張豆豆，王 靜，劉 淼，盧大儒，劉素英*

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，上海 200032

2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200000

體外受精-胚胎移植（in vitro fertilizationembryo transfer，IVF-ET）是治療不孕癥的有效手段，而胚胎體外培養(yǎng)是IVF-ET 的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。胚胎培養(yǎng)箱模擬體內(nèi)環(huán)境，保持pH 值、溫度、氣體含量、滲透壓和濕度與體內(nèi)一致。盡管培養(yǎng)箱中覆蓋油的培養(yǎng)皿消除了pH 值和溫度的變化，但難以克服培養(yǎng)基滲透壓變化的影響。Yumoto 等［1］發(fā)現(xiàn)，干式培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)基滲透壓不穩(wěn)定；Boumerdassi等研究［2］發(fā)現(xiàn)，無(wú)論培養(yǎng)皿中礦物油含量如何，干式培養(yǎng)箱中微滴的滲透壓在培養(yǎng)3 d 后都明顯升高。此外，F(xiàn)awzy 等［3］的前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究表明，干式培養(yǎng)與濕式培養(yǎng)相比顯著降低了著床率及臨床妊娠率。

時(shí)差成像（time-lapse，TL）技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展的一種新型胚胎培養(yǎng)與胚胎實(shí)時(shí)觀察技術(shù)，其有效性和安全性備受關(guān)注［4-6］。與傳統(tǒng)培養(yǎng)時(shí)需頻繁拿取胚胎至箱外觀察不同，TL 能為胚胎提供更穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，不用開(kāi)箱即可動(dòng)態(tài)觀察受精及胚胎發(fā)育情況［5］。然而，應(yīng)用干式TL 培養(yǎng)箱培養(yǎng)時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，滲透壓也隨之發(fā)生變化［7］。TL 培養(yǎng)滲透壓變化對(duì)胚胎發(fā)育的影響須進(jìn)一步確定。因此，本研究以傳統(tǒng)濕式培養(yǎng)為對(duì)照，結(jié)合培養(yǎng)5 d 后微滴滲透壓變化，分析TL 培養(yǎng)箱中不同年齡女性胚胎發(fā)育的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性選擇 2020 年 7 月至 2021年 12 月在本院第 1 次行 IVF-ET 治療的 2 390 對(duì)夫妻，胚胎培養(yǎng)共2 390 個(gè)周期，其中TL 組640 對(duì)夫妻 640 個(gè)周期，對(duì)照組 1 750 對(duì)夫妻 1 750 個(gè)周期。兩組女方年齡、不孕類(lèi)型、不孕因素、女方體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、基礎(chǔ)卵泡刺激素（FSH）水平、基礎(chǔ)黃體生成素（LH）水平、促性腺激素（Gn）用量、受精方式和平均獲卵數(shù)等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 兩組患者臨床特征比較

1.2 胚胎培養(yǎng)方法及滲透壓的測(cè)量 兩組分別應(yīng)用ASTEC APM-50D 濕式三氣培養(yǎng)箱和ESCO Miri-TL 干式培養(yǎng)箱，采用一步法胚胎培養(yǎng)液（vitrolife GTL）培養(yǎng)。采卵前1 d 配液充分覆油并過(guò)夜平衡。滲透壓檢測(cè)：取過(guò)夜平衡后的培養(yǎng)液50 μL，等分后放入滲透壓計(jì)樣品管中，立即用德國(guó)GONOTEC 冰點(diǎn)滲透壓儀 OSMOMAT 030 進(jìn)行滲透壓測(cè)試，每份樣品重復(fù)測(cè)試3 次以確保測(cè)值準(zhǔn)確性。對(duì)于每組測(cè)試樣品，每次從培養(yǎng)箱中取出1 個(gè)培養(yǎng)皿來(lái)測(cè)量滲透壓，其他留在培養(yǎng)箱中。同一天要測(cè)量的培養(yǎng)皿放于培養(yǎng)箱同一腔室。測(cè)試前每天校準(zhǔn)滲透壓計(jì)，測(cè)試時(shí)間點(diǎn)保持一致。

1.3 胚胎獲取 所有研究對(duì)象均采用拮抗劑方案，于月經(jīng)后第2 天或第3 天，給予重組人促卵泡激素（rhFSH，G-F，默克）75～300 U/d 促排卵，根據(jù)患者年齡、竇卵泡數(shù)（AFC）、抗繆勒管激素（AMH）、BMI 確定啟動(dòng)劑量。當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑達(dá) 14 mm 或 LH＞10 U/L 時(shí)加用促性腺激素釋放激素拮抗劑GnRH-ant 至注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）日。扳機(jī)后36～38 h 取卵。根據(jù)患者情況，于獲卵后2～4 h 行常規(guī)體外受精（IVF）或卵胞漿內(nèi)單精子注射受精（ICSI）；授精后16～18 h 檢查受精情況，并繼續(xù)培養(yǎng)至第5 天或第6 天，根據(jù)臨床情況行新鮮胚胎移植或胚胎冷凍保存。

1.4 胚胎質(zhì)量評(píng)估 常規(guī)濕式培養(yǎng)第2 天或第3天評(píng)估卵裂期胚胎情況，第5 天或第6 天評(píng)估胚胎囊胚發(fā)育情況。受精后第3 天參考Brainden 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)卵裂期胚胎質(zhì)量進(jìn)行評(píng)分，正常受精7～9 個(gè)細(xì)胞、評(píng)分1～2 級(jí)的胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎；≥6 個(gè)細(xì)胞、評(píng)分3 級(jí)及以上的胚胎為有效胚胎［8］。受精后第5～6 天參考Gardner 等［9］的方法對(duì)囊胚質(zhì)量進(jìn)行評(píng)分，優(yōu)于3BB 定義為優(yōu)質(zhì)囊胚。TL 培養(yǎng)除卵裂期和囊胚期常規(guī)觀察外，每5 min 記錄1 次胚胎圖像，生成動(dòng)態(tài)胚胎發(fā)育視頻［5］。

比較兩組正常受精率、正常卵裂率、有效胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚率等。正常受精率＝正常受精數(shù)/獲卵數(shù)×100%；正常卵裂率＝正常卵裂數(shù)/總受精數(shù)×100%；有效胚胎率＝有效胚胎數(shù)/正常卵裂數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率＝優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常卵裂數(shù)×100%；囊胚形成率＝囊胚形成數(shù)/培養(yǎng)囊胚數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)囊胚率＝優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/培養(yǎng)囊胚數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以x±s 表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，組間比較采用檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 滲透壓測(cè)量結(jié)果 結(jié)果（圖1）顯示：兩組微滴滲透壓在培養(yǎng)期間均增加。培養(yǎng)第3 天，TL組微滴的滲透壓增加約14.6 mOsm/kg（5.4%），對(duì)照組增加約5.0 mOsm/kg（1.8%，P＝0.222）；培養(yǎng)第5 天，TL 組滲透壓3 次測(cè)量平均值約為 300 mOsm/kg，達(dá)最高值，增加 28.6 mOsm/kg（10.6%），對(duì)照組增加約12.0 mOsm/kg（4.4%，P＝0.052）。

圖1 兩組滲透壓變化

2.2 兩組女方不同年齡胚胎發(fā)育情況比較 結(jié)果（表2）顯示：20～29 歲：TL 組有效胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；30～34歲：TL 組優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率均高于對(duì)照組（P＜0.05）；35～39 歲：TL 組各指標(biāo)與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；≥40 歲：TL 組優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率均低于對(duì)照組（P＜0.05）。

表2 女方不同年齡組兩種培養(yǎng)箱胚胎發(fā)育比較

3 討 論

一步法培養(yǎng)基結(jié)合臺(tái)式TL 培養(yǎng)近年來(lái)已在輔助生殖領(lǐng)域得到較多應(yīng)用，其優(yōu)點(diǎn)為不需要開(kāi)箱即可動(dòng)態(tài)觀察胚胎發(fā)育，為胚胎選擇提供更多依據(jù)。但是，其培養(yǎng)效果目前存在爭(zhēng)議。2012 年，Kirkegaard 等［10］將 TL 培養(yǎng)和常規(guī)濕式培養(yǎng)效果進(jìn)行比較，以第2 天4 個(gè)細(xì)胞、第3 天7～8 個(gè)細(xì)胞、第5 天囊胚形成率和種植率為評(píng)估指標(biāo)，結(jié)果顯示兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Sciorio 等［11］發(fā)現(xiàn)TL 培養(yǎng)第2天和第3天的優(yōu)質(zhì)胚胎率高于常規(guī)培養(yǎng)方法，而第5 天或第6 天的優(yōu)質(zhì)囊胚率與常規(guī)培養(yǎng)方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2018 年 Barberet 等［12］的隨機(jī)對(duì)照研究顯示，TL培養(yǎng)第3 天優(yōu)質(zhì)胚胎率高于常規(guī)培養(yǎng)。

目前這2 種培養(yǎng)方式在不同女方年齡組的應(yīng)用效果鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，在女方低齡（20～34 歲）組，TL 組胚胎發(fā)育情況優(yōu)于常規(guī)培養(yǎng)；在高齡組（≥40 歲），TL 組優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚率則顯著降低；年齡34～39歲，兩組間胚胎發(fā)育情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，TL 組微滴滲透壓明顯增加，第5 天滲透壓接近培養(yǎng)基最高閾值，提示TL 培養(yǎng)箱中微滴水分隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸蒸發(fā)，因此滲透壓逐漸增加，雖然與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但仍有參考價(jià)值。文獻(xiàn)［13］表明，滲透壓增加至300 mOsm/kg 時(shí)，小鼠胚胎發(fā)育潛能急劇下降。雖然該滲透壓閾值在人類(lèi)尚未明確，但人與鼠生殖道生理特性相似，提示人類(lèi)與小鼠體外滲透壓要求可能相當(dāng)［14］。本研究中，滲透壓改變并沒(méi)有影響年輕女性胚胎的發(fā)育，可能與年輕女性卵子質(zhì)量佳，能對(duì)抗?jié)B透壓改變有關(guān)，但對(duì)于高齡（≥40 歲）患者，胚胎發(fā)育潛能本身較差，對(duì)環(huán)境特別是滲透壓的改變更為敏感，滲透壓的增加顯著抑制了胚胎的發(fā)育潛能,降低了囊胚形成率及優(yōu)質(zhì)囊胚率。

綜上所述，本研究顯示，干式TL 結(jié)合一步法培養(yǎng)基較傳統(tǒng)濕式培養(yǎng)在年輕女性體外胚胎培養(yǎng)中更有優(yōu)勢(shì)，但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，滲透壓逐漸升高，對(duì)高齡女性胚胎發(fā)育呈現(xiàn)不利影響，提示高齡女性胚胎培養(yǎng)可能更適用傳統(tǒng)濕式方法。如何充分利用TL 培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)，又能克服長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后滲透壓的改變可能須獲得輔助生殖領(lǐng)域更多的關(guān)注，開(kāi)發(fā)可加水的濕式TL 培養(yǎng)箱可能有幫助。此外，本研究為單中心回顧性研究，未來(lái)需要多中心更大樣本RCT 研究驗(yàn)證TL 培養(yǎng)對(duì)胚胎發(fā)育潛能的影響。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。