林建城 胡建輝 吳欽端

(莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院,福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點實驗室,生態(tài)環(huán)境及其信息圖譜福建省高等學(xué)校重點實驗室(莆田學(xué)院),莆田 351100)

長期以來對魚類消化道的消化酶如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等已有相當(dāng)多的研究,但對魚類如何利用和消化含幾丁質(zhì)的食物知之甚少,這一問題近年來逐漸得到學(xué)者們的重視[1]。Matsumiya等[2]從大瀧六線魚(Hexagrammos otakii)和日本鮐(Scomber japonicas)胃中分離到幾丁質(zhì)酶,證實了魚類消化道幾丁質(zhì)酶具有很強的底物專一性,與幾丁質(zhì)的消化生理密切相關(guān);Ikeda等[3]先從白姑魚(Pennahia argentatus)胃中分離到一種分子量為56 kD的幾丁質(zhì)酶(PaChiB),證明是一種內(nèi)切型幾丁質(zhì)酶;后從三線磯鱸(Parapristipoma trilineatum)胃中也分離到PtChiA和PtChiB兩種幾丁質(zhì)酶同工酶,它們均可從幾丁寡糖(GlcNAc)n非還原端的第二和第三糖苷鍵優(yōu)先進行降解[4];接著又從褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)胃中提取分離到SmChiA、SmChiB和SmChiC三種幾丁質(zhì)酶同工酶,其中SmChiA和SmChiB可降解幾丁寡糖(GlcNAc)n非還原端的第二糖苷鍵,SmchiC則是優(yōu)先降解第三糖苷鍵,認(rèn)為魚類消化道含有一種降解幾丁質(zhì)的酶系統(tǒng),可以有效地降解從食物中攝入的幾丁質(zhì)[5]。而Kawashima等[6]從日本沙丁魚(Sardinops melanostictus)胃中也分離到分子量為45和56 kD的兩種幾丁質(zhì)酶同工酶,并預(yù)測了其三維結(jié)構(gòu)模型;相似地,黃金鳳等[7]近期研究發(fā)現(xiàn),吉富羅非魚(Oreochromis niloticus)在前腸和中腸能高表達3種幾丁質(zhì)酶tChit1a、tChi3和tChit,而在胃中表達量很少,推測可能與羅非魚棲息地是在水體中下層,食性為雜食性、食物中含蝦蟹殼較少有關(guān),并認(rèn)為這些幾丁質(zhì)酶主要功能可能不是降解幾丁質(zhì)。

幾丁質(zhì)酶系包括有內(nèi)切型和外切型幾丁質(zhì)酶,乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase,EC3.2.1.52)是幾丁質(zhì)酶系組成分之一,具有外切酶性質(zhì),可將幾丁質(zhì)外切形成N-乙酰葡萄糖胺單體和幾丁寡聚糖[8]。目前對節(jié)肢動物NAGase已有不少研究,Kogo等[9]從家蠶(Bombyx mori)表皮層和消化道中獲得NAGase,研究表明分布在表皮層的NAGase與其成蟲化蛹和蛻皮生長密切相關(guān),而分布在內(nèi)臟的NAGase主要功能是消化含幾丁質(zhì)的食物,與蛻皮無關(guān);研究結(jié)果普遍認(rèn)為節(jié)肢動物外表皮NAGase主要是參與調(diào)節(jié)周期性蛻皮和新表皮形成的生理過程,而內(nèi)臟NAGase可能主要是參與消化含幾丁質(zhì)的食物。近年來,魚類消化道NAGase的功能與性質(zhì)也逐漸得到關(guān)注。Kakizaki等[10]從日本鮐和白姑魚消化道分離到高活性的內(nèi)切型幾丁質(zhì)酶和外切型NAGase,發(fā)現(xiàn)酶在兩種魚胃中表達有所不同,可能是與魚食性不同有關(guān);陳曉佳等[11]從尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)肝臟分離到NAGase,闡明了其酶學(xué)性質(zhì)和功能基團;從此,對魚類消化道NAGase有了初步認(rèn)識。

日本鰻鱺(Anguilla japonica)隸屬于鰻鱺目鰻鱺科,為降河洄游魚類,在海水中繁殖、淡水中生長,成鰻主要以魚、蝦、蟹和水生昆蟲等水生生物為食,人工飼養(yǎng)下主要攝食的是人工配合飼料,是一種我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類。有報道鰻鱺消化道內(nèi)存在較高的幾丁質(zhì)酶活力,可以利用含幾丁質(zhì)的食物[12],但對日本鰻鱺外切型NAGase還未有研究。為此,本課題擬從日本鰻鱺腸道中提取分離NAGase,研究其酶學(xué)性質(zhì)和功能基團,并探討環(huán)境因素對鰻鱺消化道NAGase的影響,為進一步闡明鰻鱺消化道幾丁質(zhì)酶系的結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

日本鰻鱺出自莆田市東源水產(chǎn)食品有限公司,挑選體長(43±2) cm的無病害活鰻為試材,解剖取其小腸部分,剔除肝臟、表面分布的脂肪等附著物,無離子水清洗后瀝干,每樣品袋裝入1條鰻鱺的小腸,凍藏待用。

NAGase底物為對硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-β-D-GlcNAc),系上海醫(yī)藥工業(yè)研究院生化室產(chǎn)品,分離純化使用的Sephadex G-100是Pharmacia產(chǎn)品,DEAE-32系Whatman分裝,牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,電泳使用的低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(Phosphorylase b 98.0 kD、牛血清白蛋白BSA 66.0 kD、Egg Albumin 47.0 kD、Carbonic Anhydrase 30.0 kD、Trypsin Inhibitor 22.0 kD和α-Lactabumin 14.4 kD)由天根生化科技有限公司出品?；瘜W(xué)修飾劑對氯汞苯甲酸(pCMB)和苯甲基磺酰氟(PMSF)是Sigma產(chǎn)品;乙酸酐(AcAn)、三硝基苯磺酸(TNBS)、二巰基蘇糖醇(DTT)、乙酰丙酮(AcAc)、溴代乙酸(BrAc)、N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)及金屬化合物等藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

日本鰻鱺腸道NAGase的提取與分離隨機取3個樣品袋,小腸解凍后切成1 cm小段,共取樣100 g,加入300 mL預(yù)冷的0.01 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.4),10000 r/min下?lián)v碎勻漿1min,4℃抽提4h以上,20000×g冷凍離心30min,取上清液。依次采用35%,75%飽和度硫酸銨分級分離酶蛋白,收集沉淀物,透析后冷凍離心(25000×g) 30min,得粗酶制劑。先經(jīng)過Sephadex G-100分子篩凝膠柱(柱規(guī)格為2.6 cm×60 cm)層析分離,洗脫液是0.01 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.4,含0.2 mol/L NaCl),流速為0.4 mL/min,自動部分收集器收集流出液,按每管4 mL收集,收集110管,集中酶活力峰周圍的收集管,收集酶液,并繼續(xù)用于DEAE-32離子交換柱(柱規(guī)格為1.6 cm×40 cm)層析,同樣的緩沖液洗脫,內(nèi)含NaCl (0—1.0 mol/L)直線梯度洗脫,流速為0.25 mL/min,每管收集5 mL,收集酶活力峰的洗脫酶液,透析后用于酶蛋白的純度鑒定和酶學(xué)性質(zhì)研究。采用Bradford[13]的方法測定收集液的蛋白濃度,以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,結(jié)果以A280表示。

日本鰻鱺NAGase純度鑒定采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和SDS-PAGE鑒定酶純度,分離膠和濃縮膠濃度分別為 10和3.75,考馬斯亮藍R250染色。

日本鰻鱺NAGase相對分子質(zhì)量的測定從SDS-PAGE電泳圖譜測定NAGase蛋白亞基相對分子質(zhì)量,以各標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率(變量x)對相應(yīng)分子質(zhì)量的對數(shù)(變量y)作圖,從樣品的相對遷移率求出酶蛋白亞基的相對分子質(zhì)量。

日本鰻鱺NAGase等電點的測定參照文獻[14]方法,采用等電點聚焦電泳分離法測定NAGase等電點。

日本鰻鱺NAGase活力測定體系NAGsae活力測定參照文獻[14]的方法進行。2 mL的測活體系包含有: 5 mmol/L底物0.2 mL、75 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH 6.0) 1.0 mL、dd H2O 0.78 mL,37℃預(yù)保溫10 min后,加入濃度為0.111 mg/mL的NAGsae純酶制劑20 μL,此條件下催化反應(yīng)10min,以0.5 mol/L氫氧化鈉(NaOH)終止反應(yīng),在405 nm波長下測定反應(yīng)液的光吸收值A(chǔ)405,設(shè)立空白對照組,在此測活體系中測定NAGase活力,對其酶學(xué)性質(zhì)進行研究。

1個酶活力單位(U)定義為: 每min催化水解產(chǎn)生1 μmol/L對硝基苯酚(pNP)所需要的酶量。比活力單位為U/mg。

pH對日本鰻鱺NAGase活力的影響在NAGase活力測定體系中,測定不同pH3.2—10.0下的NAGase活力,其中pH 3.2—5.8選擇醋酸-醋酸鈉緩沖液,pH 5.8—8.0使用NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液,pH 9.0—10.0采用硼砂-NaOH緩沖液,根據(jù)不同酸堿度下測定的NAGase活力,確定酶的最適pH;再將NAGsae純酶制劑(0.111 mg/mL)分別與各種不同pH(pH 3.2—10.0)的緩沖液等量混合,在4℃下孵育1h,取出20 μL處理過的酶制劑,分別加入已在37℃中預(yù)保溫10min的反應(yīng)體系(含5 mmol/L底物0.2 mL,75 mmol/L pH 6.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液1.0 mL,dd H2O 0.78 mL)中,催化反應(yīng)10min,分別測定剩余酶活力,計算各試驗組的相對酶活力(%),分析NAGsae的酸堿穩(wěn)定性。

溫度對日本鰻鱺NAGsae活力的影響在測活體系中,檢測不同溫度(20—90℃)下NAGsae的活力,酶活力最大的試驗溫度確定為NAGsae的最適溫度;再將NAGsae純酶制劑(0.111 mg/mL)置于各種不同溫度(4—90℃)下分別處理1h,取出20 μL處理過的酶制劑,分別加入已在37℃中預(yù)保溫10min的反應(yīng)體系(含5 mmol/L底物0.2 mL,75 mmol/L pH 6.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液1.0 mL,dd H2O 0.78 mL)中,催化反應(yīng)10min后檢測其剩余酶活力,計算各試驗組的相對酶活力(%),確定NAGsae的溫度穩(wěn)定性范圍。

日本鰻鱺NAGase酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的測定在測活體系中,僅僅改變底物濃度([S]范圍:0.15—1.5 mmol/mL),測定不同底物濃度下的NAGase活力(以表示酶促反應(yīng)速度v),以1/v對1/[S]作圖,利用Lineweaver-Burk作圖法求出酶的米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速度(Vmax)值。

金屬離子對日本鰻鱺NAGase活力的影響在測活體系中,先分別加入終濃度均為10 mmol/L的NaCl、NaNO3、Na2SO4和Li2SO4,測定NAGase活力,探討Na+、Li+、Cl-、NO3-和SO42-對NAGase的影響;再分別加入MgSO4、CaCl2、BaCl2、Cu2SO4、ZnSO4、FeSO4和FeCl3,終濃度均為0.5 mmol/L,以及分別加入0.1 mmol/L MnCl2、1 mmol/L Pb(NO3)2和1 μmol/L HgCl2,測定不同金屬離子作用下的NAGase活力,以相對酶活力(%)表示,分析金屬離子對日本鰻鱺NAGsae活力的影響。

日本鰻鱺NAGsae酶蛋白的化學(xué)修飾NAGsae的修飾方法以及修飾酶活力測定方法參照文獻[15]。采用AcAc、pCMB、BrAc、PMSF和NBS分別作為酶蛋白精氨酸(Arg)胍基,半胱氨酸(Cys)巰基、組氨酸(His)咪唑基、絲氨酸(Ser)羥基和色氨酸(Trp)吲哚基的修飾劑,DTT為酶蛋白中二硫鍵的修飾劑,AcAn為酶蛋白氨基、TNBS為賴氨酸(Lys)ε-氨基的修飾劑。將純酶分別與8種不同修飾劑以1∶3體積混合修飾30min,在NAGsae測活體系中測定各修飾酶的活力,設(shè)定未修飾酶活力為100%,測定修飾酶的相對酶活力(%),研究不同修飾劑對酶的修飾效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 日本鰻鱺腸道NAGase的提取與分離

日本鰻鱺腸道NAGsae粗酶制劑經(jīng)過葡聚糖凝膠柱層析分離,從層析圖譜(圖1a)可知,獲得了3個蛋白峰,只有第2個小蛋白峰的區(qū)間具有NAGase活性,將收集到的酶制劑經(jīng)DEAE-32纖維素離子交換柱層析,從層析圖譜(圖1b)可見2個蛋白峰,僅僅第1個蛋白峰區(qū)間具有NAGase活性,收集酶活力峰周圍的酶液,獲得酶比活力為2517.40 U/mg,得率為54.99%,純化倍數(shù)為27.71的NAGase酶制劑;進一步分析分離純化方案,結(jié)果(表1)顯示,分離純化期間NAGase比活力和純化倍數(shù)得到不斷升高,酶得率緩慢下降,最后獲得的酶制劑純度大、得率高,說明該純化方案簡單又高效。

圖1 日本鰻鱺腸道NAGase的Sephadex G-100(a)和DEAE-32(b)柱層析圖譜Fig. 1 Column chromatography of NAGase from intestine of Anguilla japonica on Sephadex G-100 column (a) and DEAE-cellulose (b)

表1 日本鰻鱺腸道NAGase的分離純化Tab. 1 Purification of NAGase from intestine of Anguilla japonica

將純化的NAGase酶制劑經(jīng)PAGE和SDSPAGE電泳鑒定,從圖2可知兩種電泳的結(jié)果均只有單一蛋白帶,可判斷NAGase酶制劑已達到電泳純;進一步以圖2b中各標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率(變量x)對相應(yīng)分子質(zhì)量的對數(shù)(變量y)作圖,回歸一直線方程為:y＝-1.646x+5.207,求得NAGase酶蛋白亞基的相對分子質(zhì)量為69.98 kD;將純酶經(jīng)等電點聚焦電泳,測得日本鰻鱺NAGase等電點pI為4.98。

圖2 日本鰻鱺NAGase的PAGE(a)及SDS-PAGE(b)電泳圖譜Fig. 2 PAGE (lane a) and SDS -PAGE (lane b) of the purified NAGase from intestine of Anguilla japonica (Mw molecular weight standard)

2.2 pH對日本鰻鱺NAGase活力的影響

日本鰻鱺NAGase最適pH為6.0(圖3a),pH偏離6.0越大,NAGase活力越小;NAGase在pH 4.8—7.2區(qū)域內(nèi)相對穩(wěn)定,在pH 9.0環(huán)境中酶活力僅剩余34.9%,在pH 4.0以下偏酸的環(huán)境中酶失活加速(圖3b)。這說明日本鰻鱺NAGase活力易受環(huán)境中酸堿度變化的影響。

圖3 pH對日本鰻鱺NAGase活力的影響Fig. 3 Effects of pH on the activity of NAGase from intestine ofAnguilla japonica

2.3 溫度對日本鰻鱺NAGase活力的影響

由圖4可見,日本鰻鱺腸道NAGase的最適溫度為60℃,溫度在60℃以上酶活力快速下降,溫度達80℃時,酶失活 89.6(圖4a);在60℃溫度以下,NAGase具有較好的熱穩(wěn)定性,65℃以上酶穩(wěn)定性迅速下降,在70℃環(huán)境內(nèi)處理1h,酶活力僅剩余10.3,90℃下NAGase接近失活(圖4b)。

2.4 日本鰻鱺NAGase酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的測定

在0.15—1.5 mmol/mL [S]下,測定不同[S]對日本鰻鱺NAGase活力(v)的影響,結(jié)果(圖4)顯示,隨著[S]的增大,酶反應(yīng)速度v也增大。以1/v對1/[S]作圖(圖5),得到1條直線,直線方程為:y=0.044x+0.131,R2=0.9985;以據(jù)此方程求得日本鰻鱺NAGase水解底物pNP-β-D-GlcNAc的Km值為0.336 mmol/L,Vmax值為7.634 μmol/(L·min)。

圖4 溫度對日本鰻鱺NAGase活力的影響Fig. 4 Effects of temperature on the activity of NAGase from intestine of Anguilla japonica

圖5 日本鰻鱺NAGase催化底物水解的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖Fig. 5 The Lineweaver-Burk plot of NAGasefrom Anguilla japonica for the hydrolysis of substrate

2.5 金屬離子對日本鰻鱺NAGase活力的影響

從表2可知,Na+、Li+、Cl-、NO3-和SO42-對NAGase活力幾乎沒有影響;0.5 mmol/L Mg2+、Ca2+、Cu2+和Fe3+可分別使日本鰻鱺腸道NAGase活力提高16.72%、8.34%、4.15%和51.56%,0.1 mmol/L的Mn2+可使酶活力提高34.14%,這些金屬離子對NAGase呈現(xiàn)不同程度的激活作用;0.5 mmol/L Ba2+對NAGase活力幾乎沒有影響;而0.5 mmol/L Zn2+和Fe2+可分別使NAGase活力喪失9.27%和45.38%,對酶呈現(xiàn)抑制作用。10.0 mmol/L Pb2+和1.0 μmol/L Hg2+可分別使酶活力喪失65.17 %和83.69 %,Hg2+的抑制作用最強。

表2 金屬離子對日本鰻鱺NAGase活力的影響Tab. 2 Effects of metal ions on the activity of NAGase from intestine of Anguilla japonica

2.6 日本鰻鱺NAGase的必需基團

胍基和氨基的化學(xué)修飾AcAc能專一修飾蛋白質(zhì)Arg中的胍基[11],實驗結(jié)果(圖6a)表明,AcAc在0—200 mmol/L,對NAGase修飾后,酶活力幾乎不受影響,由此判斷Arg胍基不是日本鰻鱺NAGase活性所必需的。AcAn是蛋白質(zhì)氨基的修飾劑[16],實驗表明,NAGase經(jīng)AcAn修飾后,酶活力呈不斷下降趨勢(圖6a),說明氨基是日本鰻鱺NAGase活力所必需的;而TNBS是Lys中ε-氨基的一種有效修飾劑[15],隨TNBS濃度增大,修飾后NAGase活力不斷下降,經(jīng)20 mmol/L TNBS修飾后酶活力幾乎全部喪失(圖6b),說明Lys的ε-氨基是日本鰻鱺NAGase的必需基團。

巰基與二硫鍵的化學(xué)修飾pCMB是Cys巰基的專一修飾劑[16],NAGase經(jīng)pCMB修飾后,隨pCMB濃度增大,酶活力呈不斷下降趨勢,當(dāng)pCMB修飾濃度達0.5 mmol/L時,酶活力僅剩16.11%(圖6c),結(jié)果顯示,巰基是日本鰻鱺NAGase活性的必需基團。而DTT是蛋白質(zhì)分子中二硫鍵的有效修飾劑之一,DTT修飾后酶蛋白的二硫鍵斷裂,酶空間構(gòu)象可能發(fā)生變化[15]。NAGase經(jīng)DTT修飾后,酶活力呈下降趨勢,當(dāng)DTT濃度達到100 mmol/L時,NAGase活力喪失了81.29%(圖6d),說明日本鰻鱺NAGase酶蛋白的二硫鍵與酶活力息息相關(guān),酶蛋白穩(wěn)定的空間構(gòu)象是酶活性所必需的。

咪唑基、羥基和吲哚基的化學(xué)修飾BrAc在酸性條件下能專一地修飾蛋白質(zhì)His的咪唑基[17]。結(jié)果表明,隨BrAc濃度增大,修飾后NAGase活力不斷下降,150 mmol/L BrAc修飾NAGase后,酶幾近失活(圖6d),His咪唑基是日本鰻鱺NAGase活性的必需基團。PMSF可對蛋白質(zhì)分子中Ser羥基進行專一修飾[15],不同濃度PMSF修飾NAGase后,酶活力呈不斷下降趨勢,50 mmol/L PMSF修飾NAGase后,酶活力僅剩4.28%(圖6e),說明Ser的羥基與日本鰻鱺NAGase活性密切相關(guān),是酶活性的必需基團。此外,NBS是蛋白質(zhì)中Trp吲哚基的特異修飾劑[17],NAGase被NBS修飾后,酶活力快速下降,僅100 μmol/L濃度的NBS,可使酶活力下降94.69%(圖6f),說明吲哚基為該酶的必需基團。

圖6 八種化學(xué)修飾劑對日本鰻鱺NAGase活力的影響Fig. 6 The effects of eight chemical modification reagents on the activity of NAGase from intestine of Anguilla japonica

3 討論

3.1 動物NAGase的基本酶學(xué)性質(zhì)

不種動物來源的NAGase其酶學(xué)性質(zhì)存在差異。尼羅羅非魚肝臟NAGase是由一個蛋白亞基組成,蛋白亞基分子質(zhì)量為61.8 kD,Km為0.229 mmol/L[11];而尼羅羅非魚[18]精巢中的NAGase,分子量則為118.0 kD,Km是0.67 mmol/L;從昆蟲類菜青蟲(Pieris rapae)[19]外表皮來源的NAGase是由相對分子質(zhì)量分別為59.5和57.2 kD的兩個蛋白亞基組成,Km為0.285 mmol/L;蝦類體內(nèi)的NAGase,如凡納濱對蝦(Penaeus vannamei)[14]內(nèi)臟NAGase是由兩個相同蛋白亞基組成,亞基分子質(zhì)量為45 kD,Km= 0.254 mmol/L;而來自蟹類節(jié)肢動物的NAGase,Zhang等[20]報道的鋸緣青蟹(Scylla serrata)內(nèi)臟NAGase也是由兩個相對分子質(zhì)量均為65.8 kD的蛋白亞基組成,Km為0.424 mmol/L。實驗結(jié)果表明,日本鰻鱺腸道NAGase酶蛋白亞基分子質(zhì)量相對較大,為69.98 kD,Km= 0.336 mmol/L。比較不同動物NAGase水解底物pNP-β-D-GlcNAc的Km值大小,說明尼羅羅非魚肝臟NAGase對底物親和力相對較大。

在研究pH(3.2—10.0)對日本鰻鱺腸道NAGase活力的影響中,為了盡量減少環(huán)境因素對酶活力的影響,分段選用了成分簡單的醋酸-醋酸鈉、NaH2PO4-Na2HPO4及硼砂-NaOH等3種常用緩沖液。廣范圍緩沖液(pH 2.6—12.0)組成分包括檸檬酸、KH2PO4、硼酸、巴比妥和NaOH等,成分較為復(fù)雜,可能會對酶活力產(chǎn)生影響,引起實驗誤差。而3種成分簡單的緩沖液雖然離子強度有所不同,但都是Na+型的,Na+對NAGase活力幾乎沒有影響,實驗誤差相對小些。

pH對來自不同動物NAGase的影響存在差異,本實驗表明: 日本鰻鱺腸道NAGase的最適pH為6.0,與菜青蟲[19]表皮NAGase最適pH (6.2)及尼羅羅非魚[11]肝臟NAGase最適pH (5.8)相近,高于凡納濱對蝦[14]內(nèi)臟NAGase的最適pH (5.2)及中國鱟(Tachypleus tridentatus)[21]內(nèi)臟NAGase最適pH (5.4),這些來源不同的NAGase最適pH均偏向酸性。

在溫度對動物NAGase影響的研究中,尼羅羅非魚[11]肝臟NAGase和中國鱟[21]內(nèi)臟NAGase的最適溫度均為55℃,蜜蜂(Apis mellifera ligustica)[22]NAGase的最適溫度為60℃,而凡納濱對蝦[14]和中華絨鰲蟹(Eriocheir sinensis)[23]內(nèi)臟NAGase最適溫度均是45℃,本實驗日本鰻鱺腸道NAGase的最適溫度為60℃。這些不同動物來源的NAGase其最適溫度存在差異,應(yīng)該是生物進化中各自長期適應(yīng)不同生活環(huán)境的結(jié)果。此外,它們的最適溫度均較高(≥45℃),超出普通生存環(huán)境的溫度,而這些節(jié)肢動物或魚類又都是變溫動物,因此,在適宜生存的環(huán)境溫度下這些動物的NAGase活力都處于較低水平。日本鰻鱺養(yǎng)殖的適宜水溫為13—30℃[24],此溫度下腸道NAGase活力較低,直接影響鰻鱺腸道對甲殼質(zhì)類多糖的消化。

3.2 NAGase的酸堿穩(wěn)定性與熱穩(wěn)定性

凡納濱對蝦[14]內(nèi)臟NAGase在pH 4.2—10.0穩(wěn)定,豬[25]精液堿性NAGase在pH 3.0—8.9穩(wěn)定,鋸緣青蟹[20]內(nèi)臟和尼羅羅非魚[11]肝臟的NAGase則分別在pH 4.6—8.6、pH 4.0—9.0穩(wěn)定,這些NAGase在偏酸偏堿性環(huán)境中均較穩(wěn)定;在本實驗中,日本鰻鱺腸道NAGase的酸堿穩(wěn)定范圍為pH 4.8—7.2,在pH 8.0下孵育1h后,NAGase活力只剩61.35%,不耐堿性。這說明不同來源的NAGase其最適pH和酸堿穩(wěn)定范圍均存在差異,可能是由于不同動物來源NAGase的分子結(jié)構(gòu)、活性中心構(gòu)象及其所處微環(huán)境不同所致[23]。日本鰻鱺腸道NAGase的最適pH偏酸性,而鰻鱺腸道蛋白酶、淀粉酶的最適pH是偏堿性的[26],說明鰻鱺腸道內(nèi)消化酶的最適pH值大小主要是由酶自身特性決定的,與所處腸道的內(nèi)環(huán)境關(guān)系不大。此外,成鰻又適宜生長在偏堿性(pH 7.2—9.0)水體中[24],偏堿性的養(yǎng)殖水體能否影響到鰻鱺腸道內(nèi)環(huán)境,進而影響腸道內(nèi)NAGase的活性,還有待進一步研究。

不同動物來源的NAGase熱穩(wěn)定性不同。尼羅羅非魚[11]肝臟NAGase熱穩(wěn)定性范圍為0—55℃,中國鱟[21]內(nèi)臟NAGase在20—50℃溫度內(nèi)穩(wěn)定,而中華絨鰲蟹[23]內(nèi)臟NAGase在10—40℃內(nèi)酶較為穩(wěn)定,在本實驗中,日本鰻鱺腸道NAGase在4—60℃范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性,熱穩(wěn)定性范圍較大,這可能與鰻鱺長期適應(yīng)了從深海到河流洄游這一較大水溫變化的生活習(xí)性相關(guān)。酶在較低溫度下通常較為穩(wěn)定,但是,隨著環(huán)境溫度升高,酶的空間構(gòu)象發(fā)生了變化,酶開始變性失活,凡納濱對蝦[14]內(nèi)臟、鋸緣青蟹[20]內(nèi)臟、菜青蟲[19]表皮和尼羅羅非魚[18]精巢的NAGase在45℃以上均迅速失活,尼羅羅非魚[11]肝臟NAGase在55℃以上穩(wěn)定性也迅速降低,而日本鰻鱺腸道NAGase在65℃以上也迅速失活,說明不同動物來源的NAGase可能由于空間構(gòu)象的剛性不同,對溫度的敏感性存在差異,酶變性失活所需的溫度也不同。

3.3 金屬離子對不同動物來源NAGase的影響

Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+和Fe3+等5種金屬離子對日本鰻鱺腸道NAGase活力有不同程度的激活作用。Mg2+和Ca2+往往是酶的激活劑,對凡納濱對蝦[14]內(nèi)臟NAGase和鋸緣青蟹[20]內(nèi)臟NAGase均有激活作用,但對尼羅羅非魚[18]精巢和蜜蜂[22]的NAGase幾乎沒有影響;Mn2+對凡納濱對蝦[14]內(nèi)臟NAGase也呈現(xiàn)激活作用,但對尼羅羅非魚[18]精巢NAGase和中國鱟[21]內(nèi)臟NAGase又有抑制作用。此外,Cu2+對鋸緣青蟹[20]內(nèi)臟NAGase、菜青蟲[19]外表皮NAGase和羅非魚[18,27]精巢NAGase都有不同程度抑制作用,Fe3+對中國鱟[21]、凡納濱對蝦[14]的內(nèi)臟NAGase也均呈現(xiàn)較強抑制作用,而本實驗結(jié)果卻有所不同。

實驗結(jié)果表明,Ba2+對日本鰻鱺腸道NAGase幾乎沒有影響,與Ba2+對中華絨鰲蟹[23]內(nèi)臟NAGase沒有影響相似,但Ba2+對鋸緣青蟹[20]內(nèi)臟NAGase又有抑制效應(yīng)。Zn2+、Pb2+和Hg2+這3種重金屬離子經(jīng)常是酶的強烈抑制劑,對凡納濱對蝦[14]內(nèi)臟和中華絨鰲蟹[23]內(nèi)表皮的NAGase均具有不同的抑制效應(yīng),而Zn2+、Pb2+和Hg2+對日本鰻鱺腸道NAGase也同樣呈現(xiàn)不同程度的抑制效應(yīng),其中Hg2+對酶抑制作用較強,1.0 μmol/L Hg2+可使日本鰻鱺NAGase活力喪失83.69%。總之,金屬離子效應(yīng)物對動物NAGase具有調(diào)控作用。因此,鰻鱺養(yǎng)殖水體中的金屬離子,以及養(yǎng)殖飼料中所添加的礦物質(zhì)或微量元素,通過鰻鱺攝食進入腸道后,均可對腸道NAGase活力產(chǎn)生調(diào)控,進而對甲殼質(zhì)類多糖的消化生理產(chǎn)生影響。

3.4 NAGase活性的必需基團

化學(xué)修飾法試驗結(jié)果表明,Lys的ε-氨基、Cys巰基、His咪唑基、Ser羥基和Trp吲哚基都是日本鰻鱺NAGase活性所必需的,這與中國鱟[15]內(nèi)臟NAGase活性的必需基團相同,而尼羅羅非魚[11]肝臟NAGase活性必需基團包含有氨基、His咪唑基和Trp吲哚基;菜青蟲[28]表皮NAGase中也包含有Cys巰基、His咪唑基和Trp吲哚基等酶活性的必需基團,但Lys的ε-氨基不是菜青蟲表皮NAGase活性所必需;巰基與吲哚基也是槐豬精液NAGase的必需基團[29]。相似的是,Arg胍基均不是這些動物NAGase的必需基團,而二硫鍵又都是這些動物NAGase活性所必須的,在維系酶蛋白穩(wěn)定的空間構(gòu)象中發(fā)揮重要作用。

綜上所述,日本鰻鱺腸道NAGase經(jīng)過35%和75%飽和硫酸銨沉淀分級分離、Sephadex G-100分子篩凝膠和DEAE-32離子交換的柱層析分離,可得到比活力為2517.40 U/mg純酶制劑,該分離純化方案有效可行;NAGase蛋白亞基分子質(zhì)量為69.98 kD,其Km值和Vmax值分別為0.336 mmol/L和7.634 μmol/(L·min),酶活力易受環(huán)境中酸堿度、溫度和金屬離子的影響;Lys中ε-氨基、Cys巰基、His咪唑基、Ser羥基和Trp吲哚基是酶的必需基團,二硫鍵是NAGase活性所必需的,而Arg胍基不是酶的必需基團,日本鰻鱺腸道NAGase與其他不同動物來源的NAGase具有相似的必需基團。