季 寧 魏 偉 郭家鴻 王俊亞 李耀國(guó) 肖調(diào)義 鄒 鈞,

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306;2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心,長(zhǎng)沙 410128)

草魚(yú)病毒性出血病是草魚(yú)(Ctenopharyngodon idella)常見(jiàn)病中危害最大的傳染病,草魚(yú)呼腸孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)是導(dǎo)致該病的主要病原[1]。草魚(yú)出血病流行廣、致死率高、發(fā)病季節(jié)長(zhǎng),造成巨大的養(yǎng)殖損失,嚴(yán)重威脅漁業(yè)生產(chǎn)[2,3]。

GCRV是一種雙鏈RNA(Double-stranded RNA,dsRNA)病毒,屬于水生呼腸孤病毒屬(Aquareovirus),是水生呼腸孤病毒中毒性最強(qiáng)的病毒[4]。根據(jù)基因組差異,我國(guó)流行的GCRV可以分為3種基因型[5],其中GCRV-873[6]、GCRV-HZ08[7]和GCRV-104[8]毒株分別為基因Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型的代表株。在報(bào)道的40多株GCRV毒株中[9],GCRV 873株是第一株完成全基因組序列分析的草魚(yú)呼腸孤病毒[10]。GCRV粒子為正二十面體對(duì)稱的球形顆粒,不具囊膜,直徑約為75 nm,其雙層衣殼主要保護(hù)核酸免受外界的影響和破壞。GCRV-I是水生動(dòng)物呼腸孤病毒的模式毒株,其基因組由11條分節(jié)段dsRNA構(gòu)成,病毒編碼的7個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白根據(jù)分子量大小依次定義為VP1—VP7[11],其中VP5和VP7是主要的外衣殼蛋白,病毒外衣殼含有2 0 0個(gè)由VP5/VP7異二聚體組成的三聚體[12]。

VP7蛋白是GCRV-I特有的外衣殼蛋白,由S10片段編碼,在GCRV感染及致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13]。VP7可以結(jié)合dsRNA,與病毒的細(xì)胞吸附有關(guān)[14],尤其在病毒與宿主互作及病毒入胞過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,外衣殼上的三聚體作為受體識(shí)別位點(diǎn)存在[15],故推測(cè)VP7蛋白參與GCRV入侵草魚(yú)細(xì)胞過(guò)程[16]。Chen等[17]的研究發(fā)現(xiàn)感染GCRV草魚(yú)產(chǎn)生的抗血清只能識(shí)別GCRV-I的外衣殼蛋白VP7,表明VP7是GCRV-I的主要抗原蛋白,可較其他結(jié)構(gòu)蛋白誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答,提示VP7蛋白可以作為疫苗設(shè)計(jì)的首選免疫原。He等[18]體外中和試驗(yàn)顯示VP7克隆抗體具有中和活性,表明VP7具有研制GCRV亞單位疫苗的潛力。Luo等[19]的抗體中和試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí),VP7是Ⅰ型GCRV的主要抗原表位,為研制GCRV基因疫苗提供了參考資料。徐詩(shī)英等[20]成功構(gòu)建了vp7基因核酸疫苗,發(fā)現(xiàn)其對(duì)草魚(yú)病毒性出血病有較好的免疫保護(hù)效果,為草魚(yú)呼腸孤病毒核酸疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。劉世旭等[21]制備了基因I型草魚(yú)呼腸孤病毒VP7蛋白合成肽抗體。Hao等[22]研究發(fā)現(xiàn)將GCRV-873的VP7蛋白在大腸桿菌表面表達(dá)作為對(duì)草魚(yú)的免疫保護(hù)作用疫苗也具有良好的免疫效果。由此可見(jiàn),高效的VP7蛋白抗體的開(kāi)發(fā)與鑒定,有助于研發(fā)草魚(yú)出血病的疫苗。

該實(shí)驗(yàn)利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備GCRV-I VP7蛋白及其單克隆抗體,并利用感染GCRV-873的草魚(yú)腎細(xì)胞系(Ctenopharyngodon idelluskidney cell,CIK)開(kāi)展VP7單抗的鑒定,為GCRV-I病毒快速診斷試劑盒的研發(fā)和VP7功能研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和病毒株

草魚(yú)腎細(xì)胞系(CIK)培養(yǎng)溫度為28℃,用含10%血清和1%雙抗的M199培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng),在5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。GCRV-873毒株由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)肖調(diào)義老師惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

包涵體洗滌液(Inclusion body washing buffer)含50 mmol/L Tris-Cl(8.0)、300 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA和0.5% Triton X-100;重懸緩沖液(Resuspension buffer)含50 mmol/L Tris-HCl(8.0)、100 mmol/L NaCl和10 mmol/L EDTA;溶解液(Dissolution buffer)含6 mol/L鹽酸胍、10%甘油、50 mmol/L Tris-HCl(8.0)、100 mmol/L NaCl和10 mmol/L EDTA;蛋白復(fù)性液(Protein refolding buffer)含100 mmol/L Tris-HCl(8.0)、400 mmol/L L-Arg HCl、2 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L GSH(Reduced glutathione)和0.5 mmol/L GSSG(Oxidized glutathione);分子篩柱層析緩沖液(Size exclusion buffer)含20 mmol/L Tris-HCl(8.0)和50 mmol/L NaCl。

1.3 VP7蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá)

VP7原核表達(dá)質(zhì)粒由中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所方勤研究員惠贈(zèng),VP7原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程參考Zhang等[23]的研究,GCRV-I的vp7序列來(lái)自NCBI基因庫(kù)(GenBank: AF403396),vp7片段擴(kuò)增引物順序如下: 正向引物,5′-CATGGATCCCCGATC ATCACCACGAT-3′;反向引物,5′-CGCTGAATTC GATGAAACGAGAGACC-3′,其中下劃線部分分別為BamHΙ和EcoRI酶切位點(diǎn)。從已純化的GCRVI病毒中提取RNA作為基因擴(kuò)增模板,對(duì)vp7基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,利用DNA片段純化回收試劑盒進(jìn)行回收。通過(guò)T4連接酶將PCR純化產(chǎn)物與pRSET-A載體連接,構(gòu)建VP7原核表達(dá)重組質(zhì)粒pR/GCRV-VP7。

將pR/GCRV-VP7轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21和DE3進(jìn)行原核表達(dá),經(jīng)含有氨芐西林抗生素的LB平板和PCR篩選獲得陽(yáng)性單克隆菌落。將挑取的陽(yáng)性克隆菌液接種到1 mL的氨芐液體培養(yǎng)基中,放入37℃搖床培養(yǎng)8h,分裝成兩管,加到10 mL氨芐液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4—0.6后,在一管中加入10 μL濃度為1 mmol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside,IPTG),培養(yǎng)9h,離心棄上清,用PBS 緩沖液(Phosphate buffered saline,PBS)重懸菌體。加入蛋白上樣緩沖液,金屬浴100℃煮沸10min,8000×g離心3min,取上清用于SDS-PAGE檢測(cè)。

1.4 原核表達(dá)蛋白的提取、復(fù)性和純化

將挑選出來(lái)的陽(yáng)性菌株進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá),提取包涵體。用超低溫高壓連續(xù)細(xì)胞破碎儀破碎菌體,離心棄上清,加入20 mL含有1%二硫蘇糖醇(Dithiothreitol,DDT)的包涵體洗滌液洗滌包涵體。棄掉上清后,加入20 mL 重懸液重懸包涵體,吸取20 μL用作SDS-PAGE檢測(cè)包涵體純度,離心棄去上清,加入溶解液溶解包涵體,使其終濃度為20 mg/mL。取5 mL包涵體溶液逐滴加入復(fù)性液中,24h后開(kāi)始濃縮,用300 mmol/L分子篩緩沖液置換后用AKTA Pure分子層析柱進(jìn)行純化,根據(jù)出峰位置收集目的蛋白,取收集到的峰尖和峰末位置的蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳分析。

1.5 動(dòng)物免疫和免疫效價(jià)測(cè)定

將純化后的VP7重組蛋白共計(jì)5 mg提供給北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)有限公司制備單克隆抗體。用純化后的蛋白免疫4只SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠,進(jìn)行4次免疫后,眼眶取血,測(cè)血清效價(jià)。用間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測(cè)定,抗原濃度為2 μg/mL,4℃包被過(guò)夜,用2%脫脂奶粉,37℃封閉2h,血清從200倍開(kāi)始2倍梯度稀釋,空白對(duì)照為磷酸緩沖液稀釋,陰性對(duì)照為陰性血清200倍稀釋。

1.6 單克隆抗體亞型鑒定

將篩選出來(lái)的陽(yáng)性細(xì)胞株進(jìn)行亞類(lèi)鑒定,最后得到5株IgG類(lèi)型陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。用100 mmol/L PBS(pH7.4)稀釋包被抗體至0.5 μg/mL,每孔加0.1 mL,4℃過(guò)夜后PBS-T洗2次,每孔加入200 μL封閉液,37℃孵育2h。PBS-T洗3次后每孔加入100 μL雜交瘤上清,37℃孵育1h。PBS-T洗3次后加入用封閉液1∶2000稀釋的HRP標(biāo)記的抗體(SBA Clonotyping System-HRP,Southern Biotech),每孔0.1 mL,37℃孵育1h。PBS-T洗3次;每孔加50 μL底物溶液,10—20min內(nèi)于雙波長(zhǎng)(450 和630 nm)測(cè)吸光值。

1.7 單克隆抗體特異性分析

GCRV-873感染CIK細(xì)胞樣品、設(shè)置未感染的CIK細(xì)胞為對(duì)照組。感染24h后提取蛋白進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)。采用電轉(zhuǎn)法(25 V,25 mA,7min)將蛋白樣品轉(zhuǎn)至PVDF膜上,用5%脫脂牛奶4℃下封閉PVDF膜2h后,經(jīng)一抗隔夜4℃孵育(VP7單抗1∶1000稀釋)、IRDye-800CW羊抗鼠作為二抗(1∶10000稀釋)4℃孵育1h后,用TBS-T緩沖液清洗3次,每次5min。將PVDF膜置于Odyssey CLx Imaging System拍照分析。

1.8 直接免疫熒光檢測(cè)

將無(wú)菌載玻片置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,加入CIK細(xì)胞,待細(xì)胞達(dá)90%細(xì)胞覆蓋度,感染GCRV-873,同時(shí)設(shè)正常CIK細(xì)胞作為對(duì)照。待出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變后,棄培養(yǎng)液,用PBS緩沖溶液清洗,再用4%多聚甲醛固定細(xì)胞。移去液體,用PBS緩沖溶液洗3次,每次5min。用0.5% Triton-X100室溫通透細(xì)胞。加入足夠量的5%牛血清白蛋白(Bovine albumin,BSA)封閉液,室溫孵育1h。棄去封閉液,加入用5%BSA稀釋異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的VP7單抗(1∶10000比例稀釋抗體),室溫孵育2h。PBS緩沖溶液洗3次后加入DAPI室溫染色10min,PBS緩沖溶液洗3次,每次5min,加入封片劑后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 VP7蛋白氨基酸序列分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載GCRV-873、JX01、JX02、GCRV-096、GZ1208、GCRV-991、GCRV-876和GCRV-875病毒株VP7蛋白的氨基酸序列,通過(guò)ClustalX軟件進(jìn)行多重序列比對(duì),用GeneDoc繪制序列多重比對(duì)圖后發(fā)現(xiàn),除JX02病毒株以外,其他病毒株之間具有一些相似的氨基酸序列,通過(guò)SMART軟件分析氨基酸結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)它們具有一定的結(jié)構(gòu)保守性,同源性較高(圖1)。除JX02以外,其他7株都具有ZZ型鋅指結(jié)構(gòu)域(ZZ-type zinc finger domain)和PSI(Domain found in Plexins,Semaphorins and Integrins)結(jié)構(gòu)域,除JX02和GCRV-876以外,其他6株都具有UBX(Domain present in ubiquitin-regulatory proteins)結(jié)構(gòu)域,同時(shí)GCRV-096、GCRV-991、GCRV-876和GCRV-873具有DWB(Domain B in dwarfin family proteins)結(jié)構(gòu)域,JX01、GCRV-096、GZ1208和GCRV-873具有FU(Furinlike repeats)結(jié)構(gòu)域。

圖1 GCRV-I VP7不同株的氨基酸序列比對(duì)Fig. 1 Multiple alignment of VP7 amino acid sequences from GCRV-I strains

2.2 VP7的誘導(dǎo)表達(dá)及其純化

含重組質(zhì)粒的BL21和DE3大腸桿菌,經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)。離心收集誘導(dǎo)后的菌液,經(jīng)超低溫高壓連續(xù)細(xì)胞破碎儀破碎菌體后,離心后棄上清,分析包涵體中VP7蛋白的表達(dá)情況,SDS-PAGE結(jié)果顯示,VP7蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可以在BL21和DE3大腸桿菌中高效表達(dá),重組蛋白VP7大小約為40 kD,主要以包涵體形式存在。使用AKTA分子層析柱進(jìn)行純化,根據(jù)出峰位置收集目的蛋白(圖2A),收集體積為68、69、70和71的VP7蛋白進(jìn)行SDSPAGE分析(圖2B)。結(jié)果顯示,獲得的VP7蛋白純度較高。

圖2 重組蛋白VP7的純化Fig. 2 Purification of recombinant VP7 protein

2.3 免疫小鼠的血清效價(jià)測(cè)定以及單克隆抗體亞型鑒定

當(dāng)免疫小鼠的血清效價(jià)高于10000時(shí),進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。第四次免疫后血清效價(jià)檢測(cè)結(jié)果(圖3),4只小鼠的抗體效價(jià)均較高,血清效價(jià)達(dá)到51200,選擇1號(hào)小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合和單抗制備。

圖3 第四次免疫小鼠血清效價(jià)測(cè)定Fig. 3 Detection of antibody serum titer of immunized mouse No. 4

將篩選出來(lái)的編號(hào)為3、8、9、11和12的陽(yáng)性細(xì)胞株進(jìn)行亞類(lèi)鑒定,得到5株IgG類(lèi)型陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株(表1)。其中3號(hào)、11號(hào)和12號(hào)的亞型為IgG1,8號(hào)和9號(hào)的亞型為IgG2a。

表1 單克隆細(xì)胞株亞型鑒定Tab. 1 Determination of monoclonal antibody subtypes

2.4 單克隆抗體純度及親和常數(shù)測(cè)定

挑選3號(hào)和12號(hào)的單克隆細(xì)胞株(命名為GCRV3-VP7和GCRV12-VP7)進(jìn)行大規(guī)模抗體制備和純化。用ELISA檢測(cè)兩株抗體的親和常數(shù),按照親和常數(shù)≈150000×A/抗體濃度(150000為單個(gè)IgG抗體平均分子量值,抗體濃度單位為mg/mL)來(lái)計(jì)算,A代表平臺(tái)上的1/2 OD值所對(duì)應(yīng)的抗體稀釋倍數(shù),結(jié)果圖4顯示,GCRV3-VP7的親和常數(shù)為4.04×109,GCRV12-VP7的親和常數(shù)為2.74×109。

圖4 ELISA檢測(cè)抗體的親和常數(shù)Fig. 4 The affinity parameters of antibodies detected by ELISA A. GCRV3-VP7;B. GCRV12-VP7

2.5 單克隆抗體Western Blot檢測(cè)

用GCRV3-VP7和GCRV12-VP7單克隆抗體進(jìn)行Western Blotting分析分析GCRV-873感染的CIK細(xì)胞和未感染的CIK細(xì)胞(對(duì)照組)。感染24h后提取蛋白進(jìn)行Western Blotting實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,感染GCRV-873病毒的細(xì)胞樣品在35 kD大小附近有一條清晰單一的條帶,未感染病毒的細(xì)胞樣品未出現(xiàn)條帶(圖5)。綜上,本研究制備的VP7單克隆抗體可以識(shí)別GCRV-873病毒的VP7且具有很強(qiáng)的特異性。

圖5 抗體的Western Blotting鑒定Fig. 5 Characterization of VP7 antibodies by Western Blotting

2.6 直接免疫熒光檢測(cè)

用GCRV-873感染CIK細(xì)胞,利用直接免疫熒光試驗(yàn)分析病毒感染情況。CIK細(xì)胞在GCRV-873病毒感染后出現(xiàn)明顯的致細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE),細(xì)胞稀疏且大量脫落懸浮在細(xì)胞培養(yǎng)基中,未感染病毒細(xì)胞生長(zhǎng)正常。經(jīng)固定、透化、封閉和 孵育FITC標(biāo)記的VP7單克隆抗體和DAPI染色后,在倒置在熒光顯微鏡下觀察。病毒感染組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的綠色熒光信號(hào)(FITC標(biāo)記的GCRV3-VP7單抗);而未感染組的細(xì)胞未出現(xiàn)熒光信號(hào)(圖6)。以上結(jié)果表明,本研究制備的VP7單克隆抗體可應(yīng)用于直接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)GCRV-873病毒在細(xì)胞中的感染情況。

圖6 VP7單克隆抗體特異性免疫熒光分析Fig. 6 Immunofluorescence analysis of GCRV-873 infection with VP7 monoclonal antibody

3 討論

草魚(yú)出血病是危害草魚(yú)的頭號(hào)病毒性傳染病,傳染性廣、致死率高。1978年,研究人員首次證實(shí)該病的病原是一種病毒[24]。1983年,草魚(yú)出血病病毒 (Grass Carp Haemorrhage Virus,GCHV)被鑒定為呼腸孤病毒科(Reoviridae)成員[25]。草魚(yú)出血病主要危害草魚(yú)和青魚(yú)苗種,由于其發(fā)病季節(jié)長(zhǎng),流行范圍廣,致死率可高達(dá)85%以上,嚴(yán)重制約草魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[26]。因此,亟須發(fā)展該病的防控措施。

生物信息學(xué)分析顯示,GCRV-I不同株的VP7蛋白序列具有高度保守的結(jié)構(gòu)域,同源性高,以VP7為免疫原制備的單克隆抗體檢測(cè)GCRV-I具有廣譜性。另外,VP7蛋白作為GCRV-I特有的衣殼蛋白,其單克隆抗體特異性好,不與Ⅱ型GCRV發(fā)生交叉反應(yīng)。目前,GCRV的檢測(cè)多采用分子生物學(xué)方法和電鏡觀察,主要包括電鏡觀察法、各種PCR法[27,28]、細(xì)胞分離法和逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法[29,30]。盡管這些檢測(cè)方法高度敏感,但其廣泛應(yīng)用存在應(yīng)用局限性,包括成本太過(guò)高昂、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜、需要訓(xùn)練有素的實(shí)驗(yàn)操作人員、依賴貴重儀器等。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)作為一種基于抗體-抗原反應(yīng)的免疫學(xué)方法,可以提高疾病確認(rèn)過(guò)程的可靠性。它的主要優(yōu)點(diǎn)是能夠在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行高通量樣本檢測(cè),檢測(cè)的敏感性和特異性取決于所用抗體的質(zhì)量。相比于多克隆抗體,單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)是純度高,靈敏度高,特異性強(qiáng),交叉反應(yīng)少,制備成本低。郝貴杰等[31]制備的GCRVI VP7蛋白多克隆抗體特異性和效價(jià)有待提高,而我們的單克隆抗體在ELISA檢測(cè)中擁有更高的親和力,當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到1∶204800時(shí)仍可檢測(cè)到抗原蛋白。因此,本研究制備的VP7單克隆抗體可應(yīng)用于GCRV-I的ELISA診斷和檢測(cè),可用于研發(fā)GCRV-I快速檢測(cè)試劑盒。

為深入探究GCRV-I病毒的感染機(jī)制,本研究在大腸桿菌中表達(dá)了VP7蛋白,VP7蛋白主要以包涵體形式存在,以純化的VP7蛋白免疫BALB/c小鼠獲得了單克隆抗體。通過(guò)直接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)該單抗可用于檢測(cè)GCRV-I在細(xì)胞水平的感染,Western Blot檢測(cè)到的蛋白條帶大小約為35 kD。VP7蛋白由276個(gè)氨基酸組成,分子量的理論值約為29.81 kD,推測(cè)GCRV-I VP7的翻譯后修飾可能是導(dǎo)致分子量偏大的原因,但其具體機(jī)制尚不明確。因此,以vp7基因?yàn)橥黄瓶陂_(kāi)展GCRV-I病毒感染機(jī)制驗(yàn)證具有重要理論和應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)VP7單克隆抗體可應(yīng)用于開(kāi)發(fā)快速反應(yīng)試劑盒,更加方便養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)病魚(yú)樣本的快捷檢測(cè)。本研究制備的VP7單克隆抗體及其相關(guān)GCRV-I免疫學(xué)診斷方法為GCRV-I病毒感染機(jī)制和防控技術(shù)的開(kāi)發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。