王 婷，梁艷妮，侯寶龍，吳柯楠，吳冬芝，裴 剛，王 征*

1陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育)陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，咸陽 712083；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙 410208

白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草(HedyotisdiffusaWilld)的干燥全草[1]，其性寒，味苦、甘淡，歸心、肝、脾、大腸經(jīng)，全草入藥，主要分布于我國廣西、福建、安徽、云南等地區(qū)。研究報(bào)道白花蛇舌草含有環(huán)烯醚萜類、含酸化合物、蒽醌類化合物、揮發(fā)性成份、苯丙素類、香豆素及多糖類等幾十種化合物，還有多種微量元素[2]，具有抗腫瘤[3]、消炎抗菌[4]、抗氧化[5]、增強(qiáng)免疫力[6]等多種藥理活性。在中藥抗腫瘤復(fù)方治療中白花蛇舌草為常見藥材，其抗腫瘤活性包括抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和腫瘤血管生成、調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)以及保護(hù)性自噬[7]，被廣泛應(yīng)用于消化系統(tǒng)腫瘤、生殖系統(tǒng)腫瘤、呼吸系統(tǒng)腫瘤、骨髓瘤等多種抗癌治療[8]。白花蛇舌草中主要的抗腫瘤成分為熊果酸和齊墩果酸，熊果酸抗腫瘤機(jī)制是通過觸發(fā)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯以及通過各種分子靶點(diǎn)和信號通路發(fā)揮抗轉(zhuǎn)移和抗血管生成特性來抑制乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系的生長[9]，齊墩果酸則是通過多個(gè)作用靶點(diǎn)同時(shí)調(diào)控不同信號通路與生物學(xué)過程從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中包括細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平、NF-κB信號通路、Notch信號通路、JAK/STAT3信號通路以及核糖聚合酶的表達(dá)等[10]。近年來諸多學(xué)者對白花蛇舌草的化學(xué)成分及藥理作用進(jìn)行大量研究，針對其不同部位不斷分離出新的化合物白花蛇舌草的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。截至目前，從白花蛇舌草中已經(jīng)分離得到了171種化合物，包括32種環(huán)烯醚萜類化合物[11]、26種黃酮類化合物[12]、24種蒽醌類化合物[13]、26種酚類化合物及其衍生物[14]和50種揮發(fā)油類化合物[15]，這些植物化學(xué)物質(zhì)和提取物具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抑制成纖維細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)免疫功能和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等作用。本實(shí)驗(yàn)將對白花蛇舌草氯仿部位和乙酸乙酯部位進(jìn)行分離純化，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來檢測白花蛇舌草不同極性部位抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

電子分析天平(梅特勒托利多儀器公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)；循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；FL-HO50G型制備型液相(天津博納艾杰爾科技有限公司)；薄層色譜硅膠GF254(青島海洋化工有限公司)；柱色譜硅膠(200～300目、300～400目，青島海洋化工有限公司)；葡聚糖凝膠 Sephadex LH-20(Pharmacia 公司)；精密電子天平(METTLER TOLEDO)；超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；倒置顯微鏡(Motic公司)；低速冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司)；超低溫冰箱(美菱公司)；酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)；甲醇、乙酸乙酯、乙醇、二氯甲烷(均為分析純，天津恒興試劑有限公司)；氘代三氯甲烷、氘代甲醇(CIL公司)；制備型甲醇(美國TEDIA公司)；純凈水(華潤怡寶飲料有限公司)；順鉑(Sigma公司)；白花蛇舌草于2017年10月購自于湖南福泰中藥飲片有限公司，人肺癌細(xì)胞A549 購于中科院干細(xì)胞庫。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 化學(xué)成分的提取

取白花蛇舌草全草7 kg粉碎，加入10倍量80%乙醇回流提取2次，每次提取1.5 h，減壓濃縮提取液。濃縮后的提取液依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各部分萃取液濃縮，回收溶劑，加熱干燥，得白花蛇舌草石油醚部位浸膏、氯仿部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏、正丁醇部位浸膏。其中白花蛇舌草氯仿部位浸膏約為86.99 g，乙酸乙酯部位浸膏約為41 g。

1.2.2 白花蛇舌草氯仿部位分離純化

取白花蛇舌草氯仿部位(86.99 g)進(jìn)行硅膠(200～300目)柱色譜分離，采用二氯甲烷-甲醇(100∶1→0∶100)梯度洗脫，薄層色譜檢測合并相同流分，得到7個(gè)不同流分(Fr.1～Fr.7)。Fr.1(1.3 g)經(jīng)硅膠(200～300目)柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(50∶1→0∶1)為流動相梯度洗脫分離，得到10個(gè)流分(Fr.1-A～Fr.1-J)。Fr.1-B濃縮后有白色固體析出，用石油醚和乙酸乙酯多次重結(jié)晶得到化合物1(4.8 mg)。Fr.2(9.7 g)經(jīng)硅膠(200～300目)柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(10∶1→0∶1)為流動相梯度洗脫分離，得到18個(gè)流分(Fr.2-A～Fr.2-R)。Fr.2-E通過硅膠(200～300目)柱色譜分離純化，石油醚-乙酸乙酯(10∶1)為流動相，重結(jié)晶得到化合物2(7.3 mg)。Fr.2-H通過硅膠(200～300目)柱色譜分離純化，石油醚-乙酸乙酯(9∶1)為流動相，重結(jié)晶得到化合物3(5.3 mg)。Fr.2-I(90 mg)通過硅膠(200～300目)柱色譜分離純化，石油醚-乙酸乙酯(4∶1)為流動相梯度洗脫收集流分，得到14個(gè)次級流分(Fr.2-I-a—Fr.2-I-n)。Fr.2-I-h(130 mg)經(jīng)石油醚-乙酸乙酯(32∶1→28∶1)梯度洗脫，再通過Sephadex LH-20，以二氯甲烷-甲醇(1∶1)為流動相進(jìn)行純化，得到化合物4(6.7 mg)。Fr.3(20.06 g)經(jīng)硅膠(200～300目)柱色譜，以二氯甲烷-甲醇(100∶1→0∶100)為流動相梯度洗脫分離，得到10個(gè)流分(Fr.3-A～Fr.3-J)。Fr.3-C(7.87 g)經(jīng)硅膠(200～300目)層析分離，以石油醚-乙酸乙酯(10∶1→0∶1)為洗脫劑，進(jìn)行梯度洗脫得到20個(gè)次級流分(Fr.3-C-a～Fr.3-C-t)。Fr.3-C-e經(jīng)多次重結(jié)晶得到白色粉末，即為化合物5(40 mg)。Fr.3-C-l(0.97 g)通過硅膠(300～400目)層析分離，流動相為石油醚-乙酸乙酯(10∶1)梯度洗脫，得到9個(gè)次級流分(Fr.3-C-l-Ⅰ～FFr.3-C-l-Ⅸ)。Fr.3-C-l-Ⅲ分離純化后析出固體，重結(jié)晶得到化合物6(3.5 mg)。Fr.3-C-g通過Sephadex LH-20(二氯甲烷∶甲醇=1∶1洗脫)色譜柱、FL-HO50G制備型液相色譜系統(tǒng)(制備甲醇∶水梯度洗脫，100∶0→85∶15)進(jìn)行分離純化，得到化合物7(3.1 mg)。Fr.4(18.56 g)經(jīng)硅膠(200～300目)層析分離，二氯甲烷-甲醇(80∶1→0∶100)為流動相梯度洗脫，得到14個(gè)流分(Fr.4-A～Fr.4.N)。Fr.4-N有白色粉末析出，用氯仿和甲醇多次重結(jié)晶得到化合物8(7.2 mg)。

1.2.3 白花蛇舌草乙酸乙酯部位分離純化

取白花蛇舌草乙酸乙酯部位(41 g)進(jìn)行硅膠(200～300目)柱色譜分離，以二氯甲烷和甲醇(100∶0→0∶100)為流動相梯度洗脫，得到9個(gè)不同流分(Fr.1～Fr.9)。Fr.2(63 mg)經(jīng)硅膠(300～400目)層析分離，用石油醚和乙酸乙酯(30∶1→0∶1)為流動相梯度洗脫得到12個(gè)流分(Fr.2-A～Fr.2-L)。Fr.2-G通過硅膠(300～400目)柱色譜分離純化，流動相為石油醚-乙酸乙酯(26∶1)，重結(jié)晶得到化合物9(3.8 mg)。Fr.3(1.32 g)經(jīng)硅膠(300～400目)層析柱，石油醚和乙酸乙酯(30∶1→0∶1)為洗脫劑，梯度洗脫得到12個(gè)流分(Fr.3-A～Fr.3-L)。Fr.3-H通過Sephadex LH-20[二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫]進(jìn)行分離純化，得到化合物10(4.3 mg)。Fr.3-J 通過Sephadex LH-20[二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫]分離純化，得到化合物11(5 mg)。Fr.4(5.7 g)用硅膠(300～400目)層析柱，以石油醚和乙酸乙酯(25∶1→0∶1)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，得到12個(gè)流分(Fr.4-A—Fr.4-L)。Fr.4-L(2.77 g)通過硅膠(300～400目)層析柱，用石油醚-乙酸乙酯(10∶1→0∶1)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，得到6個(gè)次級流分(Fr.4-L-a～Fr.4-L-f)。Fr.4-L-d有明顯的黃色固體，經(jīng)多次重結(jié)晶得到化合物12(8.8 mg)。Fr.8(4.68 g)通過硅膠(300～400目)層析柱，用石油醚-乙酸乙酯(1∶0→0∶1)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，得到8個(gè)流分(Fr.8-A～Fr.8-H)。Fr.8-E(2.03 g)通過硅膠柱色譜分離純化，流動相為乙酸乙酯-甲醇(0∶1→0∶1)，梯度洗脫得到11個(gè)次級流分(Fr.8-E-a～Fr.8-E-k)。Fr.8-E-e通過Sephadex LH-20進(jìn)行分離純化，流動相為二氯甲烷-甲醇(1∶1)，得到化合物13(3.3 mg)。

1.3 CCK8法檢測白花蛇舌草化學(xué)成分對肺癌細(xì)胞A549增殖作用的影響

取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，將密度調(diào)制成5×104個(gè)/mL，接種于96孔板，用含有10%胎牛血清和1%雙抗的F-12K培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)體積為200 μL。把實(shí)驗(yàn)分為2組：正常組(細(xì)胞+培養(yǎng)基)，給藥組(加入6個(gè)濃度的白花蛇舌草氯仿部位和乙酸乙酯部位提取物溶液，使其在培養(yǎng)液中最終濃度為12.5、25、50、100、200、400 μg/mL，細(xì)胞篩選過程是將藥物終濃度設(shè)定為100 μmol/L，測定IC50實(shí)驗(yàn)過程是將濃度設(shè)定為1、4、8、12、16、20 μmol/L)。藥物刺激24 h后去掉培養(yǎng)基，100 μL PBS清洗1次，而后加入用F-12K培養(yǎng)基新鮮制備的不同濃度的藥物100 μL刺激細(xì)胞，CCK8 10 μL，繼續(xù)置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，取出96孔板，在酶標(biāo)儀上讀取450 nm下的各孔吸光度值，以此反映藥物對細(xì)胞的毒性作用。根據(jù)以下公式計(jì)算出細(xì)胞抑制率。

細(xì)胞抑制率=(A空白-A藥物)/A空白×100%

式中：A空白：具有細(xì)胞、CCK8溶液而沒有藥物的吸光度值；A藥物：具有細(xì)胞、CCK8和藥物的吸光度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色粉末；mp.37～40 ℃；ESI-MS：m/z481[M+H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：4.08(2H，t，J=7.0 Hz，H-1′)，2.31(2H，t，J=6.5 Hz，H-2)，1.64(4H，m，H-14，H-16′)，1.28(50H，m，H-2～H-12，H-2′～H-15′)，0.90(6H，t，J=7.5 Hz，H-15，H-17′)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：74.3(C-1)，34.4(C-2)，25.9(C-3)，29.2(C-4)，29.7(C-5)，31.9(C-6)，31.9(C-7)，31.9(C-8)，31.9(C-9)，31.9(C-10)，31.9(C-11)，29.7(C-12)，28.6(C-13)，22.7(C-14)，14.1(C-15)，64.5(C-1′)，29.3(C-2′)，25.0(C-3′)，29.7(C-4′)，31.9(C-5′)，31.9(C-6′)，31.9(C-7′)，31.9(C-8′)，31.9(C-9′)，31.9(C-10′)，31.9(C-11′)，31.9(C-12′)，31.9(C-13′)，29.7(C-14′)，28.6(C-15′)，22.7(C-16′)，14.1(C-17′)，174.3(COO)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物1為十五酸十七酯。

化合物2白色針晶；mp.170～175 ℃；ESI-MS：m/z413[M+H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.35(1H，dd，J=9.8，5.3 Hz，H-6)，5.14(1H，d，J=6.6 Hz，H-22)，5.03(1H，d，J=6.6 Hz，H-23)，3.52(1H，m，H-3)，1.01(3H，s，H-19)，0.93(6H，d，J=6.9 Hz，H-26，27)，0.90(3H，d，J=6.6 Hz，H-29)，0.82(3H，d，J=6.8 Hz，H-21)，0.68(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：37.3(C-1)，31.7(C-2)，71.8(C-3)，42.3(C-4)，140.8(C-5)，121.7(C-6)，28.9(C-7)，31.9(C-8，C-25)，50.2(C-9)，36.5(C-10)，21.1(C-11，C-26)，39.7(C-12)，42.2(C-13)，56.9(C-14)，24.4(C-15)，28.3(C-16)，56.0(C-17)，12.1(C-18)，19.4(C-19)，40.5(C-20)，21.2(C-21)，138.3(C-22)，129.3(C-23)，51.3(C-24)，14.1(C-27)，25.4(C-28)，12.3(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物2為豆甾醇。

化合物3黃色針狀的結(jié)晶；mp.280～281 ℃；ESI-MS：m/z269[M+H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：8.29(2H，m，H-5，8)，8.18(1H，d，J=8.6 Hz，H-4)，7.79(2H，m，H-6，7)，7.68(1H，d，J=7.8 Hz，H-3)，4.06(3H，s，OCH3)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：146.0(C-1)，153.8(C-2)，126.5(C-3)，127.0(C-4)，126.8(C-5)，133.7(C-6)，133.8(C-7)，134.5(C-8)，182.5(C-9)，182.6(C-10)，123.5(C-4a)，131.4(C-8a)，126.7(C-9a)，132.9(C-10a)，16.4(7-CH3)，62.2(8-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物3為2-羥基-1-甲氧基-3-甲基蒽醌。

化合物4黃色晶形；mp.>300 ℃；ESI-MS：m/z269[M+H]+；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：8.06(1H，d，J=8.5 Hz，H-5)，8.03(1H，d，J=8.5 Hz，H-4)，7.92(1H，br s，H-1)，7.68(1H，br d，H-3)，7.47(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，7.23(1H，dd，J=8.5，2.4 Hz，H-6)，2.54(3H，s，H-11)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：128.0(C-1)，146.5(C-2)，135.3(C-3)，127.9(C-4)，130.8(C-5)，122.0(C-6)，164.3(C-7)，113.4(C-8)，184.2(C-9)，183.5(C-10)，21.9(C-11)，132.3(C-4a)，136.8(C-8a)，134.6(C-9a)，126.8(C-10a)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物4為7-hydroxytectoquinone。

化合物5白色粉末；Mp.288～293 ℃；ESI-MS：m/z479[M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：11.96(1H，s，COOH)，5.13(1H，s，H-12)，4.30(1H，d，J=4.9 Hz，OH)，3.34(1H，d，J=6.3 Hz，H-3)，2.11(1H，d，J=11.3 Hz，H-18)，1.61(2H，m，H-2)，1.24(4H，s，H-1，H-7)，0.86(1H，d，J=6.2 Hz，H-5)，0.82(1H，d，J=6.4 Hz，H-9)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：36.9(C-1)，24.2(C-2)，77.3(C-3)，38.8(C-4)，55.2(C-5)，18.4(C-6)，33.2(C-7)，40.4(C-8)，47.5(C-9)，28.7(C-10)，23.3(C-11)，125.0(C-12)，138.7(C-13)，42.1(C-14)，28.0(C-15)，23.7(C-16)，47.3(C-17)，52.8(C-18)，38.7(C-19)，39.4(C-20)，30.6(C-21)，36.8(C-22)，27.4(C-23)，16.5(C-24)，15.7(C-25)，17.5(C-26)，23.7(C-27)，178.8(C-28)，17.4(C-29)，21.5(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物5為熊果酸。

化合物6白色針狀結(jié)晶；mp.>300 ℃；ESI-MS：m/z457[M+H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.29(1H，br s，H-12)，3.21(1H，m，H-3)，1.27(3H，s，H-27)，1.22(3H，s，H-26)，1.08(3H，s，H-25)，1.01(3H，s，H-23)，0.97(3H，s，H-24)，0.91(3H，s，H-29)，0.86(3H，s，H-30)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：38.4(C-1)，27.1(C-2)，79.0(C-3)，38.7(C-4)，55.2(C-5)，18.3(C-6)，32.6(C-7)，39.2(C-8)，47.6(C-9)，37.0(C-10)，22.9(C-11)，122.6(C-12)，143.5(C-13)，41.6(C-14)，27.6(C-15)，23.4(C-16)，46.4(C-17)，41.0(C-18)，45.8(C-19)，30.6(C-20)，33.7(C-21)，32.4(C-22)，28.1(C-23)，(C-24)，15.3(C-25)，17.1(C-26)，25.9(C-27)，181.7(C-28)，33.0(C-29)，23.5(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物6為齊墩果酸。

化合物7黃色粉末；mp.290～295 ℃；ESI-MS：m/z281[M+H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：13.1(1H，s，H-1)，8.35～8.26(1H，m，H-4)，7.83(1H，m，H-5)，7.76(1H，m，H-6)，7.78(1H，d，J=8.2 Hz，H-2)，7.54(1H，d，J=8.2 Hz，H-3)，2.77(2H，t，J=7.7 Hz，H-11)，1.71～1.40(2H，m，H-12)，1.29～1.13(2H，m，H-13)，0.96(3H，t，J=7.4 Hz，H-14)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：132.5(C-1)，136.4(C-2)，134.7(C-3)，127.5(C-4)，133.1(C-5)，119.5(C-6)，160.2(C-7)，126.9(C-8)，189.1(C-9)，182.2(C-10)，60.8(C-11)，31.9(C-12)，29.7(C-13)，22.7(C-14)，133.7(C-4a)，134.8(C-8a)，134.2(C-9a)，126.9(C-10a)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物7為2-butyl-1-hydroxyanthra-9,10-quinone。

化合物8白色粉末；mp.285～290 ℃；ESI-MS：m/z456[M]+；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：4.97(1H，d，J=2.5 Hz，H-19)，4.80(1H，s，H-28)，3.56(1H，m，H-3)，3.48(1H，t，J=8.2 Hz，H-16)，2.74(1H，m，H-17)，2.66(1H，m，H-5)，2.23(2H，m，H-6)，1.84(3H，s，H-29)，1.25(3H，s，H-26)，1.10(3H，s，H-25)，1.08(3H，s，H-24)，1.05(3H，s，H-22)，0.85(3H，s，H-23)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：38.7(C-1)，27.4(C-2)，79.04(C-3)，40.75(C-4)，55.39(C-5)，8.31(C-6)，34.3(C-7)，38.8(C-8)，50.5(C-9)，37.2(C-10)，20.8(C-11)，25.5(C-12)，38.4(C-13)，42.4(C-14)，29.7(C-15)，32.1(C-16)，56.3(C-17)，46.9(C-18)，49.32(C-19)，150.4(C-20)，30.6(C-21)，37.0(C-22)，28.0(C-23)，5.3(C-24)，16.1(C-25)，16.0(C-26)，14.7(C-27)，180.9(C-28)，109.6(C-29)，19.3(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物8為白樺脂酸。

化合物9黃色粉末；mp.195～197 ℃；ESI-MS：m/z611[M+H]+；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：12.59(5-OH)，10.82(7-OH)，9.66(4′-OH)，9.17(3′-OH)，7.54(1H，d，J=6.1 Hz，H-6′)，6.82(1H，d，J=7.8 Hz，H-5′)，6.38(1H，s，H-8)，6.18(1H，s，H-6)，5.07(1H，d，J=6.3 Hz，H-1′′)，4.52(1H，s，H-1′′′)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：156.8(C-2)，133.7(C-3)，177.8(C-4)，161.6(C-5)，99.1(C-6)，164.5(C-7)，94.0(C-8)，157.0(C-9)，104.4(C-10)，121.4(C-1′)，115.5(C-2′)，145.1(C-3′)，148.8(C-4′)，116.7(C-5′)，121.6(C-6′)，101.6(C-1′′)，74.5(C-2′′)，76.8(C-3′′)，68.6(C-4′′)，76.3(C-5′′)，67.4(C-6′′)，101.1(C-1′′′)，70.8(C-2′′′)，70.4(C-3′′′)，71.0(C-4′′′)，68.2(C-5′′′)，18.2(C-6′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物9為蘆丁。

化合物10黃色粉末；mp.>300 ℃；ESI-MS：m/z303[M+H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.73(1H，d，J=2.1 Hz，H-2′)，7.62(1H，dd，J=8.4，2.1 Hz，H-6′)，6.87(1H，d，J=9.6 Hz，H-5′)，6.37(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.17(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：148.7(C-2)，137.2(C-3)，177.2(C-4)，162.4(C-5)，99.2(C-6)，165.5(C-7)，94.3(C-8)，157.0(C-9)，104.5(C-10)，124.1(C-1′)，115.9(C-2′)，146.1(C-3′)，47.9(C-4′)，116.2(C-5′)，121.6(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物10為槲皮素。

化合物11白色無定形粉末；mp.220～223 ℃；ESI-MS：m/z165[M+H]+；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.58(1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，7.44(2H，d，J=8.8 Hz，H-2，H-6)，6.80(2H，d，J=8.8 Hz，H-3，H-5)，6.26(1H，d，J=15.9 Hz，H-8)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：127.2(C-1)，116.7(C-2，6)，115.5(C-3，5)，161.1(C-4)，146.6(C-7)，131.0(C-8)，171.0(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物11為反式對羥基肉桂酸。

化合物12白色無定形粉末；mp.175～180 ℃；ESI-MS：m/z179[M+H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.78(1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，7.54(2H，d，J=8.7 Hz，H-2，H-6)，6.94(2H，d，J=8.7 Hz，H-3，H-5)，6.36(1H，d，J=15.9 Hz，H-8)，3.52(3H，s，OCH3)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：126.9(C-1)，114.7(C-2，6)，114.5(C-3，5)，161.8(C-4)，146.8(C-7)，130.2(C-8)，172.1(C-9)，55.5(4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)[26]相符，鑒定化合物12為反式對甲氧基肉桂酸。

化合物13黃色粉末；mp.280～282 ℃；ESI-MS：m/z287[M+H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：8.08(2H，d，J=9.0 Hz，H-2′，H-6′)，6.90(2H，d，J=9.0 Hz，H-3′，H-5′)，6.39(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.17(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：148.0(C-2)，137.1(C-3)，177.4(C-4)，162.5(C-5)，99.2(C-6)，165.6(C-7)，94.4(C-8)，158.3(C-9)，104.5(C-10)，123.7(C-1′)，115.9(C-2′)，116.3(C-3′，5′)，160.6(C-4′)，130.6(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)[27]相符，鑒定化合物13為山奈酚。

化合物1～13結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1～13的結(jié)構(gòu)

2.2 體外抗腫瘤活性測試

2.2.1 白花蛇舌草不同極性部位對A549細(xì)胞增殖抑制作用

給藥作用24 h后，采用CCK8法檢測白花蛇舌草氯仿部位及乙酸乙酯部位對A549細(xì)胞增殖的影響(順鉑為陽性藥對照)結(jié)果見表1。結(jié)果表明，氯仿部位及乙酸乙酯部位均對A549細(xì)胞有明顯的抑制作用，且存在量效關(guān)系，其IC50值分別為150.73、243.70 μg/mL。當(dāng)藥物濃度從25 μmol/L升至400 μmol/L，氯仿部位和乙酸乙酯部位對A549的細(xì)胞增殖抑制率分別從12.9%、43.32%達(dá)到80.49%、63.74%。

表1 白花蛇舌草不同極性部位對A549細(xì)胞增殖抑制率

2.2.2 白花蛇舌草單體化合物對A549細(xì)胞增殖抑制作用

2.2.2.1 單體化合物對A549細(xì)胞抑制增殖活性篩選

由表2結(jié)果可以看出給藥作用24 h后，熊果酸、齊墩果酸、白樺脂酸對A549細(xì)胞有較明顯的抑制作用，槲皮素對A549細(xì)胞抑制作用較弱，而其他化合物對A549細(xì)胞無明顯的抑制作用。

表2 化合物對A549細(xì)胞的增殖抑制率

2.2.2.2 單體化合物對A549細(xì)胞增殖的作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白樺脂酸、熊果酸、齊墩果酸和順鉑對A549細(xì)胞顯示出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，且存在一定的量效關(guān)系，其IC50值分別為13.85、12.81、8.38 μmol/L。而陽性藥順鉑對A549細(xì)胞的IC50值為17.34 μmol/L，結(jié)果見表3。

表3 單體化合物對A549細(xì)胞增殖抑制率

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對白花蛇舌草氯仿部位和乙酸乙酯部位中的化學(xué)成分進(jìn)行了較為系統(tǒng)地分離，得到了13個(gè)化合物，其中化合物十五酸十七酯、7-hydroxytectoquinone、2-butyl-1-hydroxyanthra-9,10-quinone首次從該植物中分離得到。通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測了白花蛇舌草不同極性部位和單體化合物對A549細(xì)胞增殖抑制作用，結(jié)果表明，白花蛇舌草氯仿部位和乙酸乙酯部位都有很好的抑制A549細(xì)胞增殖的作用，且有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。白花蛇舌草不同極性部位對A549細(xì)胞增殖的影響與順鉑相比，當(dāng)藥物濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)，僅氯仿萃取物效果優(yōu)于順鉑，當(dāng)藥物濃度達(dá)到400 μg/mL時(shí)，氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物的效果均優(yōu)于順鉑。由此可以確定白花蛇舌草氯仿和乙酸乙酯部位是抗肺癌A549細(xì)胞的活性部位，這兩個(gè)部位將是分離活性物質(zhì)的目標(biāo)。通過化合物對A549細(xì)胞抑制增殖活性篩選實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸在同樣濃度下對A549細(xì)胞有很好的抑制作用。白樺脂酸和齊墩果酸隨著藥物濃度增加，抑制率顯著增大，達(dá)到16～20 μmol/L時(shí)都趨于穩(wěn)定。熊果酸在1～8 μmol/L范圍內(nèi)抑制率較平穩(wěn)，而后隨著濃度增加抑制率增大，達(dá)到20 μmol/L時(shí)抑制率達(dá)到68.45%。在1～20 μmol/L濃度范圍內(nèi)，與陽性對照物順鉑相比，白樺脂酸在濃度為16 μmol/L和20 μmol/L時(shí)的抑制率要高于順鉑；熊果酸的濃度超過16 μmol/L后抑制率要高于順鉑；齊墩果酸在4～12 μmol/L時(shí)抑制率跟順鉑相當(dāng)，超過12 μmol/L時(shí)抑制率要高于順鉑。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草中萜類、蒽醌類、甾醇類、黃酮類、多糖類等化學(xué)成分抗癌作用較為突出，抗腫瘤治療效果與機(jī)制研究多采用白花蛇舌草水提取或醇提物作用于不同腫瘤細(xì)胞來觀察體外抗腫瘤作用[28]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為白花蛇舌草抗腫瘤活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)。