井俊麗，劉銘瀟，高美娜，徐繼忠，張學(xué)英，周莎莎

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，保定 071000）

蘋果在我國栽培歷史悠久,在促進(jìn)農(nóng)民增收和區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展等方面發(fā)揮著重要作用，蘋果產(chǎn)業(yè)在我國發(fā)展中占有重要地位［1］。然而，蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展卻受到低溫因素的限制。在我國北方地區(qū)，每年冬季都易發(fā)生凍害，抗寒性差的蘋果樹枝干受凍嚴(yán)重，出現(xiàn)抽條現(xiàn)象，甚至有些地區(qū)會(huì)使樹木凍死［2］。另外，春季也常發(fā)生凍害，以河北省為例，2020 年4 月，河北省多個(gè)縣市出現(xiàn)大風(fēng)降溫現(xiàn)象，此次降溫造成省內(nèi)多地區(qū)遭受低溫凍害，受災(zāi)面積較廣，有些品種的蘋果花器器官出現(xiàn)不同程度的凍害［3］。凍害嚴(yán)重影響了蘋果樹體質(zhì)量和產(chǎn)量，給果農(nóng)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。由此可見，提高蘋果抗寒性的工作至關(guān)重要。砧木直接影響接穗的抗寒性，正確選擇砧木，可以提高蘋果樹的抗寒性［4］。

近年來，有關(guān)蘋果砧木抗寒性的研究報(bào)道很多。有學(xué)者采用人工低溫處理的方法利用半致死溫度結(jié)合生理指標(biāo)對(duì)蘋果砧木做出抗寒性評(píng)價(jià)［5-6］。有學(xué)者研究自然越冬過程中利用電解質(zhì)滲透率和生理指標(biāo)研究測(cè)定蘋果砧木的抗寒性［7］。研究植物的生理生化特征，正確鑒定植物的抗寒性能，對(duì)物種保護(hù)和育種均具有重要意義［8］。目前蘋果矮砧密植栽培中SH40 砧木應(yīng)用較多［9］，SH40 是我國北方蘋果產(chǎn)區(qū)推廣的抗寒性較強(qiáng)的矮化砧木之一［10］。GM256 是吉林省農(nóng)科院果樹研究所培育的抗寒性強(qiáng)的矮化中間砧［11］，是目前生產(chǎn)上表現(xiàn)良好的優(yōu)良抗寒矮化砧木。本試驗(yàn)選用應(yīng)用較多的SH40 和抗寒性強(qiáng)的GM256 作為對(duì)照，期待能夠?qū)Ρ狙芯恐衅渌枘镜目购蕴峁﹨⒖家罁?jù)。

以本團(tuán)隊(duì)新培育的1 號(hào)、15-1、24-5、ZC9-3 砧木及抗寒性較強(qiáng)的GM256 和SH40 的1 年生蘋果休眠枝條為試材，對(duì)其越冬過程中的半致死溫度、SOD 和POD 酶活性、可溶性蛋白、MDA、脯氨酸和可溶性糖等生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，研究各蘋果砧木枝條在越冬過程中生理適應(yīng)特性和變化規(guī)律，并利用主成分分析和聚類分析綜合評(píng)價(jià)6 種蘋果中間砧的抗寒性，篩選出抗寒性強(qiáng)的新的優(yōu)良蘋果砧木，以期為植物抗性生理機(jī)制的研究和蘋果抗寒砧木的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以6 種蘋果中間砧（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)蘋果砧木創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)新選育的編號(hào)分別為1 號(hào)、15-1、24-5、ZC9-3 的4 種砧木，抗寒性較強(qiáng)的GM256 和生產(chǎn)上常用的SH40 為對(duì)照）的1 年生休眠期枝條為試驗(yàn)材料，基砧均為無融合生殖的‘平邑甜茶’（Malus hupehensisvar. pingyiensis）。試材地點(diǎn)位于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)，盆栽法種植。每種砧木選擇生長勢(shì)一致的30 株進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取樣與處理 分別于 2020 年11 月07 日、2020 年12 月07 日、2021 年1 月05 日、2021 年3 月05 日取樣，取樣期間每月的平均最高氣溫分別為11.70、3.80、3.06、14.29 ℃，平均最低氣溫分別為0.63、-9.06、-9.48、4.16 ℃，月平均氣溫分別為5.97、-2.94、-3.20、9.12 ℃。取樣當(dāng)天的氣溫情況見表 1。每種砧木采取健壯一致、無病蟲害的1 年生休眠枝條。枝條采后洗凈帶回，一部分枝條取其枝皮，液氮速凍，于-80 ℃冰箱保存待測(cè)生理指標(biāo)；另一部分枝條每種砧木分裝6 個(gè)自封袋中進(jìn)行6 個(gè)低溫處理，測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率，求低溫半致死溫度。

表1 各蘋果砧木越冬期取樣當(dāng)天的氣溫情況Table 1 Temperature on the sampling day of each apple rootstock during overwintering period

1.2.2 低溫處理 低溫處理參照金明麗［4］的方法。使用可變溫的超低溫冰箱進(jìn)行人工冷凍處理，每次設(shè)定6 個(gè)溫度梯度（表2），低溫處理后的枝條用于測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率。

表2 4 次低溫處理測(cè)定抗寒性所設(shè)溫度Table 2 Set temperature for cold resistance determination after 4 low temperature treatments

1.2.3 測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率 參照金明麗［4］、楊雪［12］和張剛［13］等人的方法計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率（E）和半致死溫度（LT50），測(cè)定電導(dǎo)率的方法略有改動(dòng)。將已低溫處理好的枝條切成15 mm 長的枝段，中間十字劈開，放入裝有10 mL 超純水的試管中。在搖床上震蕩 24 h 后用DDS-307A 型電導(dǎo)率儀（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）測(cè)定初電導(dǎo)值R1和空白電導(dǎo)值R0。沸水浴30 min 后，再次放到搖床上震蕩24 h 后，測(cè)終電導(dǎo)值R2。按公式E(%)=(R1-R0)/(R2-R0)×100 計(jì)算各處理的相對(duì)電導(dǎo)率E。

1.2.4 測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo) 生理生化指標(biāo)測(cè)定：每個(gè)砧木3 次生物學(xué)重復(fù)。采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛含量［14］；采用NBT 法測(cè)定超氧化物歧化酶活性［4］；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶活性［4］；采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量［4］；采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法測(cè)定可溶性蛋白含量［15］；采用酸性茚三酮染色法測(cè)定脯氨酸含量［15］。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 利用Microsoft Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖，利用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行擬合半致死溫度、聚類分析、主成分分析和生理指標(biāo)差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 越冬過程中各蘋果砧木枝條半致死溫度（LT50）的變化

測(cè)得不同低溫脅迫處理下各蘋果中間砧枝條的相對(duì)電導(dǎo)率，并結(jié)合Logistic 方程求得各蘋果砧木的低溫半致死溫度（LT50）。結(jié)果如圖1 所示，在越冬過程中，各蘋果砧木枝條半致死溫度變化與冬季氣溫變化趨勢(shì)相對(duì)應(yīng)，呈先降低后升高的趨勢(shì)。隨氣溫降低，脅迫加劇，各蘋果砧木相應(yīng)半致死溫度降低，隨后氣溫回升，半致死溫度也隨之上升。各蘋果砧木枝條半致死溫度均在1 月份達(dá)到最低，抗寒性最強(qiáng)。在最冷的1 月份，15-1、1 號(hào)和GM256的半致死溫度顯著低于24-5、SH40 和ZC9-3 的半致死溫度，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗寒性。

圖1 越冬過程中各蘋果砧木枝條半致死溫度（LT50）的變化Fig.1 Changes of half lethal temperature (LT50) of branches of apple rootstocks during overwintering

2.2 自然越冬過程中各蘋果砧木枝條生理指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化

2.2.1 丙二醛（MDA）含量的變化 如圖2 所示，大多數(shù)蘋果砧木枝條MDA 含量變化與冬季氣溫變化趨勢(shì)相反，呈先升高后降低的趨勢(shì)。隨自然溫度的降低，各蘋果砧木枝條中的MDA 含量有所增加，隨后低溫持續(xù)加劇，各蘋果砧木枝條中的MDA 含量呈急劇上升的趨勢(shì)，升高的幅度因砧木特性的不同而不同，在1 月份達(dá)到最值。隨后，冬季氣溫回升，脅迫減輕，各蘋果砧木枝條中的MDA 含量均呈下降趨勢(shì)。其中15-1 的MDA 含量變化略有差異，在整個(gè)越冬過程中MDA 持續(xù)升高。在整個(gè)越冬過程中，GM256 和1 號(hào)的MDA 含量相對(duì)較低。ZC9-3、24-5 和15-1 的MDA 含量相對(duì)較高。

圖2 越冬過程中各蘋果砧木枝條丙二醛（MDA）含量的變化Fig.2 Changes of malondialdehyde (MDA) content in branches of apple rootstocks during overwintering

2.2.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化 如圖3 所示，各蘋果砧木枝條SOD 活性變化與冬季氣溫變化趨勢(shì)相反，呈先升高后降低的趨勢(shì)。隨自然溫度的降低，各蘋果砧木枝條的SOD 活性均有不同程度的增加，且均在1 月份低溫脅迫最嚴(yán)重時(shí)SOD 活性升至最高。隨后，冬季氣溫回升，各蘋果砧木枝條SOD 活性均呈下降趨勢(shì)。在整個(gè)越冬過程中，15-1、GM256、1 號(hào)、SH40 和24-5 的SOD 活性較高。ZC9-3 的SOD 活性始終較低。

圖3 越冬過程中各蘋果砧木枝條超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化Fig.3 Changes of superoxide dismutase (SOD) activity in branches of apple rootstocks during overwintering

2.2.3 過氧化物酶活性(POD)活性的變化 如圖4所示，各蘋果砧木枝條POD 活性變化與冬季氣溫變化趨勢(shì)相反，呈先升高后降低的趨勢(shì)。隨自然溫度的降低，各蘋果砧木枝條的POD 活性均有不同程度的增加，且均在1 月份溫度脅迫最嚴(yán)重時(shí)POD 活性升至最高。隨后，冬季氣溫回升，各蘋果砧木枝條POD 活性呈下降趨勢(shì)。在整個(gè)越冬過程中，15-1 和GM256 的POD 活性始終處于較高水平，顯著高于其它砧木，且15-1 顯著高于GM256 的POD 活性。ZC9-3、SH40 和24-5 的POD 活性一直處于較低水平，顯著低于其它砧木。

圖4 越冬過程中各蘋果砧木枝條過氧化物酶(POD)活性的變化Fig.4 Changes of peroxidase (POD) activity in branches of apple rootstocks during overwintering

2.2.4 可溶性糖含量的變化 如圖5 所示，各蘋果砧木枝條的可溶性糖含量變化與冬季氣溫變化趨勢(shì)相反，呈先升高后降低的趨勢(shì)。隨自然溫度的降低，各蘋果砧木枝條的可溶性糖含量均有不同程度的增加，且均在1 月份溫度脅迫最嚴(yán)重時(shí)可溶性糖含量升至最高。隨后，冬季氣溫回升，各蘋果砧木枝條可溶性糖含量呈下降趨勢(shì)。在冬季低溫脅迫前期，即2020 年11 月7 日，15-1 和1 號(hào)的可溶性糖含量顯著高于其它幾種砧木。

圖5 越冬過程中各蘋果砧木枝條可溶性糖含量的變化Fig.5 Changes of soluble sugar content in branches of apple rootstocks during overwintering

2.2.5 可溶性蛋白含量的變化 如圖6 所示，各蘋果砧木枝條可溶性蛋白含量變化與冬季氣溫變化趨勢(shì)相反，呈先升高后降低的趨勢(shì)。隨自然溫度的降低，各蘋果砧木枝條的可溶性蛋白含量均有不同程度的增加，且均在1 月份溫度脅迫最嚴(yán)重時(shí)可溶性蛋白含量升至最高。隨后，冬季氣溫回升，各蘋果砧木枝條可溶性蛋白含量有所降低。在越冬過程中，GM256 的可溶性蛋白始終處于較高水平，顯著高于其他砧木，前2 個(gè)時(shí)期顯著高于其他砧木。

圖6 越冬過程中各蘋果砧木枝條可溶性蛋白含量的變Fig.6 Changes of soluble protein content in branches of apple rootstocks during overwintering

2.2.6 脯氨酸含量的變化 如圖7 所示，大多數(shù)蘋果砧木枝條脯氨酸含量變化與冬季氣溫變化趨勢(shì)相反，呈先升高后降低的趨勢(shì)。隨自然溫度的降低，各蘋果砧木枝條的脯氨酸含量均有不同程度的增加，且均在1 月份溫度脅迫最嚴(yán)重時(shí)脯氨酸含量升至最高。隨后，冬季氣溫回升，各蘋果砧木枝條脯氨酸含量有所降低。在整個(gè)越冬過程中，各蘋果砧木的脯氨酸含量差異顯著。

圖7 越冬過程中各蘋果砧木枝條脯氨酸含量的變化Fig.7 Changes of proline content in branches of apple rootstocks during overwintering

2.3 自然越冬過程中各蘋果砧木枝條抗寒性綜合評(píng)價(jià)及抗寒分類

參照李捷［16］利用主成分分析綜合評(píng)價(jià)抗寒性。根據(jù)綜合得分值的大小判斷抗寒力強(qiáng)弱，得分值越高則抗寒力越強(qiáng)，評(píng)價(jià)結(jié)果如表3 所示。利用主成分綜合得分值進(jìn)行聚類分析，聚類分析采用Ward 法。聚類結(jié)果如圖8 所示，在歐氏距離為4.0 處，將 6個(gè)蘋果砧木分為4 類，結(jié)合表4 綜合得出：15-1 抗寒性最強(qiáng)；1 號(hào)和GM256 抗寒性較強(qiáng)；SH40 和24-5 抗寒性中等；ZC9-3 抗寒性最弱。6 種蘋果砧木抗寒性由強(qiáng)到弱順序?yàn)椋?5-1＞1 號(hào)＞GM256＞24-5＞SH40＞ZC9-3。

表3 各主成分得分、綜合得分、抗寒排序及分類Table 3 Principal component scores, comprehensive scores, cold resistance ranking and classification

圖8 各蘋果砧木枝條抗寒性聚類分析Fig.8 Cluster analysis of cold resistance of branches of Apple Rootstocks

3 討論

利用相對(duì)電導(dǎo)率結(jié)合 Logistic 方程求得植物低溫半致死溫度（LT50）來判斷各植物品種間的抗寒性已在蘋果、梨、核桃［17-19］等果樹品種資源抗寒性鑒定中得到普遍應(yīng)用。本研究中，各蘋果砧木枝條在越冬期間的半致死溫度變化與冬季氣溫變化趨勢(shì)相同，呈先降低后升高趨勢(shì)。原因是外界環(huán)境逐漸降低，植物經(jīng)過抗寒鍛煉后，調(diào)節(jié)自身生理機(jī)能，抗寒性逐漸提高。該研究結(jié)果與許瑛［20］等人研究結(jié)果一致。李翠紅［21］在蘋果矮化砧木抗寒性研究中表明GM256＞SH40，且半致死溫度分別為-34.128、-27.380 ℃。此研究結(jié)果與本研究中作為對(duì)照的GM256 和SH40 的抗寒性強(qiáng)弱結(jié)果一致，但半致死溫度存在差異，可能與地域差異、取材時(shí)間及樹體年齡不同有關(guān)。另外，在李翠紅［21］和楊鳳秋［22］的研究中均表明GM256 屬于抗寒性強(qiáng)的砧木，與本研究結(jié)果一致。本研究篩選出抗寒性比GM256 強(qiáng)的砧木1 種，編號(hào)為15-1，抗寒性與GM256 同樣強(qiáng)的砧木1 種，編號(hào)為1 號(hào)。

低溫脅迫下，可通過MDA 含量判斷細(xì)胞膜受損傷程度和植物的抗寒性［23］。本研究中，大多數(shù)蘋果砧木枝條在越冬期間的丙二醛含量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，在冬季1 月份最冷時(shí)丙二醛含量最高，表明前期隨溫度脅迫程度加重，氧自由基大量積累，加劇了膜脂過氧化反應(yīng)，質(zhì)膜損傷程度加重，MDA 含量增加，1 月份溫度最低，對(duì)質(zhì)膜傷害最大，因此MDA 含量最高。這與王飛雪［24］和楊捷［25］的抗寒性研究的結(jié)果一致。后期MDA 含量降低，是由于春季溫度回升后，低溫脅迫減輕，各蘋果砧木受傷的膜系統(tǒng)得到修復(fù)，因此MDA 含量降低。這與田愛菊［26］的抗寒性研究發(fā)現(xiàn)相同。

SOD 和POD 是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶，植物體內(nèi)酶活性的變化能夠反映植物在低溫脅迫后受傷的程度［27］。本研究中，各蘋果砧木枝條在越冬期間的SOD 和POD 活性變化與冬季溫度變化趨勢(shì)相反，呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，在1 月份最冷時(shí)達(dá)到最值。表明隨溫度的降低，各蘋果砧木能夠增加自身保護(hù)酶活性提高抗寒性，以保護(hù)砧木枝條安全越冬。這與歐歡［28］對(duì)扁桃抗寒性研究結(jié)果一致。此外，抗寒性強(qiáng)的砧木枝條中SOD 和POD 活性始終高于抗寒性弱的砧木枝條。保護(hù)酶活性越高，說明其清除活性氧的能力越強(qiáng)，能夠保護(hù)膜系統(tǒng)從而提高了植物的抗寒性。這與王賀［29］和郭改改［30］研究發(fā)現(xiàn)一致。

可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸是植物中最常見的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)［31］?？扇苄蕴?、可溶性蛋白和脯氨酸含量的增加與植物的抗寒性存在相關(guān)性［32］。本研究中，各蘋果砧木枝條在越冬期間的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量與冬季溫度變化趨勢(shì)相反，呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。前期隨溫度降低，低溫脅迫加重，各蘋果砧木增加自身滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)從而保證安全越冬，后期溫度升高，低溫脅迫減輕，含量降低。這與李葉云［33］和李鵬程［34］等人研究結(jié)果一致。這表明，低溫脅迫下，各種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的增加，有助于提高細(xì)胞的濃度和保水能力，降低細(xì)胞的冰點(diǎn)，提高原生質(zhì)體的保護(hù)能力，從而提高植物抗寒性［35］。

4 結(jié)論

6 個(gè)蘋果砧木枝條的半致死溫度低與冬季氣溫變化趨勢(shì)相同，呈先降低后升高趨勢(shì)；丙二醛含量、SOD 和POD 活性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和脯氨酸含量與冬季氣溫變化趨勢(shì)相反，呈先升高后降低趨勢(shì)。6 種蘋果砧木的抗寒性由強(qiáng)到弱順序?yàn)椋?5-1＞1 號(hào)＞GM256＞24-5＞SH40＞ZC9-3。聚類分析得出，15-1 為抗寒性最強(qiáng)，強(qiáng)于GM256；1 號(hào)和GM256 為抗寒性較強(qiáng)；SH40 和24-5 抗寒性中等；ZC9-3 抗寒性較弱。