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家貓卵母細(xì)胞與胚胎的冷凍保存及胚胎移植研究進(jìn)展

2022-09-14 02:36羅渝雯李俊顓清芮孟琳杜幸柱周丹王龍飛劉鴻宇侯云鵬傅祥偉
中國畜牧雜志 2022年9期
關(guān)鍵詞:家貓存活率胚胎

羅渝雯,李俊,顓清芮,孟琳,杜幸柱,周丹,王龍飛,劉鴻宇,侯云鵬,傅祥偉,4*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 100193;2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院生殖中心,河北石家莊 050031;3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院,北京 100193;4.省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832003)

2016 年,野生貓科動(dòng)物被列入世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄(IUCN)。家貓是與野生貓科動(dòng)物親緣關(guān)系最近且最容易獲得的生物模型,已有研究證明多種家貓輔助生殖技術(shù)(ART)方案可以應(yīng)用于野生貓科動(dòng)物。同時(shí),作為人類的伴侶動(dòng)物,家貓的輔助生殖技術(shù)也獲得了極大的社會(huì)關(guān)注度。

慢速冷凍和玻璃化冷凍是動(dòng)物配子、胚胎冷凍保存的2 種基本方法。Whittingham 等于1972 年首次將小鼠胚胎成功進(jìn)行低溫保存,又于1977 年成功冷凍小鼠成熟卵母細(xì)胞。隨后,低溫保存技術(shù)不斷在兔、牛、人等物種上成功應(yīng)用。慢速冷凍過程中會(huì)遇到設(shè)備操作復(fù)雜、耗時(shí)長等諸多問題,特別是在慢速冷凍過程中,細(xì)胞內(nèi)會(huì)不可避免地產(chǎn)生冰晶,損害細(xì)胞結(jié)構(gòu),嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)斐杉?xì)胞死亡。為改善冷凍保存的效果,Rall 等在1985 年發(fā)明了玻璃化冷凍法。玻璃化冷凍利用高濃度的冷凍保護(hù)劑(CPA)處理細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)快速降溫從而使細(xì)胞呈現(xiàn)玻璃化狀態(tài)。由于超快速降溫和高濃度CPA 能抑制冷凍過程中冰晶的形成,因此玻璃化冷凍相對于慢速冷凍可以有效減少冷凍損傷。在過去的十年中,玻璃化冷凍已經(jīng)逐步取代了慢速冷凍,成為冷凍保存卵母細(xì)胞的首選技術(shù)。但是玻璃化冷凍過程中高濃度的CPA 可能會(huì)引起蛋白質(zhì)變性和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變,繼而影響胚胎的發(fā)育能力,因此現(xiàn)階段的研究主要集中在降低CPA 的毒性以及縮短卵母細(xì)胞/ 胚胎暴露在CPA 中的時(shí)間。本文概述了國內(nèi)外家貓配子與胚胎的冷凍保存以及胚胎移植的研究進(jìn)展,以期為后續(xù)的研究提供參考。

1 家貓卵母細(xì)胞的冷凍保存

家貓卵母細(xì)胞冷凍耐受性較差,高脂質(zhì)含量是造成冷凍損傷的重要原因。在正常生理?xiàng)l件下,脂肪物質(zhì)為卵母細(xì)胞和胚胎提供了發(fā)育所必須的能量與物質(zhì)基礎(chǔ)。因此,脂質(zhì)含量也是影響卵母細(xì)胞質(zhì)量和抗凍性的重要參數(shù)。卵母細(xì)胞脂質(zhì)在冷凍中發(fā)生的物理變化是造成冷凍損傷的主要原因,高脂肪含量的卵母細(xì)胞和著床前胚胎的冷凍保存是目前冷凍保存技術(shù)中亟待克服的一大難點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍前,使胞內(nèi)脂質(zhì)極化可顯著提高家貓卵母細(xì)胞解凍存活率及囊胚發(fā)育率。

冷凍-解凍造成的線粒體功能障礙使卵母細(xì)胞發(fā)育能力下降。Sowińska 等研究發(fā)現(xiàn)冷凍-解凍后,貓卵母細(xì)胞線粒體分布異常,表現(xiàn)出線粒體的周邊型分布——線粒體在體外成熟后并不分散在整個(gè)細(xì)胞內(nèi),而是靠近卵母細(xì)胞膜分布。這種冷凍后線粒體聚集的狀態(tài),可能也是貓玻璃化冷凍卵母細(xì)胞發(fā)育能力下降的原因。研究發(fā)現(xiàn)ROCK1 抑制劑可能通過改善線粒體及細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng),促進(jìn)貓玻璃化冷凍卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟,提高受精率。

盡管家貓卵母細(xì)胞冷凍保存面臨著上述問題,但解凍后部分存活卵母細(xì)胞受精仍能發(fā)育至囊胚,胚胎移植后有成活后代。目前,未成熟卵母細(xì)胞及成熟卵母細(xì)胞均已應(yīng)用于家貓的冷凍保存,現(xiàn)就其冷凍損傷機(jī)理及冷凍方法概述如下。

1.1 未成熟卵母細(xì)胞冷凍保存

1.1.1 未成熟卵母細(xì)胞冷凍損傷機(jī)理 未成熟卵母細(xì)胞指處于生發(fā)泡期(GV 期)的卵母細(xì)胞。相對于成熟卵母細(xì)胞(MII 期),這一階段不存在紡錘體,對滲透壓有較強(qiáng)的耐受性。因此有學(xué)者認(rèn)為GV 期卵母細(xì)胞對冷凍損傷更具抵抗力,可為輔助生殖技術(shù)和實(shí)驗(yàn)研究擴(kuò)展卵母細(xì)胞來源。GV 期卵母細(xì)胞包含一個(gè)大型生發(fā)泡,由于其中染色質(zhì)濃縮等因素,冷凍后會(huì)造成細(xì)胞損傷及影響表觀遺傳,這已成為制約其應(yīng)用潛力的關(guān)鍵瓶頸。除此以外,對GV 期的卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存時(shí)也可能會(huì)損傷細(xì)胞膜或卵丘細(xì)胞,這些細(xì)胞與結(jié)構(gòu)直接影響卵母細(xì)胞的成熟過程。GV 期卵母細(xì)胞周圍存在的卵丘顆粒細(xì)胞可能會(huì)改變脫水的速度和程度,進(jìn)而可能加劇細(xì)胞質(zhì)損傷的程度。在對其他物種(牛、羊)進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn),卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)在玻璃化冷凍后體外成熟(IVM)培養(yǎng) 24 h,卵母細(xì)胞的核成熟率顯著降低,細(xì)胞骨架損傷可能是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因。同樣,研究發(fā)現(xiàn)在家貓COCs 進(jìn)行玻璃化冷凍前,去除卵丘細(xì)胞并在細(xì)胞骨架穩(wěn)定劑中預(yù)培養(yǎng),可以提高貓GV 期卵母細(xì)胞的核成熟率。

1.1.2 未成熟卵母細(xì)胞冷凍方法 與大多數(shù)家畜相同,最初用于家貓GV 期卵母細(xì)胞冷凍的是慢速冷凍法,但解凍后進(jìn)行體外受精(IVF)未獲得囊胚。之后,Cocchia 等第一次用開放式拉長細(xì)管(OPS)對貓GV 期卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍,并在IVF 后首次獲得囊胚;但是,玻璃化冷凍卵母細(xì)胞獲得的胚胎,其卵裂率和囊胚率均顯著低于新鮮卵母細(xì)胞(卵裂率:18.6%vs.48.2%,囊胚率:18% vs.33.3%)。相比Cocchia等的方法,Tharasanit 等用OPS 通過四步法進(jìn)行玻璃化冷凍可提高卵裂率和囊胚率,同時(shí)四步法相比兩步法也可提高成熟率(37.6% vs.20%)。Snoeck 等發(fā)現(xiàn)在使用OPS 法冷凍未成熟卵母細(xì)胞時(shí)加入連接蛋白靶向多肽(GPA26)抑制連接蛋白37(Cx37)和連接蛋白43(Cx43)通道能提高孤雌激活(PA)胚胎的后續(xù)發(fā)育能力。此外,Colombo 等用冷凍條(Cryotop)保存貓GV 期卵母細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)冷凍可能會(huì)引起DNA 損傷和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)激活,用泛caspase 抑制劑降低caspase 酶活性后,可將冷凍后卵母細(xì)胞的成熟率提高至接近于新鮮卵母細(xì)胞,且不影響胚胎后續(xù)發(fā)育。實(shí)際應(yīng)用中,大部分野生貓科動(dòng)物的卵巢是在野外死亡的動(dòng)物身上獲得的,無法及時(shí)將卵巢運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。有研究為了驗(yàn)證低溫保存運(yùn)輸對卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響,分別從低溫保存運(yùn)輸了24 h 的卵巢組織及新鮮卵巢組織中獲取GV 期卵母細(xì)胞,用Cryotop 冷凍、解凍后繼續(xù)培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)兩組卵母細(xì)胞成熟率相同(41%),且卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程沒有差異。這些數(shù)據(jù)表明低溫保存卵巢、延遲玻璃化冷凍并沒有破壞減數(shù)分裂恢復(fù)機(jī)制。受精后,卵巢冷藏后獲得的卵母細(xì)胞卵裂率顯著降低,但后續(xù)胚胎發(fā)育未見差異,證實(shí)卵巢冷藏保存24 h 是有效保存貓卵母細(xì)胞并維持較高存活率的方法。

1.2 成熟卵母細(xì)胞冷凍保存

1.2.1 成熟卵母細(xì)胞在冷凍保存中的應(yīng)用及冷凍損傷在貓科動(dòng)物中,由于倫理問題以及個(gè)體的特殊性,通常只在稀有個(gè)體意外死亡后才能獲取配子,因此超低溫保存策略主要集中在未成熟卵母細(xì)胞上,對MII 期卵母細(xì)胞的研究相對較少。相比于冷凍GV 期卵母細(xì)胞,在MII 期進(jìn)行冷凍保存的優(yōu)點(diǎn)是:卵母細(xì)胞在暴露于低溫之前已經(jīng)完成核成熟,這是卵母細(xì)胞受精前發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但是對MII 期卵母細(xì)胞進(jìn)行超低溫保存會(huì)引起染色體排列異常、基因表達(dá)異常以及活性氧增加、DNA 碎片化比例升高等現(xiàn)象。也有研究認(rèn)為玻璃化冷凍前的減數(shù)分裂狀態(tài)(未成熟與體外成熟)并不影響受精率和桑葚胚率,但尚需更多研究證實(shí)。

1.2.2 成熟卵母細(xì)胞冷凍方法 Luvoni 等最早用慢速冷凍法分別冷凍了成熟卵母細(xì)胞和未成熟卵母細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)成熟卵母細(xì)胞冷凍后的發(fā)育能力更好。2004 年,Murakami 等第1 次對貓MII 期卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍,將體外成熟的貓MII 卵母細(xì)胞用細(xì)管(Straw)進(jìn)行玻璃化冷凍,解凍后存活率可達(dá)48.7%,進(jìn)行IVF后首次獲得囊胚(囊胚率3.7%)。Merlo 等進(jìn)一步改善玻璃化冷凍保存方法,首次使用了冷凍環(huán)(Cryoloop)法冷凍成熟卵母細(xì)胞。Cryoloop 法能使胚胎與液氮直接接觸,且所用冷凍液體積小于1 μL,因而在冷卻過程中具有降溫速度快和降溫統(tǒng)一均衡的優(yōu)點(diǎn),相比于Straw 法獲得了更高的囊胚率(11.8%),并首次獲得了孵化囊胚。最近有報(bào)道稱,運(yùn)用Gandhi 等人發(fā)明的冷凍器(Cryoteach)法對貓?bào)w外成熟的MII 期卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍,解凍后具有較高的存活率和發(fā)育能力(冷凍存活率>60%,PA 后卵裂率達(dá)22%),但未獲得囊胚。冷凍過程中,可以通過改進(jìn)冷凍載體提高冷凍-解凍速度,縮短與CPA 的接觸時(shí)間,從而降低CPA 造成的化學(xué)毒性損傷,提高冷凍存活率。此外,也有研究通過調(diào)整CPA 的成分來減少對細(xì)胞的毒性損傷,進(jìn)而提高冷凍保存后的發(fā)育能力,例如在冷凍液中添加非滲透性CPA——聚蔗糖 PM-70(Ficoll PM-70)能顯著提高貓MII 期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后的存活率。由于貓卵母細(xì)胞內(nèi)含有大量的脂質(zhì)會(huì)降低其抗凍性,有研究發(fā)現(xiàn)去除MII 期脂質(zhì)可提高冷凍后的存活率和受精后的體外發(fā)育能力。

2 貓胚胎的冷凍保存

相比于配子的冷凍保存,胚胎冷凍保存可以保存父母雙方的全部遺傳物質(zhì),是輔助生殖技術(shù)的重要組成部分。在胚胎冷凍保存過程中,雖然有些細(xì)胞受損或死亡,但剩余的存活細(xì)胞足以維持胚胎的正常發(fā)育。到目前為止,大約有40 個(gè)物種(包括人類和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)的胚胎冷凍保存獲得了成功。自1988 年Dresser 等用慢速冷凍首次成功保存了家貓?bào)w內(nèi)發(fā)育的桑葚胚和囊胚以來,胚胎冷凍技術(shù)應(yīng)用日漸成熟,家貓作為最受歡迎的伴侶動(dòng)物之一,對家貓胚胎進(jìn)行冷凍保存的需求也與日俱增。由于不同階段胚胎體積、組成、相變溫度、相關(guān)結(jié)構(gòu)等各不相同,胚胎在冷凍保存過程中的冷凍耐受性也不同。針對各個(gè)階段的特性,將早期胚胎以囊胚為分界線,分別簡要闡述。

2.1 早期胚胎的冷凍保存

2.1.1 冷凍保存方法 冷凍保存后能否恢復(fù)卵裂是早期胚胎冷凍保存成功與否的主要決定因素。不同冷凍保存方法的結(jié)果各有優(yōu)劣,但對于大多數(shù)富含脂質(zhì)的哺乳動(dòng)物胚胎來說,玻璃化冷凍比慢速冷凍效果更好。Pope 等同時(shí)使用慢速冷凍法和Cryotop 法冷凍了2-細(xì)胞胚胎,解凍后存活率分別為22% 和6%,兩組冷凍胚的囊胚發(fā)育相似(22~26%),移植給受體后均產(chǎn)下后代,但囊胚發(fā)育率均低于新鮮胚(50%)。因此,普遍認(rèn)為玻璃化冷凍和慢速冷凍后的家貓2-細(xì)胞胚胎體外發(fā)育潛力相似。2020 年的一項(xiàng)研究分別用慢速冷凍法和玻璃化冷凍法冷凍4~8 細(xì)胞期胚胎,2 組存活率(78.2% vs.85.2%)和囊胚率(20% vs.28.6%)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,與之前的研究結(jié)果一致。

表1 家貓卵母細(xì)胞不同階段冷凍保存

2.1.2 不同發(fā)育階段的早期胚胎冷凍耐受性差異 除冷凍保存方法外,胚胎發(fā)育階段的選擇也被認(rèn)為是影響冷凍-解凍胚胎存活的關(guān)鍵因素。Ochota 等利用Cryotop 法冷凍了不同階段的早期胚胎(2 細(xì)胞、4~8細(xì)胞、>8 細(xì)胞以及桑葚胚),發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育階段的貓?jiān)缙谂咛ゲAЩ鋬龊蟮拇婊盥蕸]有差異(76.9%、73.3%、93.3%、72.7%),但在解凍后的發(fā)育過程中,僅4~8 細(xì)胞和>8 細(xì)胞的胚胎能發(fā)育到囊胚(13.3%、26.7%)。

2.2 囊胚冷凍保存 囊胚是多細(xì)胞結(jié)構(gòu),體積較大、內(nèi)含大量的囊胚腔液,相對于其他階段的胚胎,冷凍保存難度更大。Tsujioka 等以家貓IVF 胚胎作為研究對象,采用Cryotop 對6 d(n=42)或7 d(n=27)囊胚進(jìn)行玻璃化冷凍保存,首次獲得了玻璃化冷凍后存活的囊胚(73.8%、66.7%),并發(fā)現(xiàn)較早達(dá)到囊胚(6 d囊胚)階段的體外受精胚胎存活率更高。此外,慢速冷凍法亦用于貓囊胚和擴(kuò)張囊胚的冷凍保存,報(bào)道指出解凍后囊胚的存活率低于擴(kuò)張囊胚(30% vs.34%)。為了提高囊胚冷凍-解凍后存活率,Ochota 等用人工皺縮法減少了擴(kuò)張囊胚腔液,可使存活率顯著提高(64.3% vs.38.5%)。除改造囊胚本身的生物學(xué)特性外,后續(xù)研究還不斷嘗試新的冷凍方法以及調(diào)整CPA 組成。最近有研究發(fā)現(xiàn)采用Cryotop 多步法進(jìn)行玻璃化冷凍,能顯著提高存活率(100%)。

3 貓的胚胎移植

1979 年,Kraemer 等報(bào)道了第一例成功的貓胚胎移植(ET)。1988 年Goodrowe 等首次將IVF 胚胎移植給受體母貓后產(chǎn)下小貓。目前,家貓的胚胎移植在多個(gè)實(shí)驗(yàn)室獲得了成功,研究發(fā)現(xiàn)家貓?jiān)缙谀遗咔叭我浑A段的胚胎均能進(jìn)行胚胎移植,不同方式獲得的胚胎,如體內(nèi)或體外成熟的卵母細(xì)胞IVF、卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)、體細(xì)胞核移植(SCNT)以及冷凍保存胚胎等經(jīng)移植均能正常產(chǎn)仔。根據(jù)移植部位不同可分為子宮移植及輸卵管移植。

3.1 子宮移植 由于家貓的胚胎能在子宮中遷移,可在兩側(cè)子宮角中均勻分配,因此家貓的胚胎移植只需進(jìn)行單側(cè)移植。將IVF、ICSI、SCNT 和冷凍的胚胎移植到受體子宮角后均有后代出生,但胚胎存活率不高。然而,大多數(shù)早期的胚胎移植需要剖腹手術(shù)才能進(jìn)入子宮,對受體傷害較大。Veraguas 等用eCG 誘導(dǎo)家貓排卵,進(jìn)行IVF 后將胚胎移植,移植了9 枚5 d(桑葚胚或早期囊胚)胚胎,20 d 后檢測到2 個(gè)孕囊,但最終只產(chǎn)下一只小貓;后移植15 枚7 d(9 個(gè)囊胚,6個(gè)孵化囊胚)胚胎后產(chǎn)下一只小貓。在體外培養(yǎng)過程中,會(huì)有一部分胚胎在D8 孵化,失去透明帶,但是體內(nèi)胚胎在D13 早期附植前均能觀察到透明帶,綜合部分桑葚胚和/或囊胚移植結(jié)果,可以推測完整的透明帶在貓胚胎的成功著床和隨后發(fā)育中起著重要作用,但需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2 輸卵管移植 貓胚胎體外生產(chǎn)效率與其他物種相似,但移植到受體體內(nèi)后,胚胎體內(nèi)發(fā)育潛力嚴(yán)重降低,包括妊娠率低于正常水平、胚胎移植后存活率低且窩產(chǎn)仔數(shù)較少等。研究發(fā)現(xiàn)借助腹腔鏡技術(shù)將早期卵裂(2~4 個(gè)細(xì)胞)胚胎直接移植到輸卵管中,縮短體外培養(yǎng)時(shí)間(限制在24~30 h),減少體外環(huán)境的負(fù)面影響,可克服貓科動(dòng)物胚胎移植后發(fā)育潛力減弱等一系列問題。腹腔鏡輸卵管移植可用于各種來源的胚胎移植。在人工繁育過程中,為了獲得期望的后代,常使用性控凍精。Pope 等使用X-性控凍精與體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞實(shí)施IVF,將2 d 胚胎(9~16 枚/只)通過腹腔鏡移植到同期發(fā)情的受體母貓輸卵管中,出生率可達(dá)到70%(7/10)。2012 年,Pope 等采用ICSI 技術(shù)將來源于體外成熟卵母細(xì)胞的早期胚胎用腹腔鏡移植到兩只受體輸卵管中,獲得4 只小貓。同年,Pope 也分別將冷凍(慢速冷凍和玻璃化冷凍)后的胚胎用腹腔鏡移植到貓的輸卵管中,都產(chǎn)下了小貓。

4 總結(jié)

配子和胚胎的冷凍保存結(jié)合胚胎移植技術(shù)是維持哺乳動(dòng)物物種遺傳多樣性的有效方法,對于種質(zhì)資源的保存、瀕危物種保護(hù)等具有重大意義。在過去的幾十年里,家貓輔助生殖技術(shù)取得了巨大進(jìn)步,特別是在配子和胚胎的冷凍保存和胚胎移植方面。盡管取得了較大進(jìn)展,但還沒有公認(rèn)的最優(yōu)方案應(yīng)用到實(shí)踐中,大多數(shù)方法依然是處于實(shí)驗(yàn)階段,無法大規(guī)模投入使用。最重要的是,目前對冷凍機(jī)理的研究還不夠透徹,不同冷凍保存過程中使用的方法各不相同,且冷凍保存方法過于局限,沒有足夠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來支撐結(jié)論,未來還需要進(jìn)一步的研究以簡化、優(yōu)化冷凍保存方法,為珍稀貓科動(dòng)物配子與胚胎的有效保存奠定基礎(chǔ)。

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