周 正,宋美慧,褚光輝,付 玉

(昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院,中國云南 昆明 650500)

巴氯芬(baclofen)是γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的一種衍生物,在臨床上具有廣泛的用途。首先,巴氯芬可用作抗痙攣劑和中樞肌肉松弛劑[1～2]。其次,巴氯芬具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用[3]。此外,巴氯芬還可用于治療酒精或藥物成癮等[4～5],并且在治療精神分裂癥、抑郁癥、癲癇和阿爾茨海默病等精神或神經(jīng)疾病中具有一定的潛在用途[6～8]。

巴氯芬是迄今為止臨床上唯一使用的γ-氨基丁酸 B 型(γ-aminobutyric acid type B,GABAB)受體激動劑[9]。GABAB受體在認(rèn)知神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要作用。在GABAB受體分布層面,其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布,在參與空間學(xué)習(xí)記憶的海馬腦區(qū)更是有較高的表達[3]。在GABAB受體功能層面,其神經(jīng)活動與學(xué)習(xí)記憶、獎勵、應(yīng)激和焦慮等功能相關(guān)[3,10～12],同時參與大量神經(jīng)系統(tǒng)和功能方面的調(diào)節(jié),包括神經(jīng)遞質(zhì)傳遞系統(tǒng)、傳導(dǎo)途徑、記憶和其他認(rèn)知功能等[10]。此外,GABAB受體還可以作為藥物成癮的潛在治療靶標(biāo)[13]。在GABAB受體的激動劑和拮抗劑層面,其激動劑能夠改善酒精依賴導(dǎo)致的工作記憶障礙[14],其拮抗劑能夠改善各種不同感知任務(wù)的行為表現(xiàn),如海馬依賴性的空間學(xué)習(xí)和記憶等[15]。

關(guān)于巴氯芬對認(rèn)知的影響目前已有一些研究,但結(jié)果尚存爭議。首先,已有報道發(fā)現(xiàn)巴氯芬能夠改善認(rèn)知能力。例如,巴氯芬激活GABAB受體能夠改善應(yīng)激狀態(tài)下的空間記憶障礙[16],同時還能夠改善運動障礙和認(rèn)知能力[17]。其次,也有報道認(rèn)為巴氯芬對認(rèn)知功能無影響。例如,長時程高劑量注射巴氯芬能夠短暫降低記憶能力,但不影響空間學(xué)習(xí)能力[9],也不影響參考和工作記憶。此外,還有研究發(fā)現(xiàn)巴氯芬能夠劑量依賴性地?fù)p傷空間學(xué)習(xí)能力[18～20]。這些差異性的研究結(jié)果可能來源于不同的藥物注射劑量、藥物在行為測試前的注射時間,以及不同的實驗研究范式,如水迷宮和高架迷宮涉及懲罰、八臂迷宮涉及食物獎勵因素等。

探索型Y迷宮是一種檢測動物空間識別記憶能力的實驗范式[21～22]。該迷宮是基于嚙齒類動物探索新異環(huán)境的天性設(shè)計的,避免了獎賞和懲罰對小鼠行為表現(xiàn)的影響。Y迷宮能夠在不需要學(xué)習(xí)規(guī)則的狀態(tài)下測量動物的空間識別記憶能力。在該任務(wù)中,訓(xùn)練階段開放兩個臂,關(guān)閉第3個臂,僅讓動物探索開放的兩個臂;測試階段則同時開放3個臂,動物可以在3個臂內(nèi)自由探索。實驗完成后,研究者通過比較動物對3個臂的探索程度來分析其對新異度與熟悉度的區(qū)別。

本研究旨在探討巴氯芬在不同劑量下對小鼠空間識別記憶能力的影響。通過曠場實驗和Y迷宮實驗,我們發(fā)現(xiàn)高劑量巴氯芬能夠損傷小鼠的運動能力及探索能力,并且巴氯芬能夠劑量依賴性地?fù)p傷小鼠的空間識別記憶能力。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗小鼠引進于成都達碩實驗動物有限公司,均為成年C57BL/6雄性小鼠,體重為25～35 g,共47只。小鼠飼養(yǎng)于33 cm×20 cm×14 cm(長×寬×高)的飼養(yǎng)籠中,每籠5～6只。小鼠在自然晝夜節(jié)律下,以自由飲食狀態(tài)飼養(yǎng),飼養(yǎng)室恒定溫度為23～25℃。所有實驗動物的操作均符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》相關(guān)規(guī)定。

1.2 藥物注射處理及動物分組

巴氯芬(美國Sigma-Aldrich公司)用0.9%的生理鹽水(山東康寧藥業(yè)有限公司)溶解。在已有的巴氯芬相關(guān)研究中,1.0 mg/kg被認(rèn)為是相對較低劑量[18],6.0～10.0 mg/kg則被認(rèn)為是高劑量[16],因此本實驗選取1.0 mg/kg、2.5 mg/kg和7.5 mg/kg分別對應(yīng)為低、中、高劑量組。實驗組小鼠分別腹腔注射低、中、高劑量的巴氯芬,對照組小鼠則注射0.9%生理鹽水,注射體積均為0.01 mL/g。

在首先進行的曠場實驗中,小鼠隨機分為4組(1個對照組、3個實驗組),每組11～12只。所有小鼠按照既定分組在實驗前30 min給藥。曠場實驗結(jié)束至少1周以后進行Y迷宮實驗。在Y迷宮實驗中,所有小鼠重新隨機分組,并于Y迷宮實驗前30 min給藥。根據(jù)文獻報告,巴氯芬的半衰期約為5 h[23],因此在本研究中曠場實驗和Y迷宮實驗至少間隔1周,以確保巴氯芬的完全代謝。

1.3 曠場實驗

曠場實驗是用于檢測小鼠在新異環(huán)境中的探索能力、運動能力及焦慮程度的行為學(xué)方法。本實驗所使用的曠場實驗箱為實驗室自制,由40 cm×40 cm×40 cm的正方體組成,底部分為中心區(qū)和外周區(qū)兩個部分,中心區(qū)大小為20 cm×20 cm,其余為外周區(qū)(圖1)。位于曠場箱正上方的攝像系統(tǒng)用于記錄小鼠在曠場內(nèi)的行為學(xué)。

圖1 小鼠曠場實驗運動軌跡圖黑色實線為小鼠運動軌跡路線,中間的方形范圍為曠場中心區(qū),其余為外周區(qū);右下角的●為小鼠進入曠場的起始位置,另一個●為實驗結(jié)束時小鼠所在位置。Fig.1 The trajectory of mice in the open field testThe black line is the path of the mouse movement.The square area in the middle represents the central area of the open field,and the rest is the peripheral area.“●”in the lower right corner is the starting position of mice when they entered the open field,and the other“●”is the ending location.

實驗開始時將小鼠沿曠場箱一角面壁輕輕放入箱中,讓小鼠在箱內(nèi)自由活動5 min并全程進行視頻采集。實驗時保持環(huán)境安靜、昏暗。曠場實驗完成后,采用75%乙醇擦洗曠場箱,以除去氣味對下一只小鼠的嗅覺干擾。

每只小鼠實驗結(jié)束后統(tǒng)計其在5 min內(nèi)的直立次數(shù),并用軟件統(tǒng)計分析小鼠在曠場內(nèi)的總行走距離、進入中心區(qū)的次數(shù)及在中心區(qū)的停留時間等指標(biāo)。

1.4 Y迷宮實驗

Y迷宮實驗是用于檢測小鼠空間識別記憶能力的行為學(xué)方法。本實驗所使用的Y迷宮設(shè)備為實驗室自制,由3個臂組成,3個臂之間的夾角均為 120°,每個臂長 30 cm、寬 8 cm、高 15 cm(圖2)。在中央?yún)^(qū)與3個臂相連處各有一個可移動的隔板。Y迷宮的3個臂被隨機分為新異臂(novel arm)、起始臂(start arm)和其他臂(other arm)。起始臂為小鼠進入迷宮時所在的臂。實驗時在迷宮底部墊有適量墊料。位于Y迷宮正上方的攝像系統(tǒng)用于記錄小鼠在迷宮內(nèi)的行為學(xué)。

實驗分為訓(xùn)練期(圖2,左)和測試期(圖2,右)。訓(xùn)練期:開放Y迷宮的起始臂和其他臂,關(guān)閉新異臂;巴氯芬注射30 min后,小鼠由起始臂面壁放入迷宮,在起始臂和其他臂自由探索10 min。訓(xùn)練結(jié)束后小鼠回到原飼養(yǎng)籠,1 h后進入測試期。測試期:同時開放Y迷宮的新異臂、起始臂和其他臂,小鼠由起始臂面壁放入,在3個臂之間自由探索5 min。實驗在安靜、昏暗的環(huán)境下進行。整個實驗過程使用攝像系統(tǒng)跟蹤記錄。訓(xùn)練期和測試期結(jié)束后分別混勻墊料,以防止氣味對下一只小鼠的嗅覺產(chǎn)生干擾。

圖2 小鼠Y迷宮實驗運動軌跡圖左圖為Y迷宮實驗訓(xùn)練期小鼠的運動軌跡,右圖為測試期小鼠的運動軌跡。Fig.2 The trajectory of mice in the Y-maze testThe left figure shows the trajectory of mice during the training period of Y-maze experiment,and the right one shows the trajectory of mice during the test period.

實驗結(jié)束后,統(tǒng)計分析小鼠在測試期5 min內(nèi)的行走距離、穿梭次數(shù)以及在每個臂中的停留時間等指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 高劑量巴氯芬影響小鼠的運動及探索能力

首先,我們分析了小鼠在曠場中的行走距離。結(jié)果顯示,巴氯芬注射顯著影響小鼠在曠場中的行走距離[F(3,46)=29.26,P＜0.001]。與生理鹽水對照組相比,給小鼠注射1.0 mg/kg和2.5 mg/kg劑量的巴氯芬對小鼠的行走距離沒有顯著影響(兩者:P＞0.05),但是7.5 mg/kg劑量的藥物注射顯著降低了小鼠的行走距離(P＜0.001)(表1)。接下來,我們分析了小鼠在曠場中的探索次數(shù)。結(jié)果顯示,巴氯芬注射顯著降低小鼠的探索次數(shù)[F(3,46)=26.831,P＜0.001]。與生理鹽水對照組相比,給小鼠注射1.0 mg/kg和2.5 mg/kg劑量的巴氯芬對小鼠的探索次數(shù)沒有顯著影響(兩者:P＞0.05),但是7.5 mg/kg劑量的藥物注射顯著降低了小鼠的探索次數(shù)(P＜0.001)(表 1)。

表1 曠場實驗結(jié)果Table 1 The results of open field test (±s)

表1 曠場實驗結(jié)果Table 1 The results of open field test (±s)

注:***P＜0.001 vs.生理鹽水對照組。Note:***P＜0.001 vs.the control group(0 mg/kg).

Baclofen/(mg·kg-1)0 1.0 2.5 7.5 Ambulation/cm 3 383.18±104.30 3 438.67±110.65 3 374.67±111.62 1 261.08±343.41***Rearing(time)37.09±3.09 38.00±3.69 38.92±4.09 2.83±2.57***Percentage of ambulation in center 11.95±1.43 9.99±1.20 9.82±1.15 9.95±2.73 Percentage of time in center area 11.36±1.51 9.73±1.08 9.25±1.13 6.56±2.17

此外,各劑量藥物處理對小鼠在曠場中心區(qū)域的行走距離百分比和停留時間百分比沒有顯著影響(兩者:P＞0.05),表明不同劑量的巴氯芬并未影響小鼠的焦慮程度。

2.2 巴氯芬對小鼠空間識別記憶能力的影響具有劑量依賴性

首先,我們統(tǒng)計分析了小鼠在新異臂的停留時間。結(jié)果顯示,巴氯芬注射顯著降低了小鼠在新異臂中的停留時間[F(3,46)=5.660,P=0.039]。與生理鹽水對照組相比,2.5 mg/kg和7.5 mg/kg劑量組小鼠的停留時間顯著降低(2.5 mg/kg,P＜0.05;7.5 mg/kg,P＜0.001),1.0 mg/kg劑量組則無顯著變化(P＞0.05)(表2)。接下來,我們對小鼠在新異臂的停留時間百分比進行了分析。結(jié)果顯示,藥物注射組與對照組無顯著差異[F(3,39)=2.319,P=0.111]。此外,當(dāng)與33.3%的隨機水平相比時,僅對照組在新異臂中的停留時間百分比表現(xiàn)出顯著差異(P＜0.01)(表2)。

由于曠場實驗表明巴氯芬影響小鼠的運動能力,所以我們進一步對小鼠在新異臂中的穿梭次數(shù)和行走距離的百分比與隨機水平(33.3%)進行了比較。結(jié)果顯示,2.5 mg/kg劑量組小鼠在新異臂中的停留時間百分比處于隨機水平(P=0.941),而穿梭次數(shù)和行走距離的百分比顯著大于隨機水平(兩者:P＜0.05);7.5 mg/kg劑量組小鼠則無論是在新異臂中的停留時間、穿梭次數(shù),還是行走距離,都處于隨機水平(三者:P＞0.05)(表2)。這些結(jié)果表明,7.5 mg/kg劑量組小鼠的空間識別記憶能力受到顯著抑制,且這種抑制作用受到藥物劑量的影響。

最后,為了考察小鼠在Y迷宮中的運動能力,我們統(tǒng)計分析了小鼠在Y迷宮3個臂中的總穿梭次數(shù)和總行走距離。結(jié)果顯示:與對照組相比,2.5 mg/kg和7.5 mg/kg藥物劑量均顯著降低了小鼠的總穿梭次數(shù)[F(3,46)=10.904,P＜0.001;中劑量:P＜0.01,高劑量:P＜0.001](表 2);同時,7.5 mg/kg藥物劑量也顯著降低了小鼠的總行走距離[F(3,46)=7.770,P＜0.001;P＜0.001],但 2.5 mg/kg劑量組小鼠的總行走距離與對照組相比無顯著差異(表2)。以上結(jié)果表明,7.5 mg/kg劑量組小鼠的運動能力受到抑制。

表2 Y迷宮實驗結(jié)果Table 2 The results of Y-maze test(±s)

表2 Y迷宮實驗結(jié)果Table 2 The results of Y-maze test(±s)

注:*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs.生理鹽水對照組;#P＜0.05,##P＜0.01 vs.隨機水平(33.3%)。Notes:*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs.the control group(0 mg/kg);#P＜0.05,##P＜0.01 vs.random level(33.3%).

Baclofen/(mg·kg-1)0 1.0 2.5 7.5 Time in novel arm/s 120.69±7.55 101.66±9.09 86.72±9.78*57.37±15.9***Total number of arm visit 40.45±3.58 34.00±3.66 26.67±3.04**13.25±3.75***Total ambulation of arm visit 1 545.18±438.12 1 370.33±384.98 1 236.58±577.83 637.75±509.57***Percentage of time in novel arm 44.26±2.65##38.68±3.31 33.01±3.91 31.54±6.12 Percentage of cross num in novel arm 37.14±1.39#38.23±1.75#39.74±2.29#33.66±2.60 Percentage of ambulation in novel arm 42.39±3.44#40.47±4.07 40.95±2.99#28.26±4.54

3 討論

在本研究中,我們檢測了巴氯芬對小鼠行為表現(xiàn)的影響。結(jié)果表明,巴氯芬能夠劑量依賴性地?fù)p傷小鼠的空間識別記憶能力;當(dāng)給予高劑量(7.5 mg/kg)的巴氯芬時,小鼠的運動能力和探索能力出現(xiàn)降低,但所有劑量的巴氯芬都不影響小鼠的焦慮程度。

巴氯芬能夠激活GABAB受體,從而產(chǎn)生抑制性作用。在突觸前,GABAB受體的激活能夠抑制電壓門控鈣通道,減少囊泡神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[24];GABAB受體激活還可通過抑制腺苷酸環(huán)化酶減少囊泡募集,并因此降低環(huán)磷酸腺苷的活化[25]。巴氯芬作為GABAB受體激動劑,還能抑制囊泡融合,從而減少神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。巴氯芬抑制興奮性谷氨酸和天冬氨酸釋放到突觸后神經(jīng)元上,致使突觸后神經(jīng)元具有更大去極化的可能性,從而產(chǎn)生抑制作用[26]。例如,在人和嚙齒類動物中,神經(jīng)元gamma和theta頻段的震蕩在記憶的形成中起重要作用[27],海馬中錐體細胞突觸后的GABAB受體激活,能夠降低神經(jīng)元的gamma震蕩,從而影響學(xué)習(xí)與記憶能力[26]。

根據(jù)Dellu等[22,28～29]的描述,探索型Y迷宮是一種檢測動物空間識別記憶能力的實驗范式。該迷宮不需要學(xué)習(xí)規(guī)則,并且避免了獎賞和懲罰對小鼠行為表現(xiàn)的影響。在本實驗的對照組與低劑量組(1.0 mg/kg)中,小鼠在新異臂中的探索次數(shù)百分比都顯著大于隨機水平(33.3%),這與Dellu等[22,28～29]的描述一致。當(dāng)給予高劑量巴氯芬(7.5 mg/kg)時,小鼠在Y迷宮的空間識別記憶能力出現(xiàn)損傷,這與Franek等[9]的實驗結(jié)果一致,他們報道了長時程高劑量(10 mg/kg,14 days)注射巴氯芬能夠降低大鼠的記憶能力。當(dāng)給予中、高劑量巴氯芬時,與對照組相比,小鼠在新異臂中的探索次數(shù)、停留時間和行走距離的百分比均出現(xiàn)不同程度的下降,表明巴氯芬影響小鼠的空間識別記憶能力且具有劑量依賴性。這與Mcnamara等[18]的研究結(jié)果一致,Mcnamara等報道巴氯芬劑量依賴性地?fù)p傷大鼠在水迷宮中的空間學(xué)習(xí)能力。此外,當(dāng)給予中等劑量巴氯芬時,小鼠的運動能力并未受到影響,但小鼠在Y迷宮新異臂中的停留時間百分比已處于隨機水平,而在新異臂中的穿梭次數(shù)與行走距離的百分比卻高于隨機水平,表明此時小鼠認(rèn)知功能已出現(xiàn)部分損傷。已有報道顯示,巴氯芬能夠影響水迷宮行為表現(xiàn)的最低劑量為2.0 mg/kg[26],本研究使用的中等劑量與其接近。

此前,已有研究使用幾種不同的實驗范式探究了巴氯芬對認(rèn)知的影響。比如:有研究使用巴恩斯迷宮和水迷宮等范式發(fā)現(xiàn),巴氯芬能夠改善空間記憶和運動障礙[16～17];有報道指出,在水迷宮實驗中,巴氯芬損傷空間記憶能力[16]。此外,也有研究使用八臂迷宮等范式發(fā)現(xiàn),巴氯芬對認(rèn)知無影響或只有在高劑量時有短暫的影響[30]。本文的研究表明巴氯芬能夠劑量依賴性地?fù)p傷空間識別記憶能力,與上述報道之間的差異可能是由以下幾個原因造成的。首先,本研究使用的實驗范式與上述不同,Y迷宮排除了獎賞和懲罰對小鼠應(yīng)激的影響,從而避免了對其行為表現(xiàn)的干擾。其次,在上述實驗中,巴氯芬是在行為測試前10 min、15 min或是測試前一個晚上開始注射[11,16,31],而在本研究中,巴氯芬注射時間為行為測試前30 min,這可能對巴氯芬的最終作用產(chǎn)生重要影響,因為巴氯芬通常在注射后0.5～1 h開始起效用[32],并且半衰期約為5 h[23]。

本研究在行為學(xué)水平上發(fā)現(xiàn),在基于嚙齒類動物自然探索天性的Y迷宮實驗中,巴氯芬能夠損傷小鼠的空間識別記憶能力,并且這種損傷作用具有劑量依賴性。有文獻報道,GABA系統(tǒng)在神經(jīng)元興奮/抑制平衡過程中起重要作用,并且在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中出現(xiàn)紊亂[1,6]。因此,后續(xù)我們將進一步從電生理水平探究巴氯芬對小鼠興奮/抑制平衡的影響。

GABA系統(tǒng)具有神經(jīng)調(diào)節(jié)作用,目前研究人員已經(jīng)提出了各種策略,例如激動作用、拮抗作用以及近年來對GABAB受體的正構(gòu)調(diào)節(jié)等,這些策略對藥物成癮、焦慮和抑郁等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有一定的治療作用。盡管目前關(guān)于GABAB受體的生理和病理調(diào)節(jié)尚不清楚,但是,越來越多的證據(jù)表明,GABAB受體將在各種精神疾病和神經(jīng)退行性疾病的治療中成為潛在的藥物治療靶標(biāo)[6～8]。本研究表明GABAB受體在空間識別記憶過程中起重要作用,提示在巴氯芬及其他GABAB受體相關(guān)藥物的臨床應(yīng)用過程中,相關(guān)人員要尤為注意高劑量藥物對認(rèn)知神經(jīng)系統(tǒng)的影響,從而避免對其產(chǎn)生損傷。