李鑫芳 鄭偉 葉昂直

原發(fā)性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，主要發(fā)生于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞［1］。尋找能夠有效抑制肝癌細(xì)胞增殖的小分子物質(zhì)可為肝癌的治療提供新的治療藥物，同時(shí)有望改善肝癌患者的預(yù)后。近年來，中藥單體及衍生物已被證明在多種癌癥模型中發(fā)揮抗癌作用［2-3］。漢黃芩苷為黃芩中特有成分，其在癌癥治療中的作用逐漸為人所熟知。CHEN等［4］研究結(jié)果顯示，漢黃芩苷通過ERhippo信號軸抑制子宮內(nèi)膜癌的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。YAO等［5］研究顯示，漢黃芩苷通過抑制TRAF2/4的表達(dá)抑制乳腺癌的侵襲和遷移。本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)闡明漢黃芩苷在肝癌治療中的作用及其分子調(diào)控機(jī)制，研究漢黃芩苷對肝癌的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 （1）細(xì)胞株：人肝癌細(xì)胞HepG2由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心提供。（2）試劑與儀器：漢黃芩苷購于上海源葉生物科技有限公司；AKT特異性激動劑SC79購于MCE公司；兔抗小鼠Bcl-2、Bax單克隆抗體購于Abcam公司；兔抗小鼠GAPDH、Caspase-3、Akt、p-Akt單克隆抗體與山羊抗兔IgG二抗購于CST公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購于Gibco公司；BCA蛋白檢測試劑盒購于碧云天公司；凝膠成像分析系統(tǒng)、電泳槽購于Bio-Rad公司；CO2培養(yǎng)箱購于Salvis Lab公司；MultiskanTM FC型酶標(biāo)儀購于Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基處理并培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。（2）細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：用胰酶消化肝癌細(xì)胞HepG2，離心后將細(xì)胞重懸，制備肝癌細(xì)胞HepG2懸液并計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量將肝癌細(xì)胞HepG2稀釋至合適的鋪板細(xì)胞數(shù)后接種到96孔板內(nèi)，待肝癌細(xì)胞HepG2貼壁后給予不同濃度的漢黃芩苷處理，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。最后，向每個(gè)孔內(nèi)加入10 μL CCK-8試劑，測定450 nm處的吸光度并統(tǒng)計(jì)分析。（3）Western blot實(shí)驗(yàn)：通過蛋白裂解液對肝癌細(xì)胞進(jìn)行裂解，冰上靜置30 min后放入離心機(jī)中以12,000 r/min離心30 min，收集上清液并檢測總蛋白濃度，用10%分離膠分離蛋白樣本，在300 mA電流條件下轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，放入GAPDH（1∶5,000）、AKT（1∶1,000）、p-AKT（1∶1,000）、Caspase-3（1∶1,000）、Bax（1∶1,000）和Bcl-2（1∶1,000）一抗稀釋液中孵育過夜。第二天，用TBS-Tween洗滌3次后，二抗稀釋液孵育2 h并再次洗滌3次，曝光各蛋白條帶并用Image Lab軟件分析條帶灰度值。Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白以GAPDH蛋白條帶作內(nèi)參照；p-AKT蛋白分別以AKT蛋白條帶作參照。（4）流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)：給予肝癌細(xì)胞HepG2漢黃芩苷和AKT激動劑處理后，用10 mL的離心管收集肝癌細(xì)胞，將細(xì)胞濃度控制在3×106/mL，以1,000 r/min速度離心5 min，棄去上清液，用孵育緩沖液洗滌1次，再次離心。用100 μL標(biāo)記溶液重懸肝癌細(xì)胞，在室溫避光環(huán)境下孵育15 min，再次離心和洗滌肝癌細(xì)胞1次，向肝癌細(xì)胞內(nèi)加入熒光溶液并孵育于4 ℃環(huán)境中20 min。最后，調(diào)節(jié)系統(tǒng)參數(shù)通過流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行相應(yīng)的檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 漢黃芩苷劑量依賴性抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖能力 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，給予漢黃芩苷處理可抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同劑量漢黃芩苷處理對肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞增殖能力比較

2.2 漢黃芩苷激活肝癌細(xì)胞HepG2凋亡反應(yīng) Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，給予漢黃芩苷處理可顯著上調(diào)肝癌細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Casepase-3和Bax的表達(dá)水平，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與此同時(shí)，給予AKT特異性激動劑SC79處理后肝癌細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和Bax的表達(dá)水平與漢黃芩苷治療組相比顯著降低，而抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 漢黃芩苷對肝癌細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較

2.3 漢黃芩苷促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡程度 流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，給予漢黃芩苷處理可顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡程度,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與此同時(shí)，給予AKT特異性激動劑SC79處理后，漢黃芩苷對肝癌細(xì)胞凋亡程度的促進(jìn)作用與漢黃芩苷治療組相比受到顯著抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 漢黃芩苷對肝癌細(xì)胞HepG2凋亡水平比較

2.4 漢黃芩苷通過調(diào)控AKT信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，給予漢黃芩苷處理可顯著抑制肝癌細(xì)胞內(nèi)AKT蛋白磷酸化水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與此同時(shí)，給予AKT特異性激動劑SC79處理后，肝癌細(xì)胞內(nèi)AKT蛋白磷酸化水平與漢黃芩苷治療組相比顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 漢黃芩苷對肝癌細(xì)胞內(nèi)AKT蛋白磷酸化水平比較

3 討論

隨著我國肝病人數(shù)的增加，PHC的發(fā)病人數(shù)逐年增加，PHC已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅我國人民健康的消化道惡性腫瘤之一。PHC主要有三種不同的病理類型，包括肝細(xì)胞肝癌（hepatic cell carcinoma，HCC）、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和HCCICC混合型。HCC的發(fā)病率最高，占總數(shù)的85%～90%。該病起病隱匿，早期無明顯不適，一旦出現(xiàn)典型的臨床癥狀和體征顯示已進(jìn)入疾病的中晚期，因此肝癌患者的5年生存率較低。隨著分子靶向藥物研發(fā)速度的加快，患者的5年生存率取得了大幅的提升，但由于腫瘤靶向藥物的適用人群較為狹隘且治療費(fèi)用普遍較為昂貴，因此絕大部分肝癌患者的生存率仍較低［6］。尋找更多能夠有效抑制癌癥細(xì)胞增殖且價(jià)格低廉的抗癌藥物可進(jìn)一步改善肝癌患者的遠(yuǎn)期療效。本課題組主要研究漢黃芩苷在抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖、促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡過程中的作用以期為漢黃芩苷治療肝癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

漢黃芩苷對癌癥細(xì)胞生長的抑制作用已在多項(xiàng)基礎(chǔ)研究中被證實(shí)，且抑制癌癥細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞死亡是其發(fā)揮抗癌作用的主要方式。LUO等［7］研究結(jié)果顯示，漢黃芩苷可通過促進(jìn)線粒體功能障礙誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡。WANG 等［8］研究結(jié)果顯示，漢黃芩苷通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞周期阻滯和線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。GU等［9］研究結(jié)果顯示，漢黃芩苷通過調(diào)控IRE1α通路促進(jìn)人胃癌細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。本研究中，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，漢黃芩苷對肝癌細(xì)胞HepG2增殖能力具有顯著的抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，肝癌細(xì)胞HepG2的增殖能力受到更加顯著的抑制。細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞程序性死亡，通過促進(jìn)癌癥細(xì)胞凋亡可延緩癌癥的進(jìn)展，減少癌細(xì)胞對周圍組織的侵襲，從而達(dá)到治療癌癥的目的。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，漢黃芩苷可上調(diào)肝癌細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平，同時(shí)下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平。流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，漢黃芩苷可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。上述研究結(jié)果顯示，漢黃芩苷可通過抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮治療肝癌的作用。

為了進(jìn)一步明確漢黃芩苷促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的信號調(diào)控機(jī)制，給予漢黃芩苷治療的肝癌細(xì)胞AKT激動劑處理。有研究顯示，AKT通路參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程。FRANKE 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，AKT相關(guān)蛋白在細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用。HAN 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，漢黃芩苷通過PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信號通路抑制細(xì)胞生長，誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的人結(jié)腸癌細(xì)胞自噬相關(guān)凋亡。本研究中Western blot結(jié)果顯示，漢黃芩苷可有效抑制肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)AKT蛋白磷酸化水平。給予AKT激動劑處理上調(diào)肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)AKT蛋白磷酸化水平后漢黃芩苷對肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的促進(jìn)作用受到顯著的抑制。由此可見，AKT信號通路在漢黃芩苷促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

綜上所述，漢黃芩苷通過調(diào)控肝癌細(xì)胞HepG2 AKT信號通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖發(fā)揮其抗癌作用。