李 白，曹麗萍，劉英姿，張福源，張 康，邢繼紅，董金皋

(1.省部共建華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000；2.河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 齊齊哈爾分院，黑龍江 齊齊哈爾 161000；4.河北省承德市園林管理中心，河北 承德 067000)

玉米大斑病（NCLB）是世界范圍內(nèi)玉米上的重要葉部病害，其病原菌為玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica），該病菌侵染玉米葉部組織并誘導(dǎo)其壞死病變，嚴(yán)重影響葉片的光合作用，造成產(chǎn)量損失［1］。因此，挖掘玉米大斑病菌的生長(zhǎng)發(fā)育和致病相關(guān)的基因，深入研究其作用機(jī)制將為玉米大斑病的防控提供理論依據(jù)。

犬尿氨酸途徑（Kynurenine pathway，KP）是色氨酸分解代謝的主要方式［2-3］，從酵母到人類的整個(gè)真核生物譜系中高度保守，能夠影響多種重要的生物過程［4］。色氨酸在肝臟中由色氨酸-2, 3-雙加氧酶（Tryptophan-2, 3-dioxygenase, TDO）或者其它組織里的吲哚-2, 3-雙加氧酶（Indoleamine-2,3-dioxygenase, IDO）的作用下生成N-甲?；虬彼幔∟-Formylkynurenine），犬尿氨酸甲酰胺酶（Kynurenine formamidase, KFA）將其水解后，得到犬尿氨酸（Kynurenine）。犬尿氨酸位于該途徑的一個(gè)重要的分支位點(diǎn)，依賴于NADPH，并能在犬尿氨酸上發(fā)揮羥基化，最后產(chǎn)生3- 羥基犬尿氨酸［5-6］。

犬尿氨酸途徑（KP）在以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的形式產(chǎn)生細(xì)胞能量方面起著關(guān)鍵作用［7］。NAD(P)+是所有生命體內(nèi)氧化還原反應(yīng)的輔助因子，同時(shí)也在DNA 修復(fù)和組蛋白去乙?；^程中起重要作用［8-9］。在許多微生物中，犬尿氨酸途徑是其NAD+生物合成的唯一來源［10］。在哺乳動(dòng)物中，犬尿氨酸單加氧酶（KMO）作用于犬尿氨酸，生成具有神經(jīng)毒性的3-羥基犬尿氨酸，與多種神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。而在細(xì)菌和部分真菌體內(nèi)，犬尿氨酸途徑與真核生物類似，不同的就是犬尿氨酸酶替換了真核生物中的犬尿氨酸單加氧酶，由犬尿氨酸生成鄰氨基苯甲酸和L-丙氨酸。鄰氨基苯甲酸被氧化酶氧化成鄰苯二酚，經(jīng)過多步反應(yīng)，最終轉(zhuǎn)變成CO2［11］。玉米大斑病菌犬尿氨酸途徑以及此途徑中的關(guān)鍵酶基因的功能都未見報(bào)道。本研究利用生物信息學(xué)方法，對(duì)玉米大斑病菌犬尿氨酸途徑中的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行系統(tǒng)分析，確定玉米大斑病菌犬尿氨酸途徑的關(guān)鍵酶基因；利用玉米大斑病菌的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，確定犬尿氨酸途徑關(guān)鍵酶基因在病菌生長(zhǎng)發(fā)育和侵染過程中的表達(dá)規(guī)律，為闡明玉米大斑病菌犬尿氨酸途徑及其途徑關(guān)鍵酶基因在病菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病過程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 玉米大斑病菌犬尿氨酸途徑關(guān)鍵酶基因序列的獲得

利用人和小鼠的犬尿氨酸途徑關(guān)鍵酶基因的氨基酸序列，從Ensembl fungi（http://fungi.ensembl.org/index.html）中用Blast 搜索得到玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）中的同源序列。

1.2 犬尿氨酸途徑關(guān)鍵酶基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用人類和小鼠的犬尿氨酸單加氧酶（Kynurenine 3-monooxygenase，KMO）、犬尿氨酸酶（Kynureninase，KYN）、吲哚-2, 3-雙加氧酶（Indoleamine-2, 3-dioxygenase，IDO）、犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Kynurenine aminotransferase，KAT）的氨基酸序列，在Ensembl Fungi 真菌數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索玉米大斑病菌的全基因組序列；對(duì)搜索的結(jié)果進(jìn)行深入的分析，并利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行基因的多序列比對(duì)，并用鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，設(shè)置 bootstrap 值為 1 000。

1.3 犬尿氨酸途徑關(guān)鍵酶基因的結(jié)構(gòu)域分析

利用玉米大斑病菌犬尿氨酸途徑關(guān)鍵酶基因StKMO、StKYN、StIDO、StKAT的氨基酸序列，通過InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/）網(wǎng)站，對(duì)其功能域進(jìn)行分析，用IBS 軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的繪制。

1.4 犬尿氨酸途徑關(guān)鍵酶基因在玉米大斑病菌生長(zhǎng)發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)分析

從公共平臺(tái)GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），獲取玉米大斑病菌生長(zhǎng)發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)編號(hào)為SRR9997710、SRR9997709、SRR9997708、SRR9997715 和SRR9997714；對(duì)犬尿氨酸途徑關(guān)鍵酶基因StKMO、StKYN、StIDO、StKAT在病菌生長(zhǎng)發(fā)育的不同時(shí)間的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，取log2 值后確定目的基因在病菌不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平。

1.5 犬尿氨酸途徑關(guān)鍵酶基因在玉米大斑病菌侵染過程中的表達(dá)分析

從公共平臺(tái)GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），獲取玉米大斑病菌侵染過程中的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)編號(hào)為SRR12131452、SRR12131453、SRR12131454 和SRR12131455；對(duì)犬尿氨酸途徑關(guān)鍵酶基因StKMO、StKYN、StIDO、StKAT在病菌侵染不同時(shí)間的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，取log2 值后確定目的基因在病菌不同侵染時(shí)間的表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 犬尿氨酸單加氧酶（KMO）的系統(tǒng)發(fā)育樹和功能域分析

利用人類和小鼠的犬尿氨酸單加氧酶（KMO）的氨基酸序列在Ensembl Fungi 真菌數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索玉米大斑病菌的氨基酸序列，使用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)SETTUDRAFT_165798與其他物種的KMO 相似性較高（圖1A）；利用InterProScan［12］網(wǎng)站對(duì)其功能域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它們都具有犬尿氨酸單加氧酶（kynurenine 3-monooxygenase） 的功能域（ 圖1B）。 表明SETTUDRAFT_165798 為玉米大斑病菌的犬尿氨酸單加氧酶（KMO）基因，命名為StKMO。

圖1 犬尿氨酸單加氧酶KMO 的系統(tǒng)發(fā)育樹和功能域分析Fig.1 Phylogenetic tree and functional domain analysis of kynurenine 3-monooxygenase

2.2 犬尿氨酸酶（KYN）的系統(tǒng)發(fā)育樹和功能域分析

利用人類和小鼠的犬尿氨酸酶（KYN）的氨基酸序列在Ensembl Fungi 真菌數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索玉米大斑病菌的氨基酸序列，使用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)SETTUDRAFT_165216 與其他物種的KYN 相似性較高（圖2A）；利用InterProScan網(wǎng)站對(duì)其功能域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它們都具有一個(gè)犬尿氨酸酶（Kynureninase）的功能域，并具有高度相似性（圖2B）。表明SETTUDRAFT_165216 為玉米大斑病菌的犬尿氨酸酶（KYN）基因，命名為StKYN。

圖2 犬尿氨酸酶KYN 的系統(tǒng)發(fā)育樹和功能域分析Fig.2 Phylogenetic tree and functional domain analysis of kynureninase

2.3 犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（KAT）的系統(tǒng)發(fā)育樹和功能域分析

利用人類和小鼠的犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（KAT）的氨基酸序列在Ensembl Fungi 真菌數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索玉米大斑病菌的氨基酸序列，使用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)SETTUDRAFT_177407與其他物種的KAT 相似性較高（圖3A）；利用InterProScan 網(wǎng)站對(duì)其功能域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它們都具有一個(gè)犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Kynurenine aminotransferase） 的功能域（ 圖3B）。 表明SETTUDRAFT_177407 為玉米大斑病菌犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（KAT）基因，命名為StKAT。

圖3 犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶KAT 的系統(tǒng)發(fā)育樹和功能域分析Fig.3 Phylogenetic tree and functional domain analysis of kynurenine aminotransferase

2.4 吲哚-2, 3-雙加氧酶（IDO）的系統(tǒng)發(fā)育樹和功能域分析

利用人類和小鼠的吲哚-2, 3-雙加氧酶（IDO）的氨基酸序列在Ensembl Fungi 真菌數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索玉米大斑病菌的氨基酸序列，系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)SETTUDRAFT_102413、SETTUDRAFT_171749與其他物種的IDO 相似性較高（圖4A）；利用InterProScan 網(wǎng)站對(duì)其功能域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它們都具有吲哚-2, 3- 雙加氧酶（Indoleamine-2,3-dioxygenase）的功能域，并具有高度相似性（圖4B）。表明SETTUDRAFT_102413、SETTUDRAFT_171749 為玉米大斑病菌的吲哚-2, 3-雙加氧酶（IDO）基因，命名為StIDOs。

圖4 吲哚-2, 3-雙加氧酶IDO 的系統(tǒng)發(fā)育樹和功能域分析Fig.4 Phylogenetic tree and functional domain analysis of indoleamine-2, 3-dioxygenase

2.5 犬尿氨酸途徑關(guān)鍵酶基因在玉米大斑病菌生長(zhǎng)發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)分析

利用公共平臺(tái)GEO 中玉米大斑病菌的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對(duì)犬尿氨酸途徑關(guān)鍵酶基因StKMO、StKYN、StKAT、StIDOs在病菌的附著孢時(shí)期、萌芽時(shí)期，早萌時(shí)期以及分生孢子發(fā)育時(shí)期的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，StKMO基因在病菌萌芽和分生孢子發(fā)育時(shí)期高水平表達(dá)，在附著胞時(shí)期和早萌時(shí)期表達(dá)相對(duì)較低；StKYN基因在病菌生長(zhǎng)發(fā)育的4 個(gè)時(shí)期均呈現(xiàn)高水平表達(dá)；StKAT基因在病菌分生孢子發(fā)育時(shí)期高水平表達(dá)，在附著胞時(shí)期、萌芽時(shí)期和早萌時(shí)期表達(dá)相對(duì)較低；StIDO-1（SETTUDRAFT_102413）基因在病菌生長(zhǎng)發(fā)育的4 個(gè)時(shí)期均呈現(xiàn)高表達(dá)，StIDO-2（SETTUDRAFT_171749）基因在病菌萌芽時(shí)不表達(dá)，其他時(shí)間均表達(dá)（見圖5）。

圖5 犬尿氨酸途徑關(guān)鍵酶基因在玉米大斑病菌生長(zhǎng)發(fā)育中的表達(dá)Fig.5 Expression of key enzyme genes of the kynurenine pathway in growth and development of Setosphaeria turcica

2.6 犬尿氨酸途徑關(guān)鍵酶基因在玉米大斑病菌侵染過程中的表達(dá)分析

利用公共平臺(tái)GEO 中玉米大斑病菌的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對(duì)犬尿氨酸途徑關(guān)鍵酶基因StKMO、StKYN、StKAT、StIDOs在病菌侵染的3、5、9、13 d 的數(shù)據(jù)與對(duì)照（0 d）進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌StKMO基因在病菌侵染3、9 和13 d 時(shí)高水平表達(dá)，在侵染0 d 和5 d 時(shí)不表達(dá)；StKYN基因和StKAT基因在病菌侵染9 d、13 d 時(shí)高水平表達(dá)，在病菌侵染的前5 d 均不表達(dá)；StIDOs（SETTUDRAFT_102413 和SETTUDRAFT_171749）基因只在病菌侵染9 d 時(shí)表達(dá)，其他時(shí)間均不表達(dá)（見圖6）。

圖6 犬尿氨酸途徑關(guān)鍵酶基因在玉米大斑病菌侵染過程中的表達(dá)Fig.6 Expression of key enzyme genes of kynurenine pathway in infection of Setosphaeria turcica

3 結(jié)論與討論

在哺乳動(dòng)物中，KMO 作用于犬尿氨酸，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩窠?jīng)毒性的3-羥基犬尿氨酸，與亨廷頓病（Huntington’s, HD）、阿爾茨海默病（Alzheimer’s, AD）和帕金森?。≒arkinson’s, PD）等多種神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)［13-16］。研究報(bào)道，細(xì)菌以及部分真菌中也存在與哺乳動(dòng)物相似的犬尿氨酸途徑。如，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）通過犬尿氨酸途徑分解代謝色氨酸［17］。玫瑰孢鏈霉菌（Streptomyces roseosporus）達(dá)托霉素生物合成基因簇中含有色氨酸2, 3-雙加氧酶基因dptJ，dptJ基因敲除后，達(dá)托霉素的產(chǎn)量顯著降低；將玫瑰孢鏈霉菌中的TDO 敲除后，達(dá)托霉素的產(chǎn)量也顯著降低；分別遺傳回補(bǔ)后產(chǎn)量得到增加，表明犬尿氨酸途徑在達(dá)托霉素生物合成中的重要作用［18］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在人體炎癥條件下，犬尿氨酸途徑中的關(guān)鍵酶，特別是犬尿氨酸3-單加氧酶（KMO）會(huì)有明顯的上調(diào)［19］。

目前，玉米大斑病菌犬尿氨酸途徑及其途徑關(guān)鍵酶基因的功能均未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過對(duì)Ensembl fungi 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，獲得了玉米大斑病菌中犬尿氨酸途徑關(guān)鍵酶的編碼基因，包括1 個(gè)犬尿氨酸單加氧酶（KMO）的編碼基因StKMO、1 個(gè)犬尿氨酸酶（KYN）的編碼基因StKYN、1 個(gè)犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（KAT）的編碼基因StKAT以及2 個(gè)吲哚-2, 3-雙加氧酶（IDO）的編碼基因StIDOs。利用生物信息相關(guān)方法對(duì)玉米大斑病菌的犬尿氨酸途徑關(guān)鍵酶基因進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析和保守結(jié)構(gòu)域分析，證明了玉米大斑病菌犬尿氨酸途徑的存在。利用玉米大斑病菌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)犬尿氨酸途徑關(guān)鍵酶基因StKMO、StKYN、StKAT和StIDOs在病菌生長(zhǎng)發(fā)育和侵染過程中的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些基因在病菌不同生長(zhǎng)發(fā)育和侵染時(shí)期呈現(xiàn)高水平表達(dá)，推測(cè)這些基因在玉米大斑病菌生長(zhǎng)發(fā)育以及侵染過程中發(fā)揮重要功能。但是玉米大斑病菌犬尿氨酸途徑及其關(guān)鍵酶基因在病菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病過程中功能以及作用機(jī)制還需進(jìn)一步的深入研究。