韓雙，張楠，王慧，張璇，楊金欒，張蔓琳，張志超

（沈陽化工大學(xué)理學(xué)院，遼寧 沈陽 110142）

引 言

金霉素（CTC）是一種四環(huán)素類抗生素，可以保護(hù)動物及促進(jìn)其生長或預(yù)防動物的寄生蟲、細(xì)菌感染，曾作為獸藥被廣泛添加到動物飼料中[1-8]。然而，大多數(shù)動物不能完全代謝CTC,部分CTC殘留在動物體內(nèi)或通過動物尿液和糞便被排出體外。這給自然環(huán)境和人類健康造成嚴(yán)重的不良影響[9-10]。雖然一些國家和地區(qū)已經(jīng)通過立法規(guī)范了CTC 的使用，但仍需要一種可靠、高效、簡單的方法來檢測食品和環(huán)境中的CTC殘留。

目前已有多種方法和技術(shù)來測定CTC，包括高效液相色譜-熒光檢測法[11-13]、高效液相色譜-紫外可見光譜檢測法[11]、高效液相色譜-化學(xué)發(fā)光檢測法[14]、液相色譜-質(zhì)譜檢測法[15-19]、液相色譜-二極管陣列檢測法[20-23]、液相色譜-電化學(xué)檢測法[24]、毛細(xì)管電泳法或毛細(xì)管電色譜-紫外可見光譜檢測法[25-26]、流動注射-安培檢測法[27]，以及熒光方法等[8,28]。雖然這些方法的檢出限較低，但它們通常需要大型儀器和復(fù)雜操作，對樣品的處理和對結(jié)果的分析需要很好的知識技能。鑒于電分析方法具有儀器小型、操作簡單、靈敏度高、成本低廉等優(yōu)點，研究人員設(shè)計了檢測CTC 的電化學(xué)傳感器，如氧化釕-氰化釕修飾玻碳電極(GCE)[24]、陽極化硼摻雜金剛石薄膜電極[27]、核殼結(jié)構(gòu)碳球@二氧化錳修飾GCE[29]、滴汞電極[30]等。但電化學(xué)傳感器對CTC 的選擇性檢測結(jié)果不是很令人滿意。

分子印跡技術(shù)對模板分子的形狀、大小和官能團(tuán)的記憶具有高度的選擇性與親和性[31-33]。合成分子印跡聚合物(MIPs)的方法有電聚合[34-35]、自組裝[36-37]、化學(xué)接枝[38-39]和光化學(xué)聚合等[40]。電化學(xué)分子印跡傳感器中分子印跡膜的構(gòu)建主要采用電聚合方法[41]。為了提高電化學(xué)傳感器的靈敏度，具有高電子遷移率和大比表面積的石墨烯及其復(fù)合材料被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)傳感器[42-46]。Atar 等[47]在還原型氧化石墨烯-金屬氧酸鹽-Pt 納米粒子復(fù)合材料修飾電極上，利用吡咯為功能單體，電聚合制備了桔青霉素分子印跡電化學(xué)傳感器。Yola 等[48]制備了Ag 納米粒子-2-氨基乙烷硫醇氧化石墨烯修飾電極，利用苯酚為功能單體，開發(fā)了酪氨酸分子印跡電化學(xué)傳感器。

本研究將構(gòu)建一種電化學(xué)分子印跡傳感器用于CTC 的檢測。以CTC 為模板分子，將鄰苯二胺電聚合在還原型氧化石墨烯-聚乙烯亞胺復(fù)合物(RGO-PEI)修飾的GCE 上，后將聚鄰苯二胺薄膜修飾電極浸入乙醇中洗脫除去模板分子CTC (圖1)。含有大量富電子氨基的支化PEI將通過共價鍵或物理吸附作用附著在氧化石墨烯上形成RGO-PEI 復(fù)合材料[49]。由于RGO-PEI 具有良好的電導(dǎo)率、高比表面積和富含電子的氨基，為聚鄰苯二胺分子印跡膜的穩(wěn)定性提供了強有力的平臺，提高了檢測CTC的靈敏度，將能快速高效地實現(xiàn)樣品中CTC 含量的測定。

圖1 CTC分子印跡電化學(xué)傳感器的構(gòu)建過程（鄰苯二胺電聚合反應(yīng)式和RGO-PEI反應(yīng)式）Fig.1 Schematic representation of the fabrication procedures of the CTC MIP sensor

1 實驗材料和方法

1.1 材料

石墨粉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%)購自Sigma-Aldrich 公司。聚乙烯亞胺(PEI，30%，樹枝狀，MW70000)購自阿法埃莎。鹽酸金霉素(CTC)、鹽酸多西環(huán)素(DOC)和鹽酸土霉素(OTC)購自阿拉丁實業(yè)有限公司。卡那霉素(Kana)購自西亞試劑公司。鄰苯二胺(o-PD)、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和氯化鉀購自國藥化學(xué)試劑有限公司。醋酸和無水醋酸鈉購自天津博迪化工有限公司。所有試劑均為分析純。利用磷酸、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配制磷酸鹽緩沖溶液。利用醋酸和無水醋酸鈉配制醋酸鹽緩沖溶液。所有溶液均用二次蒸餾水配制。

1.2 儀器

CHI660E 電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）。三電極系統(tǒng)：工作電極為玻碳電極（GCE，直徑5 mm），對電極為鉑片電極，參比電極為飽和甘汞電極。紅外光譜，NEXUS 470 紅外光譜儀(美國)；紫外可見光譜，UV-2550 分光光度計(日本島津公司)；掃描電子顯微鏡，XL-30 ESEM FEG(FEI COMPANYS,USA)；能 量 色 散X 射 線 光 譜 儀(EDX)，Oxfordinstruments X-Max(UK)。

1.3 RGO-PEI的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[50]方法合成了高純度的氧化石墨烯(GO)。為了合成RGO-PEI復(fù)合物，將1 ml 30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的PEI 水溶液與2 ml 水混合。向20 ml 水中加入2 mg GO，超聲混合30 min，得到均勻的黃褐色GO 溶液。將稀釋后的PEI溶液1 ml與上述GO 溶液混合，室溫下超聲30 min。然后在95℃下加熱攪拌2 h，離心，保留下層固體，干燥，得到RGO-PEI 復(fù)合物。

1.4 RGO-PEI復(fù)合物修飾電極的制備

先后用1.00、0.30、0.05 μm 氧化鋁粉末將GCE拋光至鏡面，分別在乙醇和水中超聲清洗電極，氮氣吹干。用移液槍移取10 μl 1 mg/ml RGO-PEI 溶液滴加在上述GCE 表面，室溫下晾干，得到RGOPEI復(fù)合物修飾電極(GCE/RGO-PEI)。

1.5 分子印跡傳感器和非分子印跡傳感器的制備

在GCE/RGO-PEI 表面電聚合分子印跡單體o-PD，生成聚鄰苯二胺(PPD)。具體做法如下：在含有5.0 mmol/Lo-PD 和1.0 mmol/L CTC 的醋酸鹽緩沖液(pH 4.8)中，以0.05 V/s的掃描速率，在0～0.8 V之間循環(huán)伏安掃描30 圈，制備分子印跡傳感器MIP GCE/RGO-PEI/PPD。電聚合后，MIP GCE/RGOPEI/PPD 在乙醇中浸泡10 min，從MIP 膜上洗脫除去CTC。

在不含有CTC 的5.0 mmol/Lo-PD 溶液中，相同電聚合條件下，制備非分子印跡傳感器NMIP GCE/RGO-PEI/PPD。

1.6 CTC的檢測

將洗脫后的MIP GCE/RGO-PEI/PPD 在不同濃度的CTC 標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸附10 min，取出電極并沖洗干凈，將電極浸入5.0 mmol/L K3Fe(CN)6/0.1 mol/L KCl 的探針溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃描速率為0.05 V/s。掃描結(jié)束后，該電極在乙醇中洗脫10 min以去除CTC，此后重復(fù)使用。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 GO和RGO-PEI的表征

2.1.1 SEM 表征 圖2 顯示了GO 和RGO-PEI 的SEM 圖像?？梢钥闯觯珿O 在結(jié)構(gòu)上是分層的。RGO-PEI 在結(jié)構(gòu)上也是分層的，片層上存在一些微小的顆粒，可能是附著的PEI。RGO-PEI 的EDX 光譜表明，在0.39 keV處存在對應(yīng)于N元素的Kα峰，這正是PEI的氨基對應(yīng)的N元素。

圖2 GO和RGO-PEI的SEM圖像及RGO-PEI的EDX圖像Fig.2 SEM images of GO and RGO-PEI and EDX image of RGO-PEI

2.1.2 紅外吸收光譜表征 圖3 為GO 和RGO-PEI的紅外吸收光譜圖。GO 具有高度的親水性，在3415 cm-1附近出現(xiàn)一個GO 醇羥基O—H 伸縮振動峰。GO 與PEI 反應(yīng)后，3415 cm-1附近的峰值明顯減弱，說明GO 被PEI 部分還原，PEI 分子覆蓋在還原后生成的RGO 表面。對于GO 來說，1721 cm-1、1374 cm-1和1165 cm-1處的幾個吸收帶可以分別歸屬于羧酸（或羰基）的C O 伸縮振動、羧酸的O—H變形振動和環(huán)氧基的C—O 伸縮振動[51-52]。GO 與PEI 反應(yīng)后，1721 cm-1處的特征帶幾乎完全消失，同時1374 cm-1（O—H）和1165 cm-1（C—O）處的兩個峰明顯減弱。GO 中1622 cm-1的強帶與未氧化的石墨骨架振動有關(guān)，它被1650 cm-1的強帶所取代，該強帶證明了酰胺的形成[50,53]。此外，RGO-PEI 出現(xiàn)了一個1561 cm-1的新帶（C—N 拉伸振動），證明了PEI與GO 形成共價鍵。紅外光譜的這些變化證實了PEI 存在于RGO 表面，其中一些是通過酰胺鍵與RGO表面共價連接的。

圖3 GO和RGO-PEI的紅外吸收光譜圖Fig.3 FTIR spectra of GO and RGO-PEI

2.1.3 紫外可見吸收光譜表征 如圖4 所示，GO 在231 nm處有一個特征吸收峰，為芳香族C C的π→π*躍遷；300 nm 處有一個弱的吸收峰，為C O 的n→π*躍遷。而RGO-PEI 的特征吸收峰則紅移到260 nm。這表明GO 被PEI 還原和共軛結(jié)構(gòu)的恢復(fù)[54-55]，與紅外的結(jié)果一致。

圖4 GO和RGO-PEI的紫外可見吸收光譜圖Fig.4 UV-Vis spectra of GO and RGO-PEI

2.2 在GCE/RGO-PEI 上電聚合o-PD 形成PPD薄膜

在含有CTC 模板劑和不含CTC 的條件下，采取o-PD 單體電聚合方法在pH4.8 的醋酸鹽緩沖溶液中分別制備了PPD 薄膜（圖5）。由于o-PD 的電氧化具有完全不可逆性，其氧化峰電流隨著循環(huán)伏安掃描圈數(shù)的增加而減少，表明電極表面形成了不良導(dǎo)電性的PPD 薄膜,即成功制備了MIP GCE/PEIRGO/PPD 傳感電極。當(dāng)掃描圈數(shù)接近30 圈時，o-PD氧化峰電流幾乎消失。研究表明，在不含CTC模板分子的情況下得到的循環(huán)伏安曲線與含有CTC模板分子的情況下的電聚合過程相似。

圖5 5.0 mmol/L o-PD在GCE/RGO-PEI修飾電極表面電聚合的循環(huán)伏安圖Fig.5 Cyclic voltammograms for the electropolymerization of 5.0 mmol/L o-PD on GCE/RGO-PEI in the presence(a)and in the absence(b)of CTC in pH4.8 acetate buffer(scan rate:0.050 V/s)

2.3 MIP GCE/PEI-RGO/PPD 的電化學(xué)表征

圖6 顯示了不同電極在5.0 mmol/L K3Fe(CN)6/0.1 mol/L KCl溶液中的循環(huán)伏安曲線。在GCE上觀察到一對明顯的K3[Fe(CN)6]可逆氧化還原峰(圖6a)。當(dāng)RGO-PEI 被修飾在GCE 表面后，由于RGO-PEI具有良好的導(dǎo)電性和較大的比表面積，K3[Fe(CN)6]的氧化還原峰電流增加(圖6b)。然而，在o-PD 電聚合到GCE/RGO-PEI 電極表面后，K3[Fe(CN)6]的氧化還原峰完全消失了(圖6c），表明通過電聚合形成了PPD 薄膜，這種薄膜阻止了K3[Fe(CN)6]擴(kuò)散到電極表面，阻礙了K3[Fe(CN)6]與電極表面的電子轉(zhuǎn)移。然而，在乙醇溶液中清洗MIP GCE/RGO-PEI/PPD后，K3[Fe(CN)6]峰電流強度增加了(圖6d），說明PPD薄膜中的模板分子CTC 被成功去除，形成了多孔薄膜，有利于K3[Fe(CN)6]的擴(kuò)散和隨后與底層電極的電子轉(zhuǎn)移。研究表明，將洗脫后的MIP GCE/RGOPEI/PPD 浸入CTC 溶液中，K3[Fe(CN)6]峰電流信號下降(圖6e）。這是因為CTC 進(jìn)入PPD MIP 薄膜中的空穴位置，阻礙了K3[Fe(CN)6]與電極表面的電子轉(zhuǎn)移從而導(dǎo)致K3[Fe(CN)6]峰電流下降。

圖6 不同電極在5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/0.1 mol/L KCl中的循環(huán)伏安圖Fig.6 Cyclic voltammograms of 5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/0.1 mol/L KCl on the bare GCE(a),GCE/RGO-PEI(b),GCE/RGO-

同時，研究了掃描速率對MIP GCE/RGO-PEI/PPD 的影響。如圖7 所示，隨著掃描速率從0.050 V/s 增大到0.50 V/s，K3[Fe(CN)6]的峰電流也隨之增加。如圖8所示，K3[Fe(CN)6]的峰電流與掃描速率成線性關(guān)系，線性回歸方程表示為I= - 292.38ν- 68.38（R=0.9981），表明這是一種典型的表面控制電化學(xué)行為。然而，K3[Fe(CN)6]的峰電位隨著掃描速率的增大而發(fā)生負(fù)向或正向移動。因此，在隨后的實驗中選擇0.050 V/s作為后續(xù)研究的掃描速率。

圖7 不同掃描速率下MIP GCE/RGO-PEI/PPD 在5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/0.1 mol/L KCl中的循環(huán)伏安圖Fig.7 Cyclic voltammograms of 5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/0.1 mol/L KCl on the MIP GCE/RGO-PEI/PPD at different scan rates

圖8 不同掃描速率與K3[Fe(CN)6]在MIP GCE/RGO-PEI/PPD上峰電流的關(guān)系曲線Fig.8 Relationship between the scan rate and peak currents

2.4 實驗條件優(yōu)化

2.4.1 電聚合圈數(shù)優(yōu)化 在制備MIP GCE/RGOPEI/PPD 的過程中，電聚合o-PD 循環(huán)伏安掃描圈數(shù)影響了電化學(xué)傳感器的靈敏度。為了獲得最優(yōu)電聚合掃描圈數(shù)，以不同的循環(huán)伏安掃描圈數(shù)制作電極。如圖9所示，響應(yīng)電流比值在30個圈數(shù)時達(dá)到最小。進(jìn)一步增加掃描圈數(shù)會導(dǎo)致過厚的PPD膜，影響電子轉(zhuǎn)移。因此，30 被選為后續(xù)電聚合的最佳圈數(shù)。

圖9 電聚合圈數(shù)的優(yōu)化Fig.9 Effect of the electropolymerization cycles on the peak

2.4.2 pH 優(yōu)化 磷酸鹽緩沖液的pH 對該傳感器檢測CTC有顯著影響。為了優(yōu)化pH，將該傳感器置于一系列pH 從4.0 到10.0 的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行測試。如圖10所示，傳感器對CTC 的響應(yīng)電流比值隨著pH 的增加而顯著增大，pH8.0 時達(dá)到最大，然后從pH8.0 到10.0 略有下降。這可能是由于在較低pH 時，CTC 和PPD 薄膜的氨基被酸化，導(dǎo)致它們之間靜電排斥，從而產(chǎn)生較小的電流響應(yīng)。在pH8.0時，CTC和PPD薄膜酸化強度減弱，這使靜電排斥力降到最低，導(dǎo)致了大的電流響應(yīng)。因此，在隨后的實驗中選擇了緩沖溶液pH 為8.0。

圖10 pH的優(yōu)化Fig.10 Effect of pH on the peak current of CV response in the presence of 5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/0.1 mol/L KCl(ΔI=I0-I)

2.4.3 洗脫時間優(yōu)化 為了獲得理想的靈敏度、選擇性和重現(xiàn)性，完全洗脫模板是非常重要的。圖11顯示了洗脫時間和響應(yīng)電流比值之間的關(guān)系。響應(yīng)電流比值隨著洗脫時間的延長而增加，并在洗脫時間超過10 min 后逐漸接近一個穩(wěn)定狀態(tài)。為了獲得更高的洗脫效率，選擇10 min 作為洗脫模板分子CTC的最佳時間。

圖11 洗脫時間的優(yōu)化Fig.11 Effect of elution time on the peak current of CV response in the presence of 5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/0.1 mol/L KCl(I′is the current of the GCE/RGO-PEI/PPD after electropolymerization)

2.4.4 吸附時間優(yōu)化 CTC的吸附時間也是該傳感器檢測的一個重要參數(shù)。將模板分子CTC 從PPD薄膜上洗脫之后，將MIP GCE/RGO-PEI/PPD 浸泡在待測CTC 溶液中吸附0 ～ 10 min。如圖12 所示，隨著吸附時間的延長，探針分子K3[Fe(CN)6]在MIP GCE/RGO-PEI/PPD 上的峰電流比值急劇下降，10 min 后趨于平穩(wěn)。這表明PPD 薄膜對CTC 分子的快速識別能力和高親和力。因此，選擇10 min 作為測定CTC的最佳吸附時間。

圖12 吸附時間的優(yōu)化Fig.12 Effect of incubation time on the peak current of CV response in the presence of 5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/0.1 mol/L KCl

2.5 MIP GCE/RGO-PEI/PPD 檢 測CTC 過 程分析

在優(yōu)化條件下，洗脫后的MIP GCE/RGO-PEI/PPD在不同濃度CTC標(biāo)準(zhǔn)溶液中進(jìn)行了吸附。如圖13所示，在0～100.0 μmol/L范圍內(nèi)，I隨著CTC濃度的增加而減小。圖14 顯示了ΔI與CTC 濃度的線性關(guān)系。這里，ΔI=I0-Ic，I0和Ic分別是CTC 濃度為0和c(μmol/L)時的電流。CTC 的線性回歸方程為ΔI=-9.32853-0.24939c（c的單位是μmol/L），回歸系 數(shù)（R）為0.99609。 CTC 的 檢 測 限 為0.167 μmol/L。

圖13 MIP GCE/RGO-PEI/PPD 在不同濃度CTC標(biāo)準(zhǔn)溶液中的線性掃描伏安圖Fig.13 Linear sweep voltammograms of 5.0 mmol/L

圖14 MIP GCE/RGO-PEI/PPD 檢測CTC的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.14 Linear calibration curve of ΔI with CTC concentrations

為了評估該分子印跡傳感器對CTC 的選擇性檢測和對其他抗生素的抗干擾能力，測試MIP GCE/RGO-PEI/PPD 對CTC、Kana、OTC 和DOC 存在下的響應(yīng)。如圖15所示，100.0 μmol/L Kana、100.0 μmol/L OTC 和100.0 μmol/L DOC 對25 μmol/L CTC 的測定影響不大。表明該傳感器對CTC 具有較好的選擇性，可以實現(xiàn)對CTC的特異性識別。

圖15 MIP GCE/RGO-PEI/PPD 對其他抗生素的抗干擾能力檢驗Fig.15 The the current change of MIP GCE/RGO-PEI/PPD in the presence of 5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/0.1 mol/L KCl after incubation in 25.0 μmol/L CTC,25.0 μmol/L CTC+100.0 μmol/L kanamycin,25.0 μmol/L CTC+100.0 μmol/L DOC,25.0 μmol/L CTC+100.0 μmol/L OTC(ΔI0=I0-ICTC;ΔI=I0-ICTC+others)

在最優(yōu)條件下，取一支MIP GCE/RGO-PEI/PPD電極對100.0 μmol/L CTC 溶液測定6 次，電流響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)約為2.78%。取8 支MIP GCE/RGO-PEI/PPD 電極檢測100.0 μmol/L CTC 溶液，結(jié)果顯示RSD 約為2.52%。這說明該印跡傳感器具有較好的重復(fù)使用性和制備重現(xiàn)性。

2.6 實際樣品檢測

為檢驗分子印跡傳感器在實際樣品中的應(yīng)用，對湖水進(jìn)行了CTC 加標(biāo)回收實驗。取湖水樣品，過濾，用0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖溶液調(diào)至pH8.0。用該湖水分別配制濃度為10.0 μmol/L 和50.0 μmol/L CTC 溶液進(jìn)行實驗。如表1 所示，實驗得到的回收率為102.7% ～ 104.7%，RSD 為1.22% ～ 2.49%。實驗表明，該分子印跡電化學(xué)傳感器對實際樣品中CTC的檢測是可行的。

表1 湖水樣品中CTC的回收實驗Table 1 Recoveries for CTC detection in lake samples

3 結(jié) 論

提出了利用分子印跡電化學(xué)方法對CTC 進(jìn)行高靈敏和選擇性檢測。電極最初由RGO-PEI 復(fù)合材料修飾，使電極具有良好的導(dǎo)電性、高表面積和豐富的氨基基團(tuán)。隨后，在模板分子CTC 存在下，通過電聚合在修飾電極上形成分子印跡聚合物PPD薄膜，制備了選擇性檢測CTC 的分子印跡電化學(xué)傳感器。所制備的傳感器對CTC 的檢測具有很好的線性范圍，對其他抗生素有很強的抗干擾能力，重現(xiàn)性好，能夠?qū)崿F(xiàn)對實際樣品的高靈敏高選擇性檢測。