易世鳴,王春平,李 慧,周冰玉,孫翔宇

(湖南省微生物研究院,中國湖南 長沙 410009)

鎂離子(Mg2+)是植物細(xì)胞質(zhì)中最豐富的游離二價陽離子,在植物的生長發(fā)育中有著十分重要的作用[1～3]。它在植物體中能夠作為許多酶的輔助因子參與一系列生理生化反應(yīng),同時也作為葉綠素的中心元素參與光合作用[4～8]。

缺鎂引起淀粉和蔗糖等碳源在植物葉片中積累,高濃度的蔗糖能夠抑制編碼葉綠素a/b結(jié)合蛋白2的基因CAB2的表達(dá),影響植物光合作用[9～10]。但植物細(xì)胞中過量的Mg2+也會抑制植物正常生長發(fā)育。當(dāng)植物中Mg2+過量時,葉片的葉緣部分焦枯,葉尖萎縮泛黃,在更嚴(yán)重的情況下,整個葉片組織全部淡黃,葉肉組織逐漸變?yōu)楹稚?直至壞死,導(dǎo)致植株的生長發(fā)育受阻[11]。高鎂脅迫嚴(yán)重影響作物生長[12]。但目前的研究主要針對植物缺鎂生理,而對高鎂毒害引起的植物生理變化及其機(jī)理卻了解較少。

有研究表明,濃度較高的Mg2+會促進(jìn)細(xì)胞外部鈣離子(Ca2+)被Mg2+所取代,影響細(xì)胞壁的穩(wěn)定性和細(xì)胞質(zhì)膜的滲透性,從而影響植物生長發(fā)育[13]。但到目前為止,有關(guān)植物細(xì)胞鈣鎂離子(Ca2+/Mg2+)動態(tài)平衡的機(jī)制報道較少。

鎂轉(zhuǎn)運蛋白6(magnesium transporter 6,MGT6)是植物中第一個被報道定位于細(xì)胞質(zhì)膜,并在低鎂條件下介導(dǎo)植物根部吸收Mg2+的蛋白質(zhì)[14]。本研究發(fā)現(xiàn),MGT6的突變體和RNA干擾(RNA interference,RNAi)植株在高鎂條件下出現(xiàn)葉片變黃的高鎂敏感表型,并且該表型能被一定濃度的Ca2+拮抗,說明擬南芥MGT6能通過調(diào)控高鎂脅迫下鈣鎂離子動態(tài)平衡來維持植物正常生長發(fā)育。該研究將為解析植物響應(yīng)高鎂脅迫的信號網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

實驗所用的材料為擬南芥(Arabidopsisthaliana)野生型(Columbia生態(tài)型,Col-0),種子購買自擬南芥生物資源中心(Arabidopsis Biological Resource Center,US)。擬南芥MGT6基因(At3g58970)的mgt6 T-DNA插入突變體(Salk_203866C)和MGT6 RNAi(#2、#8、#12)種子均為本實驗室保存,并已被鑒定為純合突變體。

1.2 培養(yǎng)基的配制

MS固體培養(yǎng)基(100 mL):4 mL 25×A液,1 mL 100×B-C液,1 mL 100×D液,1 g蔗糖,雙蒸水定容至100 mL;用10 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5.8,再加入0.8 g(0.9%)擬南芥培養(yǎng)專用瓊脂,121℃高溫滅菌2 h。培養(yǎng)基A液、B-C液和D液參照文獻(xiàn)[14]配制。

1/6 MS固體培養(yǎng)基(300 mL):2 mL 25×A液,0.5 mL 100×B-C液,0.5 mL 100×D液,3 g蔗糖,雙蒸水定容至300 mL;調(diào)節(jié)pH至5.8,再加入2.8 g(0.9%)擬南芥培養(yǎng)專用瓊脂,121℃高溫滅菌2 h。

1.3 擬南芥溫室培養(yǎng)

用75%乙醇處理擬南芥相關(guān)種子5 min,進(jìn)行表面消毒。春化處理后,將其點植于MS培養(yǎng)基上,于光照培養(yǎng)箱豎直放置培養(yǎng),培養(yǎng)條件:溫度(22±1)℃;光暗周期 16 h(光照)/8 h(黑暗)。

1.4 高鎂脅迫處理

將相關(guān)擬南芥種子分別種于0 mmol/L、0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、3 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L Mg2+濃度(用1 mol/L Mg2+母液加入相應(yīng)體積的去離子水配制,1 mol/L Mg2+母液用12 g MgSO4加入100 mL去離子水配制)的1/6 MS固體培養(yǎng)基,用封口膜將培養(yǎng)基封口后放置在溫度為(22±1)℃、光暗周期為16 h光照/8 h黑暗的溫室中豎直培養(yǎng)。培養(yǎng)14 d后,對野生型植株、mgt6突變體及RNAi植株進(jìn)行表型觀察,并統(tǒng)計植株根長和鮮重。文中將Mg2+濃度＞3 mmol/L定義為高鎂條件。

1.5 Ca2+拮抗處理

配制不同 Mg2+濃度(0 mmol/L、0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、3 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L)的 1/6 MS固體培養(yǎng)基,并分別加入1 mmol/L或3 mmol/L Ca2+(用1 mol/L Ca2+母液加入相應(yīng)體積的去離子水配制,1 mol/L Ca2+母液用 21.9 g CaCl2·6H2O 加入100 mL去離子水配制而成)。將擬南芥野生型種子、mgt6突變體和MGT6 RNAi植株(#8)的種子分別種在上述1/6 MS固體培養(yǎng)基上,用封口膜將培養(yǎng)基封口后放置在溫度為(22±1)℃、光暗周期為16 h光照/8 h黑暗的溫室中豎直培養(yǎng)7 d。觀察表型,并統(tǒng)計植株根長和鮮重。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。多組間比較采用單因素方差分析,顯著性水平為P＜0.05。采用Sigma Plot計算機(jī)軟件制圖。

2 結(jié)果

2.1 高鎂條件下MGT6突變體及其RNAi植株的表型觀察與分析

將野生型(WT)、mgt6突變體和MGT6 RNAi(#2、#8、#12)種子分別種于含不同 Mg2+濃度(0 mmol/L、0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、3 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L Mg2+)的1/6 MS固體平板上,豎直培養(yǎng)14 d后進(jìn)行表型觀察。結(jié)果顯示:在3 mmol/L Mg2+濃度下,mgt6突變體植株和MGT6 RNAi植株的生長表型與野生型一致;但在高M(jìn)g2+濃度(6 mmol/L和8 mmol/L)下,mgt6突變體植株和MGT6 RNAi植株出現(xiàn)葉片變黃、地上部分變小的高鎂表型(圖1),同時,根長和鮮重均較野生型明顯降低(圖2)。上述結(jié)果表明,MGT6參與植物對高鎂脅迫的響應(yīng)。

圖1 不同Mg2+濃度下的擬南芥表型分析(標(biāo)尺:1 cm)Fig.1 Phenotype analysis of Arabidopsis thaliana under different Mg2+conditions(scale bar:1 cm)

圖2 不同Mg2+濃度下的根長和鮮重分析(10個植株)(A)根長;(B)鮮重。*代表與WT相比有顯著性差異(P＜0.01)。Fig.2 Root length and fresh weight analysis of Arabidopsis thaliana under different Mg2+conditions(10 plants)(A)Root length;(B)Fresh weight.Asterisks represent significant difference compared with WT(*P＜0.01 by Student’s t test).

2.2 Ca2+拮抗MGT6突變體及其RNAi植株高鎂表型的分析

有研究表明Mg2+能和Ca2+互作來調(diào)控植物生長發(fā)育[14]。為了驗證高鎂條件下擬南芥MGT6是否能通過調(diào)節(jié)Ca2+/Mg2+動態(tài)平衡來維持植物正常生長發(fā)育,我們將擬南芥哥倫比亞野生型(WT)、mgt6突變體和隨機(jī)挑選的MGT6 RNAi(#8)種子分別種在含不同Mg2+濃度(0 mmol/L、0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、3 mmol/L、6 mmol/L 和 8 mmol/L)的1/6 MS固體培養(yǎng)基上,且在各培養(yǎng)基中分別添加3 mmol/L Ca2+,豎直培養(yǎng)7 d后進(jìn)行表型觀察。結(jié)果顯示:在低鎂條件(0 mmol/L、0.01 mmol/L、0.1 mmol/L Mg2+)下,加入3 mmol/L Ca2+后,mgt6突變體植株和MGT6 RNAi(#8)植株的低鎂表型不能得到恢復(fù);但在高鎂條件(6 mmol/L、8 mmol/L Mg2+)下,加入3 mmol/L Ca2+后,mgt6突變體植株和MGT6 RNAi(#8)植株的高鎂表型得到緩解,葉片開始變綠,各植株長勢均恢復(fù)至野生型水平(圖3)。進(jìn)一步的統(tǒng)計學(xué)分析顯示,mgt6突變體植株和MGT6 RNAi(#8)植株的根長和鮮重均恢復(fù)到野生型水平(圖4)。上述結(jié)果表明,Ca2+不能緩解mgt6突變體植株及MGT6 RNAi植株的低鎂表型,但能夠有效拮抗mgt6突變體及RNAi植株的高鎂敏感表型。

圖3 Ca2+拮抗mgt6突變體及RNAi植株的高鎂表型Fig.3 Phenotype analysis of mgt6 mutants and RNAi plants under high-Mg2+conditions after Ca2+supplement

圖4 Ca2+拮抗mgt6突變體及RNAi植株高鎂表型的分析(5個植株)(A)根長;(B)鮮重。*代表與WT相比有顯著性差異(P＜0.01)。Fig.4 Phenotype analysis of mgt6 mutants and RNAi plants under high-Mg2+conditions after Ca2+supplement(5 plants)(A)Root length;(B)Fresh weight.Asterisks represent significant difference compared with WT(*P＜0.01 by Student’s t test).

2.3 Ca2+拮抗MGT6突變體及其RNAi植株高鎂表型的細(xì)胞學(xué)分析

為了探究Ca2+拮抗mgt6突變體及MGT6 RNAi植株高鎂表型的機(jī)制,我們進(jìn)一步進(jìn)行了mgt6突變體及RNAi植株在不同濃度Ca2+處理下的細(xì)胞學(xué)分析。結(jié)果顯示:高鎂脅迫(6 mmol/L Mg2+)處理下,mgt6突變體和MGT6 RNAi(#8)植株的葉肉細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、皺縮(圖5),且較野生型明顯縮小,僅為野生型葉肉細(xì)胞大小的49.1%(圖6);但當(dāng)在高鎂培養(yǎng)基(6 mmol/L Mg2+)中加入1 mmol/L Ca2+后,mgt6突變體和MGT6 RNAi(#8)植株的葉肉細(xì)胞形態(tài)明顯變規(guī)則,皺縮現(xiàn)象減輕(圖5),同時,葉肉細(xì)胞大小也逐漸得到恢復(fù),恢復(fù)至野生型葉肉細(xì)胞大小的57.2%(圖6);當(dāng)在高鎂培養(yǎng)基(6 mmol/L Mg2+)中加入 3 mmol/L Ca2+后,mgt6 突變體和MGT6 RNAi(#8)植株的葉肉細(xì)胞形態(tài)、大小均逐漸恢復(fù)至野生型水平(圖5,圖6)。上述結(jié)果進(jìn)一步說明,mgt6突變體和MGT6 RNAi(#8)植株的高鎂敏感表型能被一定濃度的Ca2+拮抗,MGT6能通過調(diào)控細(xì)胞鈣鎂離子動態(tài)平衡來響應(yīng)高鎂脅迫。

圖5 高鎂條件下不同濃度Ca2+對mgt6突變體及RNAi植株葉肉細(xì)胞形態(tài)的影響(標(biāo)尺:10 μm)Fig.5 Influence of different Ca2+concentrations on the morphology of mesophyll cells of mgt6 mutants and RNAi plants treated with a high Mg2+concentration(scale bar:10 μm)

圖6 不同濃度Ca2+對高鎂(6 mmol/L Mg2+)處理下mgt6突變體及RNAi植株葉肉細(xì)胞大小的影響*代表與WT相比有顯著性差異(P＜0.01)。Fig.6 Influence of different Ca2+concentrations on the size of mesophyll cells of the mgt6 mutants and RNAi plants treated with a high Mg2+concentration(6 mmol/L)Asterisks represent significant difference compared with WT(*P＜0.01 by Student’s t test).

3 討論

鎂是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素之一,在植物的生長發(fā)育中起著非常重要的作用。但到目前為止,有關(guān)植物吸收和運輸Mg2+的分子機(jī)制報道較少。MGT6是植物中第一個被報道定位于細(xì)胞質(zhì)膜,并在低鎂條件下介導(dǎo)植物根部吸收Mg2+的蛋白質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn),MGT6的突變體和RNAi植株對高鎂敏感,該高鎂表型能被一定濃度的Ca2+拮抗。這說明MGT6可能通過調(diào)控鈣鎂離子動態(tài)平衡來響應(yīng)高鎂脅迫。

Ca2+和Mg2+是植物中十分豐富的二價陽離子,二者在植物細(xì)胞中可能具有拮抗作用,因此植物通過鈣鎂離子含量之間的平衡以獲得最適的生長和發(fā)育。維持這種平衡以應(yīng)對土壤營養(yǎng)變化是植物礦物營養(yǎng)的重要特征。研究發(fā)現(xiàn),植物能感知營養(yǎng)變化并經(jīng)過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運蛋白活性,從而適應(yīng)環(huán)境營養(yǎng)變化[13～14]。目前,人們已鑒定出一些離子通道和轉(zhuǎn)運蛋白家族,它們幫助Ca2+、Mg2+跨質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運。在細(xì)胞和植株水平協(xié)調(diào)這些轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的活性可控制Ca2+和Mg2+的營養(yǎng)水平[11]。植物中鈣鎂離子含量的平衡緊密相連,并且可能(至少部分)由共同的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)。但到目前為止,研究人員對植物通過鈣鎂平衡來響應(yīng)高鎂脅迫的分子機(jī)制還了解甚少。

本研究發(fā)現(xiàn),擬南芥鎂轉(zhuǎn)運體MGT6的突變體mgt6和RNAi植株具有地上部分矮小、葉片發(fā)黃、葉鮮重顯著下降的高鎂敏感表型,這種高鎂表型能被外源施加的一定濃度的Ca2+互補(bǔ)。葉片細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的比較分析顯示:高鎂條件下,mgt6突變體及MGT6 RNAi植株的葉肉細(xì)胞減小,形態(tài)不規(guī)則;但隨著培養(yǎng)基中Ca2+濃度的增加,mgt6突變體及RNAi植株的葉肉細(xì)胞逐漸增大,細(xì)胞形態(tài)逐漸變得規(guī)則,當(dāng)在培養(yǎng)基中加入3 mmol/L Ca2+時,突變體及RNAi植株的葉肉細(xì)胞大小和形態(tài)恢復(fù)到野生型水平。這進(jìn)一步說明,mgt6突變體及MGT6 RNAi植株的高鎂敏感表型能被一定濃度的Ca2+拮抗。

綜上所述,MGT6在高鎂條件下能通過參與植物鈣鎂離子動態(tài)平衡來響應(yīng)高鎂脅迫,維持植物在高鎂脅迫下的正常生長發(fā)育。但在高鎂條件下,MGT6誘導(dǎo)出植物細(xì)胞特異的Ca2+信號來維持植物Mg2+動態(tài)平衡進(jìn)而響應(yīng)高鎂脅迫的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。另外,對于Ca2+/Mg2+平衡,我們應(yīng)繼續(xù)完善調(diào)節(jié)和協(xié)調(diào)土壤營養(yǎng)狀態(tài)不斷變化下的Ca2+、Mg2+轉(zhuǎn)運過程的信號網(wǎng)絡(luò)?？偟膩碇v,揭示植物Ca2+和Mg2+平衡的分子機(jī)制將有助于改善作物的營養(yǎng)特性,從而提高作物產(chǎn)量,最終提高人類的健康水平。