碼的細(xì)胞表面蛋白具有11個連續(xù)的典型富含亮氨酸重復(fù)片段（leucine rich repeats，LRRs）［45-46］。p.N264Y突變位于第8個富含亮氨酸重復(fù)片段的第22個氨基酸，該氨基酸在17個物種中都是保守的。SIFT和polyphen-2軟件預(yù)測p.N264Y是有害變異。有研究報導(dǎo)，NYX基因c. 792C＞G突變引起的第264位Asn變?yōu)長ys與靜止性夜盲癥的發(fā)生有關(guān)［30］。多個報道表明，同一氨基酸突變?yōu)椴煌被岷罂梢鸩煌R床表型。例如：RHO基因p.G90D突變引起類似夜盲癥的癥狀，而p.G90V則表現(xiàn)為典型的視網(wǎng)膜色素變性［47-48］；FGFR3基因p.K650M的突變引起I型致死性異型增生，p.K650E突變引起Ⅱ型致死性異型增生，p.K650Q/N的突變則引起輕度的增生［49-51］。我們的研究表明，靜止性夜盲癥與高度近視之間存在復(fù)雜的關(guān)系，這有助于我們了解NYX基因型與表型的關(guān)系。

到目前為止，有3個研究涉及到6個NYX基因位點(diǎn)的突變與高度近視有關(guān)，分別是c.144C＞G［20］、c.572_573GC＞AA［20］、c.529_530GC＞AT［26，34］、c.626G＞C［34］、c.121delG［34］和 c.335T＞C［34］。c.144C＞G突變是在一個雙眼均近視-12.00 m-1的8歲男孩患者基因中發(fā)現(xiàn)的，c.572_573GC＞AA突變是在一個雙眼近視均為-6.50 m-1的46歲男性患者基因中發(fā)現(xiàn)的，c.529_530GC＞AT突變分別在一位46歲男性患者（右眼-10.50 m-1，左眼-9.00 m-1）和一位15歲男性患（右眼-21.00 m-1，左眼-20.00 m-1）中發(fā)現(xiàn)，c.626G＞C突變是在一個5歲小男孩患者（右眼-9.00 m-1，左眼-10.00 m-1）中發(fā)現(xiàn)的，c.121delG突變是在一位31歲男性高度近視患者（右眼-16.00 m-1，左眼-9.50 m-1）中發(fā)現(xiàn)的，c.335T＞C突變是在一位11歲的小男孩患者（右眼-10.00 m-1，左眼-11.00 m-1）中發(fā)現(xiàn)的。以上6個與高度近視相關(guān)的突變位點(diǎn)均在中國人群中發(fā)現(xiàn)，c.790A＞T也是在中國人群中發(fā)現(xiàn)的。這些研究結(jié)果表明，種族群體之間特定的遺傳變異在很大程度上導(dǎo)致了個體表型的差異［52］。

NYX基因c.790A＞T突變既沒有在100名無親緣關(guān)系的正常對照中檢測到，也沒有在相關(guān)的數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，說明該突變是罕見位點(diǎn)突變，是高度近視的危險因素。雖然生物信息學(xué)軟件也預(yù)測該位點(diǎn)的突變是有害的，但我們的研究尚缺乏試驗(yàn)證據(jù)證明該變異能夠引起蛋白質(zhì)功能的改變，需要進(jìn)一步的研究來闡明p.N264Y突變引起高度近視的作用機(jī)制，這也是我們下一步將繼續(xù)開展的工作。

本文在一個三代高度近視家系中發(fā)現(xiàn)了錯義突變的NYX基因c.790A＞T（p.N264Y），并且NYX蛋白質(zhì)第264位氨基酸的變化可導(dǎo)致不同的表型。該發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大了NYX基因的突變譜，為進(jìn)一步闡明其基因型-表型關(guān)系提供了有用的信息。