吳 佳，吳嫚婷，龍 榮，仇婧玥，喻 昶，熊 萌，曾梅艷，宋厚盼*

1湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷學湖南省重點實驗室；2湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院；3湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，長沙 410208

原發(fā)性肝癌是全球癌癥致死的第三大原因[1]，肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原發(fā)性肝癌最主要的類型，其危險因素主要有乙型肝炎病毒(HBV)/丙型肝炎病毒(HCV)感染、長期過度飲酒、食用過多黃曲霉菌污染的食品、多種原因?qū)е碌母斡不案渭毎┘易迨穂2]。肝細胞癌的早期診斷常借助于生物標志物，在臨床上被廣泛運用的生物標志物主要來源于血清、血漿、組織的microRNA、突變的基因、蛋白等[3]。很多確診為肝癌的患者通常處于晚期不可切除階段，采用姑息治療后，中位生存期僅為6～12個月，5年存活率僅為10%[4]。因此，篩選肝癌關鍵致病基因?qū)Ω伟┗颊哌M行早期診斷及分析肝癌預后情況具有重要的臨床意義。

高通量測序技術的迅速發(fā)展改變了生物醫(yī)學的研究模式[5]。基因測序為腫瘤發(fā)病機制等腫瘤生物學問題提供了全新的認識，并且對腫瘤的診斷、預后和治療的選擇具有重要的參考價值[6]。生物信息學算法對于處理高通量組學數(shù)據(jù)至關重要[7]。本研究以高通量基因芯片數(shù)據(jù)挖掘為切入點，引入生物信息學算法知識，從GEO數(shù)據(jù)庫獲取肝癌相關數(shù)據(jù)集，分析肝癌組織與正常肝組織的差異表達基因。進一步從差異表達基因中篩選出肝癌關鍵致病基因，探討關鍵基因的生物學功能及其涉及的信號通路、突變情況、免疫浸潤和對臨床預后的影響，并進一步篩選潛在的治療肝癌的中藥，旨在為肝癌的臨床診斷、治療及預后判斷提供理論參考和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取與處理

使用美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)基因表達數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus database，GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)，檢索HCC相關數(shù)據(jù)集，下載得到GSE19665 mRNA表達芯片數(shù)據(jù)[8]。該數(shù)據(jù)集共有樣本20例，其中正常樣本10例，分別為GSM490987、GSM490989、GSM490991、GSM490993、GSM490995、GSM490997、GSM490999、GSM491001、GSM491003、GSM491005；肝癌樣本10例，分別為GSM490988、GSM490990、GSM490992、GSM490994、GSM490996、GSM490998、GSM491000、GSM491002、GSM491004、GSM491006。20例樣本均由GPL570平臺檢測提交，運用R軟件中的affy程序包對下載的數(shù)據(jù)進行背景矯正、均一化處理。

1.2 肝癌與正常組織差異表達基因篩選

使用在線分析工具GEO 2R設置分組，即正常樣本組和肝癌樣本組，對基因表達譜芯片GSE19665進行分析，保存分析結(jié)果。導出數(shù)據(jù)至Excel中進行兩次篩選，初次篩選條件為-log10P>1.4，|log2FC|≥1，繪制火山圖；再次篩選條件為P<0.01，|log2FC|≥2，繪制層次聚類熱圖，得到肝癌和正常組織顯著性DEGs。

1.3 肝癌與正常組織DEGs GO富集分析和GSEA分析

使用富集分析工具Metascape(https://metascape.org/)，選擇物種為“homo sapiens”，對篩選得到的顯著性差異表達的mRNA進行基因本體論(gene ontology，GO)功能富集分析；使用OmicShare平臺GSEA動態(tài)工具對差異表達基因進行KEGG通路富集分析，設置篩選條件為|NES|≥1，P<0.05，依次對富集分析后的數(shù)據(jù)進行可視化處理。

1.4 肝癌與正常組織顯著性DEGs蛋白互作網(wǎng)絡構建與關鍵基因篩選

在蛋白數(shù)據(jù)庫STRING(the searcher tool for the retrieval of interacting genes)(http://String-db.org/)檢索框中輸入篩選得到的顯著性差異表達基因，將最低要求相互作用分設置為中等置信度(0.04)，構建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(protein-protein interaction,PPI)，導出tsv格式數(shù)據(jù)文件。通過Cytoscape對導出的數(shù)據(jù)進行可視化處理，借助Cytohubba插件中的MCC、MNC、DMNC算法，分析出網(wǎng)絡中度值(degree)排名前10位的差異表達基因，即為肝癌致病的關鍵基因。

1.5 肝癌致病關鍵基因生存分析

利用生存分析數(shù)據(jù)庫Kaplan-Meier plotter(http://kmplot.com/analysis/)中肝癌相關的mRNA芯片數(shù)據(jù)，將篩選后的關鍵基因依次導入數(shù)據(jù)庫。根據(jù)肝癌組織中關鍵基因表達的中位數(shù)進行分組，選擇“自動選擇最佳截止”(auto select best cutoff)分析關鍵基因表達的高低對肝癌患者總生存率(overall survival，OS)的影響，并以P<0.05為篩選條件，繪制Kaplan-Meier生存曲線。

1.6 肝癌關鍵致病基因表達驗證

使用癌癥組學數(shù)據(jù)庫UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/)中TCGA(the cancer genome atlas)分析模塊，輸入關鍵致病基因，TCGA dataset設置為liver hepatocellular carcinoma，選擇Expression表達分析模塊，進一步分析關鍵基因在不同的(sample types)組織樣本和(individual cancer stages)腫瘤分期中的表達情況。運用人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫(Human Protein Atlas，HPA)(http://www.Proteinatlas.org)，輸入關鍵基因，分別選擇Tissue(組織)和Pathology(病理)，在Tissue模塊中選擇Liver，在Pathology模塊中選擇Liver cancer，根據(jù)Staining(染色強度)、Intensity(染色密度)、Quantity(定量)、Location(定位)分析關鍵基因的蛋白質(zhì)表達情況。

1.7 肝癌關鍵致病基因的突變及其相關性分析

使用多維癌癥基因組數(shù)據(jù)平臺cBioPortal(http://www.cbioportal.org)，選擇癌癥類型為liver hepatocellular carcinoma，數(shù)據(jù)類型為TCGA、Firehose Lagacy，輸入關鍵基因，設置樣本類型為Samples with mRNA data，采用Z-評分法，分析肝癌關鍵致病基因的突變與預后情況。運用R軟件讀取標準化后的關鍵基因數(shù)據(jù)，通過corrplot程序包對關鍵基因進行相關性分析，并將分析結(jié)果進一步可視化。

1.8 肝癌關鍵致病基因免疫細胞浸潤分析

利用癌癥免疫浸潤數(shù)據(jù)庫TIMER(http://cistrome.dfci.harvard.edu/TIMER)中的Gene(基因)板塊，在Gene Symbol中輸入關鍵基因，Cancer Types設置為LIHC(liver hepatocellular carcinoma)。分析肝癌組織中關鍵致病基因的表達與6種免疫細胞浸潤程度的關系，具體包括B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞。

1.9 治療肝癌藥物的篩選方法

Coremine Medical(https://coremine.com/medical/)數(shù)據(jù)庫是一個開放的生物醫(yī)學數(shù)據(jù)分析平臺，記錄了大量生物醫(yī)學術語間的關系。在Coremine Medical數(shù)據(jù)庫中導入肝癌關鍵致病基因，下載traditional Chinese medicine模塊中的數(shù)據(jù)，設置篩選條件P<0.05，篩選可用于肝癌治療的中藥。比較毒物基因?qū)W數(shù)據(jù)庫(comparative toxicogenomics database，CTD)(http://ctdbase.org/)綜合整理了來自各個物種的毒理學數(shù)據(jù)，具有分析化學-基因/蛋白相互作用、化學-疾病、基因-疾病的功能。在CTD中導入核心基因，篩選具有潛在治療HCC作用的中藥活性成分，通過cytoscape軟件繪制潛在治療中藥-核心基因-中藥活性成分相互作用的網(wǎng)絡圖。

2 結(jié)果

2.1 芯片數(shù)據(jù)處理

通過R語言affy包對GSE19665數(shù)據(jù)集進行均一化處理，并繪制小提琴圖，結(jié)果如圖1所示。小提琴圖中的橫坐標表示芯片數(shù)據(jù)中的樣本編號，包括10例正常樣本和10例肝癌樣本，縱坐標表示芯片數(shù)據(jù)中樣本的表達值。小提琴圖中央白色條形的范圍即下四分位點到上四分位點，中心的實點表示中位數(shù)值，可見各樣本中位數(shù)基本位于同一水平(1.42左右)，說明該芯片數(shù)據(jù)的樣本結(jié)果可靠，可用于下一步分析。

圖1 各樣本標準化處理后小提琴圖

2.2 肝癌致病基因篩選

利用GEO 2R在線分析工具對GSE19665數(shù)據(jù)集進行DEGs分析，共納入54 638個基因，初次篩選后得到差異表達基因4 000個，繪制火山圖如圖2所示，其中與肝癌發(fā)病相關的上調(diào)基因874個，下調(diào)基因3 126個。通過比較|log2FC|值進行再次篩選，分別選取上調(diào)基因中排名前100的基因、下調(diào)基因中排名前100的基因，剔除重復值后，繪制聚類熱圖。圖3結(jié)果顯示，其中與肝癌發(fā)病相關的顯著性上調(diào)基因81個，顯著性下調(diào)基因80個。

圖2 肝癌與正常肝組織差異表達基因分布火山圖

圖3 肝癌與正常肝組織顯著性差異表達基因聚類熱圖

2.3 肝癌與正常肝組織顯著性DEGs GO功能富集分析

表1結(jié)果顯示，肝癌與正常肝組織顯著性DEGs生物學過程(biological process，BP)主要涉及免疫反應、炎癥反應、細胞粘附、細胞趨化作用、適應性免疫應答等；細胞組分(cell component，CC)主要含細胞外區(qū)域、細胞外間隙、蛋白質(zhì)性細胞外基質(zhì)、質(zhì)膜組成部分、細胞外基質(zhì)等；分子功能(molecular function，MF)主要涉及肝素結(jié)合、受體活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、糖結(jié)合、血紅素結(jié)合等。

表1 肝癌與正常肝組織顯著性DEGs GO功能富集分析

2.4 基于GSEA的肝癌與正常肝組織顯著性DEGs KEGG富集分析

圖4結(jié)果顯示，GSEA分析篩選出肝癌與正常肝組織顯著性DEGs相關的KEGG通路92條，根據(jù)P值大小排序，最具統(tǒng)計學意義的信號通路主要涉及細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、p53信號通路、細胞色素P450相關通路、mTOR信號通路、ErbB信號通路、腫瘤相關通路、JAK-STAT信號通路、MAPK信號通路、Wnt信號通路、Toll樣受體信號通路等。提示這些信號通路異常表達與肝癌的發(fā)病密切相關。

圖4 基于GSEA的肝癌與正常肝組織顯著性DEGs KEGG富集分析

2.5 肝癌與正常肝組織顯著性DEGs PPI網(wǎng)絡構建及關鍵基因篩選

將肝癌與正常肝組織顯著性DEGs導入STRING數(shù)據(jù)庫，得到由111個蛋白節(jié)點和1 284條蛋白相互作用邊所構成的網(wǎng)絡，如圖5A肝癌與正常肝組織顯著性DEGs PPI網(wǎng)絡所示。借助cytohubba插件對該網(wǎng)絡進行篩選，選擇前度值排名前10的基因，結(jié)果如圖5B肝癌致病關鍵基因所示。10個關鍵基因分別為細胞分裂周期蛋白20(cell division cycle 20，CDC20)、胞周期蛋白B2(cyclin B2，CCNB2)、細胞周期蛋白B1(cyclin B1，CCNB1)、有絲分裂關卡基因(budding uninhibited by benzimidazoles 1，BUB1)、桿狀病毒凋亡抑制蛋白5(baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-containing protein 5，BIRC5)、極光激酶A(Aurora-A kinase，AURKA)、拓撲異構酶Ⅱα(topoisomerase IIα，TOP2A)、染色體非結(jié)構維持凝聚素I復合亞單位H(Non-structural maintenance of chromosomes condensin I complex subunit H，NCAPH)、Discs大同源物關聯(lián)蛋白5(Discs large-associated protein 5，DLGAP5)、細胞周期蛋白激酶1(cyclin-dependent kinase 1，CDK1)。

2.6 肝癌致病關鍵基因?qū)Ω伟╊A后的影響

將關鍵基因分別導入在線工具Kaplan Meier-Plotter。圖6結(jié)果顯示，與肝癌發(fā)病密切相關的10個關鍵基因高表達組的肝癌患者的總生存期(overall survival，OS)均低于低表達組。CDC20、CCNB2、CCNB1、BUB1、BIRC5、AURKA、TOP2A、NCAPH、DLGAP5、CDK1對應P值分別為0.000 000 51、0.001 3、0.000 034、0.000 058、0.000 000 74、0.001 1、0.000 12、0.000 28、0.000 02、0.000 011，差異均具有統(tǒng)計學意義。

2.7 肝癌致病關鍵基因表達驗證

使用在線分析工具UALCAN比較10個關鍵基因的表達水平，結(jié)果表明，10個關鍵基因在肝癌組織的表達水平顯著高于正常組織，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結(jié)果如圖7所示。10個關鍵基因在1、2、3、4期肝癌組織中的表達的水平均高于正常組織，且在第3期表達水平最高，結(jié)果如圖8所示。運用蛋白表達數(shù)據(jù)庫HPA對10個關鍵基因進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中CDC20、CCNB1、TOP2A、NCAPH的蛋白表達量均高于正常組織，結(jié)果如圖9所示，4個關鍵基因的蛋白染色情況見表2。

表2 核心基因在正常組織和肝癌中的蛋白染色情況

圖7 正常組織和肝癌組織中關鍵基因的表達情況

圖8 關鍵基因在肝癌病理分期中的表達情況

圖9 肝癌致病關鍵基因在正常組織和肝癌組織中的免疫組化圖

2.8 肝癌致病關鍵基因突變及預后分析

利用基因組學在線分析工具cBioPortal數(shù)據(jù)庫對來源于TCGA的373例肝癌樣本中CDC20、CCNB2、CCNB1、BUB1、BIRC5、AURKA、TOP2A、NCAPH、DLGAP5、CDK1等10個關鍵致病基因進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有34.17%的樣本(126例)中上述基因發(fā)生改變，其中有2.22%的樣本(8例)發(fā)生突變，4.17%的樣本(15例)發(fā)生多種改變，6.67%的樣本(24例)發(fā)生擴增，1.39%的樣本(5例)發(fā)生重度缺失，19.72%的樣本(71例)mRNA表達上調(diào)，結(jié)果如圖10A、10B所示。關鍵基因的生存分析結(jié)果顯示，34.17%的樣本(126例)關鍵基因發(fā)生改變，為基因改變組，且關鍵基因改變組的總生存期(overall survival)和無病生存期(disease free survival)均顯著低于未改變組(P<0.05)，結(jié)果如圖10C～10D所示。

圖10 關鍵致病基因在肝癌組織中的突變及其生存預后情況

2.9 肝癌致病關鍵基因間的相關性分析

運用R軟件的corrplot包對與肝癌發(fā)病及預后密切相關的10個關鍵基因進行相關性分析，結(jié)果表明，關鍵基因之間的表達呈正相關關系，如圖11所示，且表達的相關性具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，統(tǒng)計學檢驗結(jié)果見表3。以上結(jié)果提示，關鍵致病基因相互影響，共同誘導和促進肝癌的發(fā)生、發(fā)展。

圖11 肝癌致病關鍵基因表達相關性示意圖

表3 肝癌致病關鍵基因間相關性的統(tǒng)計學分析結(jié)果

2.10 肝癌致病關鍵基因免疫浸潤結(jié)果

運用免疫浸潤數(shù)據(jù)庫TIMER對10個關鍵基因進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CDC20、CCNB2、CCNB1、BUB1、BIRC5、AURKA、TOP2A、NCAPH、CDK1的表達與肝癌細胞純度呈正相關關系，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CDC20、CCNB2、CCNB1、BUB1、BIRC5、AURKA、TOP2A、NCAPH、DLGAP5、CDK1的表達與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞浸潤程度呈正相關關系，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結(jié)果見表4。

表4 肝癌關鍵致病基因與免疫細胞浸潤相關性的統(tǒng)計學分析

2.11 潛在的可用于肝癌治療的藥物篩選結(jié)果

借助Coremine Medical數(shù)據(jù)庫、藥物遺傳學(CTD)數(shù)據(jù)庫對10個關鍵基因進行分析，篩選潛在的可用于肝癌治療的中藥、天然活性成分，共得到中藥36種、天然治療成分105種。利用cytoscape軟件繪制潛在治療中藥-核心基因-天然活性成分的相互作用網(wǎng)絡，如圖12所示，靶向作用于關鍵基因兩次及以上的中藥有8種，分別為青蒿、高良姜、冬凌草、雷丸、野馬追、鵝不食草、蟾酥、九香蟲，以P<0.01為篩選條件，共獲得潛在治療肝癌的中藥36種，結(jié)果見表5。靶向作用于6個以上關鍵基因的天然活性成分有白藜蘆醇、金雀異黃素、槲皮素、醫(yī)用棕櫚樹、魚藤酮、金復康、紫杉醇、姜黃素、長春新堿、表沒食子兒茶素沒食子酸酯，共10種。

圖12 潛在治療中藥-核心基因-天然治療成分的作用關系網(wǎng)絡

表5 靶向作用于肝癌致病關鍵基因的中藥信息

3 討論與結(jié)論

肝癌是全球范圍內(nèi)最常見的癌癥之一，每年罹患肝癌的人數(shù)約為84萬，而每年因肝癌死亡的人數(shù)至少為78萬[9]。中國是一個肝炎大國，肝炎發(fā)病率的上升增加了肝癌患者的數(shù)量，世界上約有50%的肝癌患者來自中國[10]。目前，早期肝癌的治療主要采取手術切除、射頻消融和肝臟移植，中期通常采用手術、射頻消融、靶向治療、免疫治療以及化療等多種方式結(jié)合的手段；而晚期大多采取支持治療[11]。肝癌是一種復發(fā)率極高的惡性腫瘤，采取手術切除等根治性治療手段，其5年內(nèi)的復發(fā)率仍高達77%[12]，故臨床可考慮采用中西醫(yī)結(jié)合治療、中醫(yī)藥治療的方法。中醫(yī)對肝癌并無具體的稱謂，依據(jù)其癥候表征，多將其歸屬為“癥瘕”“肝積”“黃疸”“臌脹”等疾病范疇。中醫(yī)藥治療肝癌包括中藥復方治療、單位中藥/中成藥治療以及針灸、穴位敷貼等外治法；中西醫(yī)結(jié)合治療主要是中醫(yī)聯(lián)合手術治療、中醫(yī)聯(lián)合射頻消融、中醫(yī)聯(lián)合靶向治療、中醫(yī)聯(lián)合化療等，以達到減少并發(fā)癥、減輕副作用、延緩腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移的目的[13,14]。本文通過采用生物信息學相關知識，從分子機制層面對肝癌的芯片數(shù)據(jù)集進行分析，挖掘其致病關鍵基因，并分析關鍵基因在肝癌預后中的意義，進一步通過關鍵基因篩選潛在治療肝癌的中藥。本研究旨在為肝癌的鑒別診斷、預后和治療提供科學依據(jù)和參考。

GO功能和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因主要參與免疫反應、炎癥反應和細胞粘附等生物學過程，涉及的信號通路包括p53、mTOR、ErbB等。研究表明，腫瘤睪丸抗原和Sal樣蛋白4與特異性T細胞的反應在控制早期肝癌中可能發(fā)揮著重要作用[15]；肝臟中核苷酸去結(jié)合寡聚化結(jié)構域2的缺失可通過炎癥反應、DNA損傷和基因組不穩(wěn)定性來誘導肝癌的發(fā)生[16]；NK細胞來源的干擾素-γ通過HBV轉(zhuǎn)基因小鼠上皮細胞黏附分子-上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換過程，可促進肝癌的發(fā)生[17]；此外，有研究顯示miR-621可通過激活p53信號通路提高肝癌細胞的放射敏感性[18]；高表達水平的蛋白酶體活性亞單位4通過mTOR信號通路可促進肝癌細胞的增殖[19]；上皮V樣抗原1能夠上調(diào)ErbB3-PI3K信號通路進而促進肝癌的進展和轉(zhuǎn)移[20]。

蛋白相互作用分析得到10個在肝癌組織中高表達的關鍵基因，分別為CDC20、CCNB2、CCNB1、BUB1、BIRC5、AURKA、TOP2A、NCAPH、CDK1。對此10個關鍵基因進行預后分析發(fā)現(xiàn)，關鍵基因高表達組肝癌患者總生存期明顯降低，這些關鍵基因與肝癌的病理分析結(jié)果存在一定的正相關關系。研究表明，CDC20在肝癌組織中的表達高于正常組織(P<0.05)，且高表達CDC20的肝癌患者總體的生存率較低[21]；研究顯示，高CCNB2水平的肝癌患者5年總生存期和無病生存期均短于低CCNB2水平者[22]；另有研究表明，在肝癌組織中可檢測到較高水平的BUB1B，BUB1B過表達與不良的臨床病理表現(xiàn)呈正相關[23]。

進一步對10個關鍵基因進行表達驗證和突變分析發(fā)現(xiàn)，關鍵基因在肝癌組織中高表達，其中CDC20、CCNB1、TOP2A、NCAPH在肝癌組織中的蛋白表達量有不同程度的增加；此外，關鍵基因在肝癌組織中存在一定程度的突變，攜帶此突變關鍵基因的肝癌患者有較差的預后。關鍵基因的免疫細胞浸潤分析發(fā)現(xiàn)，關鍵基因的表達與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞的浸潤程度呈正相關關系。Yang Gang等采用免疫組織化學法檢測肝癌組織中CDC20的蛋白表達水平，結(jié)果顯示在59.2%的肝細胞癌樣本中觀察到CDC20高表達[24]。Rong Min-Hua等研究發(fā)現(xiàn)CCNB1的mRNA和蛋白在肝細胞癌組織中過度表達，且CCNB1可能通過調(diào)節(jié)DNA復制參與HCC的細胞周期[25]。這些結(jié)果提示本文預測結(jié)果具有較好的可信性與準確性。

潛在治療藥物的篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCNB1、BIRC5、CDK1、CDC20篩選出的中藥數(shù)目多，CDK1、CCNB1、BIRC5、TOP2A所結(jié)合的潛在天然治療成分數(shù)量多，CDK1、CCNB1、BIRC5可能為藥物治療的通用靶點。青蒿、高良姜、冬凌草等可作用于2～3個關鍵基因，為潛在治療肝癌的中藥。研究表明，青蒿的有效成分為青蒿素，其可通過EGFR等多種途徑調(diào)節(jié)肝癌細胞的增殖、凋亡、血管生成[26]；高良姜的有效成分為高良姜素，其可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和線粒體依賴性凋亡來預防肝細胞癌[27]；冬凌草可通過靶向AKT通路來增強肝癌對索拉非尼抗癌作用的敏感性[28]。中醫(yī)理論認為，肝細胞癌的主要病機為“瘀”“毒”“虛”，中藥在分子水平發(fā)揮扶正祛邪、攻毒抗癌的功效，可達到機體陰陽平衡的狀態(tài)[29]。相較于傳統(tǒng)的西醫(yī)治療，中醫(yī)藥在治療肝細胞癌中具有潛在的優(yōu)勢，具體體現(xiàn)在中藥副作用小，不良反應發(fā)生率低，腫瘤生長減緩，復發(fā)轉(zhuǎn)移減少，患者生存質(zhì)量提升，生存周期延長[30]。

綜上所述，本文研究發(fā)現(xiàn)肝癌的發(fā)生發(fā)展具有多基因、多通路、多功能的特點，共篩選獲得10個肝癌致病關鍵基因；這些基因及其蛋白產(chǎn)物在肝癌患者中的表達水平均有升高，且與肝癌的不良預后、免疫細胞浸潤程度密切相關；進一步挖掘得到青蒿、高良姜、冬凌草等36味潛在的肝癌靶向治療中藥和105個天然活性成分。本文研究結(jié)果可為肝癌的臨床診斷、預后判斷及相關治療提供科學依據(jù)。