周知子 李秀珍 徐愛晶 梅慧芬 林云婷 曾春華 毛曉健 饒敏 劉麗

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心遺傳與內(nèi)分泌科（廣州 510623）

青少年發(fā)病的成人型糖尿?。╩aturity-onset diabetes of the young，MODY）是一類具有高度遺傳異質(zhì)性的單基因遺傳病，常在25 歲前診斷。目前為止，根據(jù)致病基因分14 種亞型，其中由葡萄糖激酶（glucokinase，GCK）基因變異引起的MODY2（又稱GCK-MODY），呈常染色體顯性遺傳，是最常見的一種亞型［1］。歐洲流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示［2］MODY2 的患病率達(dá)1/1 000，國外多個研究顯示［3］MODY2 占MODY 的比例約為10%～60%。近期有研究指出［5］，MODY2 在中國成人糖尿病人群中的患病率約為1.3%［4］，約占MODY 的18.42%。目前對于中國兒童MODY2 的臨床特征了解甚少，缺乏GCK 基因型-臨床表型關(guān)系的研究，臨床醫(yī)生對本病認(rèn)識不足，誤診率、誤治率高，尤其是嬰兒期起病的患兒，早期識別并準(zhǔn)確診斷有助于制定合理、個性化的治療策略，減少過度醫(yī)療及不良反應(yīng)，進(jìn)而優(yōu)化家族中其他MODY2 患者的治療方案。本課題組此前報道［6］1 例男性患兒被誤診為1 型糖尿病，予胰島素治療半年后才確診為MODY2，為了提高對MODY2 兒童患者的診斷和管理水平，本文對近年來于廣州市婦女兒童醫(yī)療中心臨床診斷并經(jīng)基因確診的32 例MODY2 兒童進(jìn)行臨床特征分析與分子遺傳學(xué)研究。

1 資料與方法

1.1 研究對象2011年4月至2021年10月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心內(nèi)分泌科就診，臨床診斷為MODY2 的無癥狀高血糖兒童。MODY2 的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)國際青少年糖尿病協(xié)會（ISPAD）指南［7］：（1）無糖尿病癥狀，空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）5.5～8.3 mmol/L，糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c）≤7.5%；（2）胰島β 細(xì)胞自身抗體陰性；（3）父親或母親有糖尿病病史，但無臨床癥狀或高血糖引起的并發(fā)癥，輕度的FPG 升高（5.5～8.3 mmol/L）。32 例患兒分別來自30 個無血緣關(guān)系的家庭，父母非近親婚配，病例14、病例15 為同胞兄妹，病例25、病例27 為同胞兄弟。其中男19 例，女13 例，起病年齡1 d 至18 歲，29 例是在體檢時發(fā)現(xiàn)FPG 升高就診，3 例（病例11、病例15、病例27）因糖尿病家族史就診，6 例（病例1-3，病例13，病例28、29）在3 個月以內(nèi)起病。

所有病例均無高血糖癥狀，體格檢查均無明顯異常發(fā)現(xiàn)，無黑棘皮病，營養(yǎng)狀況正常，糖尿病自身抗體均陰性，均未發(fā)生過酮癥酸中毒。病例7在2 歲時出現(xiàn)癲癇，經(jīng)左乙拉西坦治療控制良好，其余情況良好。

1.2 臨床資料收集（1）臨床癥狀及體征；（2）實驗室檢查結(jié)果包括空腹血糖、糖化血紅蛋白、胰島素、C 肽、糖尿病自身抗體（谷氨酸脫羧酶抗體、抗蛋白酪氨酸磷酸酶抗體、抗胰島素抗體、抗胰島細(xì)胞抗體）；（3）治療及隨訪情況：從發(fā)現(xiàn)血糖升高起每3～6 個月隨訪1 次。每次隨訪記錄患兒自我末梢血糖監(jiān)測水平，檢測HbA1c。每1～2年禁食8 h后進(jìn)行OGTT，口服葡萄糖劑量為1.75 g/kg（最大75 g）。對所有患兒的父母親進(jìn)行FPG 和HbA1c檢測。

1.3 實驗室檢查（1）FPG 測定采用酶法測定；（2）HbA1c 采用乳膠免疫凝集抑制法測定（DCA 系統(tǒng)，西門子，德國埃朗根）；（3）胰島素、C 肽采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定（西門子，德國埃朗根）；（4）糖尿病自身抗體采用國際標(biāo)準(zhǔn)化放射配基受體結(jié)合法測定。

1.4 目的基因檢測在患兒監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書，并經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會討論通過后（批準(zhǔn)文號：2014-50），抽取患兒和父母外周抗凝血2 mL，采用美國QIAGEN 公司DNeasy Blood & Tissue Kit 試劑盒，提取全基因組DNA，設(shè)計引物擴(kuò)增GCK 基因（NM_000162.2），引物序列見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物外送至華大基因公司進(jìn)行Sanger 測序，測序結(jié)果與人類基因組變異數(shù)據(jù)庫（HGMD）和ClinVar 數(shù)據(jù)庫比對查新，確定變異。對于HGMD 未查找到的新發(fā)變異，利用SIFT、PolyPhen-2、Mutation Taster 和FATHMM 等在線工具預(yù)測致病性。對未找到GCK變異的患兒父母進(jìn)行染色體微陣列分析及全外顯子測序。從全血中提取全基因組DNA 后，外送基因公司，采用Illumina HiSeq X Ten 測序平臺進(jìn)行全外顯子組測序，使用BWA 等生物信息軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，評估測序質(zhì)量并生成單核苷酸變異報告，與SNP 數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫等進(jìn)行比對，獲得可疑的變異位點，根據(jù)遺傳模式確定疾病基因和變異位點。

表1 GCK 基因的引物序列Tab.1 Primer for amplification of GCK gene coding sequences

2 結(jié)果

2.1 一般資料及臨床表現(xiàn)32 例患兒FPG 輕度升高5.9～8.3 mmol/L，均值（6.7 ± 0.6）mmol/L，隨訪4～75 個月不等，血糖維持在（6.6 ± 0.69）mmol/L，不需要任何藥物干預(yù)。起病年齡≤6 個月的6 例患兒HbA1c 3.0%～5.8%，6個月以上的患兒HbA1c 5.0%～7.0%，所有患兒HbA1c均值（5.90±0.96）%，其中10 例HbA1c ≥6.5%或OGTT 2 h 血糖≥11.1 mmol/L，為糖尿病患兒，19 例患兒提示糖耐量受損。在27 例進(jìn)行了OGTT 試驗的患兒中，25 例OGTT 2 小時血糖增幅＜3.5 mmol/L，2 例（病例14、病例15）增幅＞3.5 mmol/L，分別為5.9 mmol/L 及3.8 mmol/L。31 例患兒（病例11 失訪）進(jìn)行了4～75 個月隨訪，其中13 例患兒進(jìn)行了OGTT 試驗，12 例2 h 血糖增幅＜3.5 mmol/L，1 例（病例9）隨訪時出現(xiàn)2 h 血糖增幅＞3.5 mmol/L，為4.6 mmol/L。見表2。

表2 32 例MODY2 患兒的臨床特征及隨訪Tab.2 Clinical features and Follow-up of 32 children with GCK-MODY

30 例攜帶GCK 基因變異的父母親FPG 輕度升高，均值（6.60 ± 0.43）mmol/L，HbA1c 正?；蜉p度升高，均值（6.60±0.33）%。

2.2 GCK 基因檢測結(jié)果32 例患兒共檢測到GCK 基因30 個不同的雜合子變異，包括20 個錯義變異，2 個剪接位點變異，1 個插入缺失變異，2 個無義變異及5 個移碼變異，其中5 個為新發(fā)變異［4，8-14］（表3）。對32 例患兒的父母親進(jìn)行基因檢測，其中30 例患兒父親或母親檢測到與先證者相同的變異，7 例遺傳自父親，23 例遺傳自母親。有2 例患兒（病例23 及病例26）父母通過Sanger 測序、染色體微陣列分析及全外顯子檢測均未找到GCK 基因變異及其他單基因糖尿病的已知染色體微缺失或致病變異，在血糖正常的父親或母親中未發(fā)現(xiàn)GCK 基因變異。

表3 32 例MODY2 患兒的GCK 基因變異特征Tab.3 Characteristics of GCK gene variation in 32 patients with MODY2

3 討論

GCK 是葡萄糖代謝中的關(guān)鍵酶，控制葡萄糖介導(dǎo)的胰島素分泌。GCK 基因在常染色體顯性遺傳模式下，雜合失活變異可導(dǎo)致MODY2，在常染色體隱性遺傳模式下，純合或復(fù)合雜合失活變異可導(dǎo)致永久性的新生兒糖尿?。?5］。國外文獻(xiàn)報道GCK 因雜合失活變異是兒童無癥狀偶發(fā)性高血糖的常見病因［16-17］。本研究對中國32 例MODY2 患兒及其父親/母親進(jìn)行臨床特征分析及分子遺傳學(xué)研究并隨訪，并對患兒的基因型-臨床表型關(guān)系進(jìn)行分析。MODY2 的典型特征是無癥狀的空腹高血糖，與常見的1 型或2 型糖尿病相比，MODY2并發(fā)癥少，常不需要藥物治療，無酮癥傾向，無胰島β 細(xì)胞特異性自身抗體或胰島素抵抗，目前確診依靠基因分析。

既往認(rèn)為MODY2 為青少年起病，但在本研究中，7 歲前起病的病例數(shù)占47%（15/32），其中6 例（19%）患兒3 個月以內(nèi)起病。病例2 生后診斷為新生兒糖尿病，3 個月大時口服格列苯脲治療，在1 歲4月齡時，行GCK 基因檢測確診MODY2，停用格列苯脲，停藥后隨訪62 個月，患兒FPG 和HbA1c穩(wěn)定在5.8～6.5 mmol/L和6.2%～6.7%。在2歲7月齡時OGTT 顯示FPG 受損，但2 h 血糖水平正常。病例28、29 出現(xiàn)時，筆者已對MODY2 有所認(rèn)識，因而在新生兒期即明確了診斷，避免了患兒進(jìn)行不必要的治療。病例29 生后因“宮內(nèi)感染”轉(zhuǎn)新生兒科住院，生后1 d 發(fā)現(xiàn)FPG 升高，住院期間監(jiān)測FPG 波動于6.6～7.4 mmol/L，餐后2 h 血糖波動于6.7～8.8 mmol/L，為本組診斷年齡最小病例。6 例患兒隨訪5～75 個月不等，隨訪監(jiān)測血糖穩(wěn)定。本研究表明，MODY2 的空腹高血糖出生時即可存在，在嬰幼兒期（包括新生兒期）出現(xiàn)持續(xù)的輕度高血糖要注意MODY2 的可能，這與RUDLAND［18］報道的相一致。

通常MODY2 患者FPG 在5.4～8.3 mmol/L 之間［19］，典型的≥40 歲MODY2 患者HbA1c 在5.9%～7.6%之間［20］。本組研究中患病的父親/母親FPG在5.9～7.8 mmol/L 之間，HbA1c 在5.9%～7.3%之間，未予藥物治療下未發(fā)現(xiàn)與糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥。OGTT 2 h 血糖增量＜3.5 mmol/L 是MODY2 與其他類型MODY 區(qū)別的特征之一［21］，但由于OGTT變異較大，當(dāng)增量＞3.5 mmol/L 時也不能完全排除MODY2［22］。這一觀點在本研究中也得到了驗證，本組病例中除病例14、15 外，其余病例確診時OGTT 2 h 血糖增高幅度均＜3.5 mmol/L，13 例隨訪時進(jìn)行了OGTT試驗，除病例9外增幅均＜3.5 mmol/L。

2 型糖尿病在中國的患病率很高，而且很多2 型糖尿病的兒童并不肥胖［23］，根據(jù)臨床特征難以有效區(qū)分非肥胖的兒童2 型糖尿病前期階段和MODY2，因此對該部分兒童進(jìn)行GCK 基因分析非常必要。

HGMD 專業(yè)版數(shù)據(jù)庫目前收錄已報道GCK 基因變異976 種（http：//www.hgmd.cf.ac.uk），包含錯義、無義、移碼、插入缺失、重復(fù)和剪接位點變異。本研究中家族中所有發(fā)生了GCK 基因變異的父親/母親均有輕度糖尿病或血糖升高，而非糖尿病或血糖正常親屬中則沒有檢測到GCK 基因變異。GCK 基因變異廣泛分布于9 個外顯子（除1 號外顯子外），未發(fā)現(xiàn)熱點變異，變異類型以錯義變異最常見（67%），其他變異類型包括剪接（7%）、插入缺失（3%）、無義（7%）和移碼（16%），每種變異所導(dǎo)致的臨床表型無明顯差異，與STRIDE 等［21］報道一致。

本研究發(fā)現(xiàn)5種新發(fā)變異，c.934delG（p.E312Kfs*41）、c.197delC（p.Pro66Glnfs*21）、c.1175G＞T（p.Arg392Leu）、c.902T＞C（p.Leu301Pro）、c.1165G＞T（p.Val389Phe），通過在線生物信息學(xué)工具預(yù)測判定為致病性變異。c.934delG、c.197delC 兩個移碼變異使終止密碼子提前，導(dǎo)致GCK 基因編碼蛋白縮短，其缺失位點包括了GCK 與葡萄糖及ATP相結(jié)合的氨基酸位點。與c.1165G＞T 同一位點的c.1165G＞C（p.Val389Leu）變異為已知致病變異［24］，可導(dǎo)致酶活性及穩(wěn)定性的降低。

目前診斷MODY2 的標(biāo)準(zhǔn)均包含家族史［7，25］，MODY2 自發(fā)變異概率很低，本組病例中發(fā)現(xiàn)兩例自發(fā)變異病例（病例23、26），兩例病例均是在體檢中發(fā)現(xiàn)FPG 升高，在對其父母進(jìn)行家系分析時，卻未找到與先證者一致的變異位點，隨后對患兒父母進(jìn)行了染色體微陣列分析及全外顯子檢測，均未發(fā)現(xiàn)其他單基因糖尿病的已知染色體微缺失或致病變異，LOPEZ 等［26］也曾報道，在14 例GCK基因變異的MODY2 患者中發(fā)現(xiàn)2 例自發(fā)變異。因此對臨床表現(xiàn)和實驗室結(jié)果高度提示MODY2 的患者即使沒有家族史，也應(yīng)進(jìn)行GCK 基因分析，否則將造成漏診。

對于MODY2 患兒不需藥物干預(yù)，藥物治療對降低血糖或HbA1c 無效，長期隨訪觀察沒有增加長期糖尿病相關(guān)的微血管和大血管并發(fā)癥的風(fēng)險［19］，對該部分患兒只需定期隨訪，但他們與普通人群一樣，有患1 型和2 型糖尿病的風(fēng)險，如果出現(xiàn)新的潛在臨床特征，就需要進(jìn)行重新評估和研究?；虼_診有助于預(yù)測臨床病程和長期預(yù)后，制定合理的治療方案。本組研究中有16 例患兒父親/母親發(fā)現(xiàn)血糖升高后曾使用不同的降糖藥物治療，經(jīng)基因確診MODY2 后，予停止了不必要的降糖藥物治療，隨訪過程中血糖維持穩(wěn)定，既減少了治療費用，也為患者及其家庭減輕負(fù)擔(dān)及心理壓力。

本組研究是目前中國關(guān)于MODY2 患兒樣本量最大、隨訪時間最長的研究，拓展了中國人群MODY2 兒童患者的表型譜及GCK 基因變異譜。本研究發(fā)現(xiàn)中國MODY2 患兒臨床特征與國外報道基本一致，進(jìn)一步證實了MODY2 生后即可出現(xiàn)空腹血糖升高，對于無家族史但臨床高度提示MODY2 的患兒也應(yīng)進(jìn)行GCK 基因分析。本文中沒有將MODY2 患兒的臨床特點與其他類型MODY 進(jìn)行對比，未來將完善這項工作，并對自發(fā)變異的MODY2 患兒的致病機(jī)制及中國人群MODY2患兒的代謝特征進(jìn)行進(jìn)一步的研究。