陳庭巧,袁 濤,喬紅雍,徐 珂

(北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院,花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室,國家花卉工程技術(shù)研究中心,城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室, 園林環(huán)境教育部工程研究中心,林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室,北京 100083)

大花黃牡丹(Paeonialudlowii(Stern & G.Taylor)D.Y.Hong)為芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Sect.Moutan)肉質(zhì)花盤亞組(Subsect.Delavayanae)灌木，花黃色，一枝多花，觀賞價值和育種價值高[1-2]，其異交、自交親和，但結(jié)實率低[3]。芍藥屬牡丹組所有種均列入國家重點保護野生植物名錄，其中大花黃牡丹被列為二級[4]。

植物的花朵、果實與種子之間關(guān)系密切?；ǘ浜凸麑嵉臄?shù)量以及它們在時間和空間上的聚集方式會影響傳粉者的吸引力和資源分配，從而影響生殖的成功率[5]。已有研究指出，過多的花會影響種子和果實形成[6-7]。如在盛花期對黃花草木樨(Melilotusofficinalis)進行疏花處理能明顯降低資源競爭，增加子房中的胚珠數(shù)[8]。另外，果實在花序上的位置對熱帶低地半落葉林中7種自交不親和樹種敗育有顯著影響，某些位置果實和種子敗育的概率高于其他位置[9]。大花黃牡丹一枝多花，在當年花枝/果枝上形成二次枝，二次枝的形成是其下一個年周期形成側(cè)枝和開花結(jié)實的前提與保證[10]。與牡丹組其他類群相比，大花黃牡丹果實發(fā)育與二次枝生長及頂芽分化重合，三者間營養(yǎng)和調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化會影響引種后的結(jié)果率和結(jié)實率。因此，研究大花黃牡丹果實和二次枝及側(cè)蕾之間的競爭關(guān)系有重要意義。

營養(yǎng)物質(zhì)代謝、抗氧化酶活性和激素在植物營養(yǎng)生長、胚胎發(fā)育、果實成熟等階段均具有重要作用[6]。有關(guān)植物胚胎發(fā)育和敗育生理生化特性的研究主要集中在經(jīng)濟物種上，如杉木(Cunninghamialanceolata)[11-12]、西瓜(Citrulluslanatus)[13]、油松(Pinustabuliformis)[14]、玉米(Zeamays)[15-16]、荔枝(Litchichinensis)[17-18]、葡萄(Vitisvinifera)[19-21]和棗(Ziziphusjujuba)[22]等。而關(guān)于牡丹胚胎發(fā)育和敗育，特別是胚胎發(fā)育和敗育過程中生理生化特性及其變化規(guī)律尚鮮見報道。

本研究以河南省洛陽市欒川縣芍藥科遷地保護中心引種栽培的大花黃牡丹為對象，于2019年及2020年觀測了果實及種子發(fā)育規(guī)律，并于2019―2021年進行田間控制試驗，驗證二次枝生長和果實發(fā)育過程中的競爭關(guān)系，比較正常胚珠與敗育胚珠的形態(tài)、生理生化指標及內(nèi)源激素含量的變化，分析大花黃牡丹果實發(fā)育的競爭關(guān)系、胚珠敗育的時間及營養(yǎng)物質(zhì)和激素的變化，以期為大花黃牡丹引種栽培及人工調(diào)控結(jié)實提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在河南省洛陽市欒川縣芍藥科遷地保護中心(海拔1 245 m，33°56′05″N，111°21′36″E)，以露地栽培、正常開花結(jié)實的大花黃牡丹為試驗材料。2002年秋播種(采自西藏林芝野生居群)，2003年起陸續(xù)出苗，2008年首次開花[23]。

1.2 開花特性觀察

大花黃牡丹每花枝一般有2～5朵花，花枝最上方的一朵稱為頂花(TF)，位于頂花下方的均稱為側(cè)花(LF)，側(cè)花從下往上按照1～4進行排序，分別記為LF1、LF2、LF3和LF4(圖1)。在5月花期，隨機選取50個花枝作為觀測枝，掛上吊牌，做好標記，定期對觀測枝進行開花物候觀測拍照，記錄單個花枝上的花蕾數(shù)、開花數(shù)；當單個花枝上的花蕾數(shù)為3朵時，記錄花朵的開花次序，分為5個類別，分別為TF→LF1→LF2、TF→LF2→LF1、LF1→TF→LF2、LF1→LF2→TF、LF2→TF→LF1，計算各類別占比。

A.不同花朵數(shù)的花枝示意圖；B.開放3花/枝的植株。TF為頂花，LF為側(cè)花。下同 A.Schematic diagram of flowering branches with different numbers of flowers;B.Image of 3 flowers/flowering branches. TF is top flower,LF is side flower.The same below圖1 大花黃牡丹花枝示意圖及實觀圖Fig.1 Flowering branches of Paeonia ludlowii

1.3 果實與胚珠發(fā)育及結(jié)果率調(diào)查

1.3.1 果實發(fā)育 在2019-2021年花果期(5-9月)，選擇開花時間基本一致的心皮，定期觀察其發(fā)育情況以反映果實發(fā)育進程(開花第1天即默認授粉，視為果期第1天)，并使用游標卡尺測量其縱、橫徑(果實兩個頂點的直線距離為縱徑，果實最寬處為橫徑)，花后10～40 d每10 d觀測 1 次，之后分別在花后60和90 d時各觀測1次。由于大花黃牡丹心皮多為1個，少為2或3個，因此觀察時以1心皮果實為主，具1個以上心皮的果實，則計算縱、橫徑的平均值。

1.3.2 胚珠發(fā)育 花后1～90 d，采集自然授粉后的果實，沿腹縫線從中間剖開，觀察胚珠發(fā)育情況。此外，于花后0～90 d,每隔10 d使用游標卡尺測量1 次其縱、橫徑。

1.3.3 胚珠顯微結(jié)構(gòu)觀察 根據(jù)1.3.2觀察結(jié)果，分別采集花后20 d體積正常和異常的胚珠，置于卡諾氏固定液(體積分數(shù)95%乙醇、冰醋酸，二者體積比為3∶1)中。真空處理12 h后，轉(zhuǎn)移到體積分數(shù)70%乙醇溶液中，4 ℃低溫保存。采用常規(guī)石蠟切片方法將固定好的材料進行包埋，切片機(Leica RM2235)切片(切片厚度 9～12 μm)后，用番紅-固綠雙重染色，中性樹膠封片，生物顯微鏡(SDPTOP CX40RFL)觀察并拍照、記錄。

1.3.4 結(jié)果率 花期隨機選取50個花枝，觀測并標記單個花枝上的開花數(shù)，果期時記錄每個花枝上的結(jié)果數(shù)，計算結(jié)果率，拍照記錄果實和結(jié)果枝枯萎情況。結(jié)果率=結(jié)果數(shù)/開花數(shù)×100%。

1.4 大花黃牡丹二次枝生長與果實發(fā)育田間控制試驗

2019-2021年春季，選擇3花/枝的花枝，分成A處理(保留不同花蕾，去除所有二次枝)、B處理(保留所有二次枝，去除不同花蕾)和對照(CK，保留所有花蕾、二次枝及腋芽)，其中A處理又分為7個處理，分別為CYA1～CYA7；B處理又分為6個處理，分別為CYB1～CYB6，具體處理方法見表1。每處理5個重復(fù)。由于去除二次枝可能會使花枝上的腋芽萌發(fā)形成新的二次枝，因此A處理去除所有花枝上的腋芽；B處理則保留所有花枝上的腋芽。待種子成熟時，統(tǒng)計各處理的結(jié)果率、每朵花的飽滿種子數(shù)、敗育種子數(shù)，計算每個果實的結(jié)實率，結(jié)實率=飽滿種子數(shù)/(飽滿種子數(shù)+敗育種子數(shù))×100%。

表1 大花黃牡丹二次枝田間控制試驗Table 1 Field control experiment of secondary branches of Paeonia ludlowii

1.5 生理生化指標及內(nèi)源激素含量的測定

分別在2019年和2020年的5-9月觀察果實發(fā)育，同時于花后12，13，14，15，20，30，50 d定期采集胚珠，當果莢內(nèi)出現(xiàn)明顯敗育胚珠時，將正常胚珠和敗育胚珠分別取樣(敗育胚珠通過解剖觀察確定)，錫箔紙包裹后用液氮處理2～5 min，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)果實發(fā)育及顯微觀察結(jié)果[24]，選擇相應(yīng)時期的樣品進行生理生化指標及內(nèi)源激素含量測定。用蒽酮比色法測定可溶性糖和淀粉含量，用考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白含量，用氮藍四唑(NBT)光還原法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性[25]。用酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)測定脫落酸(ABA)、赤霉素(GA3)、玉米素核苷(ZR)及生長素(IAA)等內(nèi)源激素的含量[26]。每個樣品3個生物學(xué)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Adobe Photoshop 2020軟件對圖片進行處理，使用WPS Office 2019及SPSS Statistics 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大花黃牡丹開花特性觀察

由表2可知，大花黃牡丹3花蕾/枝占比最高(65.96%)，4花蕾/枝次之(23.40%)。因部分花蕾不能正常開放，每花枝上2朵或3朵占比最高，分別為38.30%和36.17%。大花黃牡丹的TF和LF開放順序并不固定，以3花/枝為例，TF先開放，LF1隨后開放，LF2最后開放(即TF→LF1→LF2)的花枝最多。

2.2 大花黃牡丹果實及胚珠的形態(tài)變化

2.2.1 果實發(fā)育過程中的形態(tài)變化 觀察發(fā)現(xiàn)，大花黃牡丹單花花期8～9 d，柱頭露出時即有訪花昆蟲。隨著果實的生長，柱頭顏色逐漸加深，由黃變?yōu)榧t色，最后黑褐色；花期時果實外表皮較平滑，在發(fā)育過程中逐漸凹凸不平，并由黃綠色變?yōu)榫G色，隨后變紅、變黑(圖2)。

表2 大花黃牡丹的開花特性Table 2 Flowering characteristics of Paeonia ludlowii

A.花后1～80 d；B.花后100 d A.1―80 d after flowering;B.100 d after flowering圖2 大花黃牡丹果實發(fā)育過程中的形態(tài)變化Fig.2 Changes in fruit morphology of Paeonia ludlowii

大花黃牡丹果實不同發(fā)育時期的生長動態(tài)見圖3。

圖柱上標不同小寫字母表示同一指標不同時期差異 顯著(P<0.05)。下同 Different lowercase letters indicate significant differences among periods(P<0.05).The same below圖3 大花黃牡丹果實不同發(fā)育時期的生長動態(tài)Fig.3 Growth of Paeonia ludlowii fruit in different stages

圖3顯示，大花黃牡丹果實發(fā)育過程中，縱徑和橫徑均在花后10～30 d快速增長，之后趨于平緩。其中縱徑在花后10～20 d增長最快，平均日增長量為1.394 mm，花后20～30 d增長稍慢，平均日增長量為0.795 mm。橫徑則在花后20～30 d增長最快，平均日增長量為0.434 mm，花后10～20 d增長稍慢，平均日增長量為0.385 mm。成熟時(90 d)果實的縱橫徑比為2.762。

2.2.2 胚珠的形態(tài)變化 花后1～10 d，大花黃牡丹胚珠增大明顯，但總體積變化不明顯(圖4-A～C)?；ê?3 d，胚珠間體積差別明顯(圖4-D)。之后正常胚珠體積快速增大，表面分泌黏液；部分胚珠停止增長，與正常胚珠差異逐漸明顯(圖4-E～F)?；ê?0～50 d，正常胚珠體積繼續(xù)增大，胚珠表面光滑并有黏液，敗育胚珠停止增長，變干，種皮變皺，二者之間的體積及外部形態(tài)差異明顯(圖4-G～J)。之后正常胚珠種皮逐漸變得結(jié)實堅硬，并慢慢褐化變黑，直至成熟(圖4-K)。從花后13 d起，每個果實內(nèi)可清楚地看到體積小的胚珠發(fā)生敗育。其中部分敗育的胚珠在后期體積雖然有一定程度膨大，但仍不能形成可育的種子。值得注意的是，花后20 d，部分果實中的一些胚珠體積出現(xiàn)異常，它們比早期明顯敗育的胚珠體積大，但比正常胚珠體積小(圖4-G)。切片觀察發(fā)現(xiàn)，正常胚珠的胚囊內(nèi)胚乳與內(nèi)珠被毗鄰，胚乳游離核數(shù)量多且明顯(圖5-A)；而體積異常的胚珠，胚囊內(nèi)的胚及胚乳游離核與正常胚珠相比有退化趨勢(圖5-B)，說明花后20 d可能存在新一輪敗育。

不同發(fā)育時期大花黃牡丹正常胚珠的生長動態(tài)見圖6。

大花黃牡丹正常胚珠縱徑和橫徑的生長趨勢為慢-快-慢-快-慢，花后10～30 d及40～50 d出現(xiàn)2個生長高峰，成熟時生長逐漸平緩(圖6)。成熟期(花后90 d)種子縱橫徑比為1.281。

2.2.3 結(jié)果率 50個花枝開花數(shù)為215朵，收獲果實148個，結(jié)果率為68.84%。自然授粉后40～80 d可見果實枯萎(圖7-A、B)及結(jié)果枝枯萎(圖7-C、D)現(xiàn)象。

2.3 大花黃牡丹二次枝生長與果實發(fā)育的關(guān)系

各試驗組大花黃牡丹3年內(nèi)均有不能正常開花、雄蕊脫落或果實、結(jié)果枝枯萎等現(xiàn)象，各年結(jié)果率及結(jié)實差異較大，且相同年份不同處理的結(jié)果率及結(jié)實情況差異也較大(表3)。

圖7 大花黃牡丹自然授粉后枯萎果實(A、B)和結(jié)果枝(C、D)Fig.7 Withered fruits (A,B) and fruiting branches (C,D) of Paeonia ludlowii after being pollinated naturally

由表3可見，2019年，在A組大花黃牡丹中，每朵花的平均飽滿種子數(shù)和每個果實的平均結(jié)實率均以CYA1最高，CYA6最低?？梢奀YA1綜合表現(xiàn)最佳，且高于對照組(CK)。CYA2、CYA3和CYA4均僅保留了1個花蕾，但因花蕾位置不同，結(jié)實差異較大，其中CYA2每個果實的平均結(jié)實率僅次于CYA1，以CYA3最低。在B組中，除CYB1及CYB2外，其他處理組每個果實的平均結(jié)實率均高于CK，其中CYB6表現(xiàn)最佳，其次為CYB3。CYB2、CYB3、CYB4均僅保留1個花蕾，但以CYB3每個果實的平均結(jié)實率最高，CYB2最低。

表3 大花黃牡丹二次枝的田間控制試驗結(jié)果Table 3 Results of field control experiment of secondary branches of Paeonia ludlowii

表3(續(xù)) ContinuedTable 3

由表3還可見，2020年，大花黃牡丹結(jié)果率及結(jié)實率雖低于2019年，但結(jié)實率表現(xiàn)最佳的處理與2019年相同，即A組CYA1和B組CYB6，其每個果實的平均結(jié)實率均高于CK。CYA2、CYA3及CYA4的平均結(jié)實率從高到低依次為CYA3>CYA4>CYA2，均低于CK；CYB2、CYB3及CYB4每個果實的平均結(jié)實率則與2019年一樣，其中以CYB3最高，CYB2最低。

表3表明，2021年A組大花黃牡丹結(jié)實率以CYA1表現(xiàn)最佳，每個果實的平均結(jié)實率高于CK。僅保留1個花蕾的CYA2、CYA3和CYA4每個果實的平均結(jié)實率與前2年不同，依次為CYA4>CYA2>CYA3。B組所有處理每個果實的平均結(jié)實率均高于CK，其中CYB3最高，其次為CYB5，之后依次為CYB1、CYB6、CYB4；同前2年一樣，B組僅保留1個花蕾的所有處理中，CYB2每個果實的平均結(jié)實率最低，說明保留二次枝時，花枝最下方的側(cè)花結(jié)實能力在所有花朵中最弱。

2.4 大花黃牡丹胚珠敗育過程中生理生化指標的變化

2.4.1 可溶性糖和淀粉含量 觀察發(fā)現(xiàn)，花后13 d開始，大花黃牡丹胚胎敗育過程中正常胚珠與敗育胚珠明顯可辨。如圖8所示，花后12～14 d，正常胚珠中可溶性糖含量升高，而敗育胚珠中可溶性糖含量則先升高后降低，之后二者變化平緩?；ê?2～13 d，敗育胚珠中淀粉含量顯著低于其他時期，之后持續(xù)上升，20 d時達到最高；花后14 d，正常胚珠中的淀粉含量最高，之后迅速下降。這可能是因為13 d后正常胚珠體積持續(xù)增大，消耗能量多，而胚珠開始敗育后逐漸縮小，代謝趨緩，淀粉不再大量地轉(zhuǎn)化為可溶性糖，淀粉積累大于消耗，故其含量持續(xù)上升。

2.4.2 可溶性蛋白含量 圖9顯示，花后13～15 d，即當敗育胚珠明顯可辨時，大花黃牡丹正常胚珠的可溶性蛋白含量先降低后升高，而敗育胚珠的變化趨勢與之相反。敗育胚珠可溶性蛋白含量在花后13 d時最低，為(0.424±0.003) mg/g；14 d時升高，達到最大(1.218±0.003) mg/g，之后又急劇降低。正常胚珠可溶性蛋白含量在花后13 d最高，為(1.138±0.003) mg/g；14 d時下降達到最低值，為(0.532±0.023) mg/g；之后又緩慢升高。花后15～20 d正常胚珠與敗育胚珠的可溶性蛋白含量均上升。20～50 d敗育胚珠的可溶性蛋白含量先升高后大幅降低，正常胚珠則緩慢下降，但降幅不明顯。

圖8 大花黃牡丹果實胚珠中可溶性糖(A)和淀粉(B)含量變化Fig.8 Variation of soluble sugar (A) and starch (B) contents in ovules of Paeonia ludlowii

2.4.3 SOD活性 從圖10可見，花后13～50 d，大花黃牡丹正常胚珠和敗育胚珠的SOD活性變化幅度較大，但總體呈上升趨勢，且正常胚珠的SOD活性始終高于敗育胚珠。

圖9 大花黃牡丹果實內(nèi)胚珠中可溶性蛋白含量的變化 圖10 大花黃牡丹果實胚珠中SOD活性的變化Fig.9 Variation of soluble protein contents in ovules of Paeonia ludlowii Fig.10 Variation of SOD activity in ovules of Paeonia ludlowii

2.5 大花黃牡丹胚珠敗育過程中內(nèi)源激素含量的變化

如圖11所示，大花黃牡丹胚珠不同發(fā)育時期各類內(nèi)源激素含量變化較復(fù)雜。花后12 d，即正常胚珠與敗育胚珠形態(tài)明顯可辨前，胚珠中IAA含量較高，隨后急劇下降；13～20 d時，正常胚珠與敗育胚珠的IAA含量總體上均先升高后降低，且正常胚珠IAA含量總體高于敗育胚珠。花后20～50 d，正常胚珠的IAA 含量先降低后升高，敗育胚珠則連續(xù)升高，花后30～50 d明顯高于正常胚珠(圖11-A)。

花后12～13 d，正常胚珠中的ABA含量降低，敗育胚珠中的ABA含量升高。花后13～20 d，正常胚珠與敗育胚珠ABA含量變化一致，均呈現(xiàn)降低-升高-降低的趨勢，且敗育胚珠ABA含量始終高于正常胚珠。花后20 d，敗育胚珠的ABA含量繼續(xù)降低，并在30 d時達到最小值((35.101±0.196) ng/g)，50 d后急劇上升達到最大值((159.134±3.526) ng/g)；花后20～50 d，正常胚珠ABA含量持續(xù)升高，并在花后30～50 d高于敗育胚珠(圖11-B)。

花后12～13 d，正常胚珠中的GA3含量升高，敗育胚珠則降低?；ê?3～20 d，敗育胚珠GA3含量呈升高-降低-升高的趨勢，且總體低于正常胚珠；正常胚珠則在花后13 d后升高，并在花后14 d時達到最高值 ((13.568±0.161) ng/g)，之后持續(xù)降低?；ê?0～50 d，正常胚珠與敗育胚珠中的GA3含量變化趨勢一致，均呈先升高后降低趨勢，但敗育胚珠中的GA3含量一直高于正常胚珠(圖11-C)。

花后13～20 d，敗育胚珠的ZR含量先急劇下降，隨后上升；正常胚珠ZR含量則先上升后下降?；ê?0～50 d，正常胚珠與敗育胚珠中的ZR含量均呈先升高后降低趨勢，但正常胚珠的ZR含量變幅較敗育胚珠大(圖11-D)。

內(nèi)源激素的平衡關(guān)系分析(圖12)顯示，花后13～20 d，敗育胚珠中(GA3+IAA+ZR)/ABA、GA3/ABA和IAA/ABA小于正常胚珠，而ABA/(GA3+IAA)大于正常胚珠?；ê?0～50 d，以上指標的變化趨勢與之前相反。

圖11 大花黃牡丹果實胚珠中內(nèi)源激素含量的變化Fig.11 Variation of endogenous hormones contents in ovules of Paeonia ludlowii

圖12 大花黃牡丹果實胚珠中內(nèi)源激素比值的變化Fig.12 Variation of endogenous hormones ratios in ovules of Paeonia ludlowii

3 討論與結(jié)論

3.1 二次枝生長對胚珠敗育的影響

二次枝的生長發(fā)育是大花黃牡丹開花結(jié)實的基礎(chǔ)，是其年發(fā)育周期的重要階段。與牡丹組其他類群相比，大花黃牡丹種子成熟過程伴隨著二次枝發(fā)育。本研究的田間控制試驗結(jié)果反映了二次枝生長及頂芽分化與大花黃牡丹果實發(fā)育相互影響的特點。大花黃牡丹花期在5月中旬至6月中旬[3]。開花第1天即默認為果期開始，5月上旬至6月上旬也是二次枝生長高峰。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，花后1～12 d胚珠外觀無明顯差異，10～30 d為胚珠和果實生長高峰期，從花后13 d起，正常胚珠與敗育胚珠明顯可辨。大花黃牡丹的果實發(fā)育高峰期、二次枝發(fā)育高峰期及胚珠敗育時期重合。

早期人們認為授粉不足會導(dǎo)致敗育，但后來證明敗育的出現(xiàn)還涉及如資源限制等因素[27-29]。大花黃牡丹自交、異交結(jié)實，花粉活力和花粉胚珠比高[3]。授粉不足尚不足以導(dǎo)致大花黃牡丹胚珠敗育，特別是花后20 d可能發(fā)生的新一輪敗育與授粉不足關(guān)系不大。營養(yǎng)物質(zhì)的積累是二次枝生長和果實發(fā)育的限制因子之一。本研究中，保留花蕾、去除二次枝時結(jié)實率均較高，證明了二次枝生長與胚珠發(fā)育之間存在競爭關(guān)系，因此應(yīng)加強大花黃牡丹植株的營養(yǎng)管理，摘除部分二次枝，調(diào)控二次枝和果枝比例，以減少營養(yǎng)消耗從而增加結(jié)實。

一枝多花可延長牡丹的群體花期，側(cè)蕾雖可增加結(jié)果數(shù)量但消耗資源也多;二次枝和果實之間、同一枝上不同果實間資源的競爭與分配，都會降低結(jié)果率、結(jié)實率，甚至導(dǎo)致枝條枯萎等。本研究中，保留大花黃牡丹二次枝去除不同花蕾的處理組的結(jié)實率雖有差異，但大多高于對照組。結(jié)合開花次序，即3個花蕾的花枝上，先開的花朵結(jié)實時同一枝條上的其余花蕾才次第開放，花、果爭奪資源必然影響果實內(nèi)胚珠及后開花朵的發(fā)育和結(jié)實，這也是部分花蕾不開放或花后胚珠發(fā)育不良、敗育種子多的原因。因此，引種栽培時可適當去除部分過早或過晚開放的花蕾并追施營養(yǎng)物質(zhì)，以促進花果正常發(fā)育。

本研究中，大花黃牡丹的二次枝發(fā)育與果實之間及果實與果實之間的資源分配限制，導(dǎo)致結(jié)果率及結(jié)實率降低甚至枝條枯萎等，這與王芳等[30]的觀察結(jié)果相似。此外，本研究中，在保留花枝上所有腋芽及二次枝的情況下，僅保留花枝上最下方的花朵(即側(cè)花1)時結(jié)實率最低，說明最下方的花朵在同一花枝上結(jié)實能力最弱，雜交時可避免給此處花朵授粉或去除此花減少營養(yǎng)消耗，在保證結(jié)實率的同時促進二次枝發(fā)育。

3.2 胚珠敗育過程中的生理生化指標變化

在胚珠發(fā)育過程中，可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白、酶活性及內(nèi)源激素等的變化與細胞的生物功能和生理活動密切相關(guān)，糖類物質(zhì)在胚珠發(fā)育過程中除作為能量物質(zhì)外，還具有滲透調(diào)節(jié)、催化活性等作用[31-32]。研究發(fā)現(xiàn)，玉米敗育籽粒中可溶性糖和淀粉含量均低于正常籽粒，這是由于有機營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，幾乎所有營養(yǎng)都處于“下流”，導(dǎo)致玉米果穗頂部種子嚴重敗育[33]。本研究中，花后12～14 d，大花黃牡丹正常胚珠中可溶性糖含量持續(xù)升高，而敗育胚珠則先升高后降低，推測大花黃牡丹胚珠早期敗育(受精結(jié)束，胚、胚乳處于游離核時期)可能與胚珠內(nèi)可溶性糖含量降低有關(guān)。前人發(fā)現(xiàn)，除了有機物質(zhì)的積累，有機物質(zhì)合成能力弱也是引起玉米籽粒敗育的重要生理原因[33]。本研究中，花后13～14 d，大花黃牡丹敗育胚珠的淀粉含量雖有升高但仍較正常胚珠低，說明敗育胚珠中淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性糖的能力較正常胚珠弱，大花黃牡丹敗育胚珠合成淀粉的能力也比正常胚珠弱。

可溶性蛋白是胚胎發(fā)育的重要營養(yǎng)物質(zhì)，它能激活細胞代謝過程，促進胚胎的形態(tài)形成。大核荔枝品種的可溶性蛋白含量普遍高于焦核品種[18]。本研究中，大花黃牡丹花后13 d時，敗育胚珠可溶性蛋白含量降到最低，而此時正常胚珠的可溶性蛋白含量最高，表明胚珠內(nèi)可溶性蛋白含量降低也可能導(dǎo)致其敗育。

王飛等[19]認為，有核葡萄品種胚珠發(fā)育過程中有活性氧產(chǎn)生，但SOD活性持續(xù)升高迅速消除了活性氧的脅迫，而無核品種SOD活性雖升高但不能持續(xù)保持高水平，導(dǎo)致活性氧與膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)積累、可溶性蛋白和糖減少，最終導(dǎo)致無核葡萄胚的敗育。潘學(xué)軍等[34]也認為，胚珠中SOD活性增強可消除活性氧毒害，保護胚珠，而SOD活性一旦下降，活性氧產(chǎn)生與清除的平衡被破壞，從而使胚珠敗育。紀薇等[35]證實了SOD活性與無核葡萄胚敗育的關(guān)聯(lián)度最高。與前人研究結(jié)果相似，本研究中，花后13～50 d，大花黃牡丹正常胚珠的SOD活性始終高于敗育胚珠，表明SOD活性低可能是胚珠敗育的原因之一。

3.3 胚珠敗育過程中的內(nèi)源激素變化

有關(guān)植物胚珠發(fā)育與內(nèi)源激素關(guān)系的研究表明，胚珠發(fā)育期間內(nèi)源激素含量動態(tài)變化及它們之間的比例平衡與胚珠敗育有著密切的聯(lián)系。在雄性不育棗發(fā)育后期的敗育種子中，IAA、GA3和ABA虧缺，Z異常累積[36]。四倍體刺槐(Robiniapseudoacacia)花冠展開 15 d之后的敗育胚珠內(nèi)生長促進類內(nèi)源激素(GA3、IAA)含量低于正常胚珠，生長抑制類內(nèi)源激素(ABA)含量明顯高于正常胚珠[37]。本研究發(fā)現(xiàn)，花后13～20 d，大花黃牡丹正常胚珠中的IAA、GA3和ZR含量高于敗育胚珠，而ABA含量低于敗育胚珠，與上述研究結(jié)果相似?？芍蠡S牡丹胚珠內(nèi)低含量的IAA、GA3和ZR、高含量的ABA可能不利于胚珠的正常發(fā)育。

值得注意的是，Reed等[38]研究了玉米籽粒敗育前后內(nèi)源激素的變化與胚胎敗育的關(guān)系，認為單一的內(nèi)源激素變化不足以解釋敗育的成因。生長抑制類(CTK、ABA)和生長類激素(GA3、IAA)的比值與荔枝胚胎發(fā)育相關(guān)[17]。本研究中，花后13～20 d，大花黃牡丹正常胚珠中的(GA3+IAA+ZR)/ABA、GA3/ABA和IAA/ABA高于敗育胚珠，而ABA/(GA3+IAA)低于敗育胚珠。這與姜金仲等[37]、李建國等[39]、潘學(xué)軍等[21]和賀軍虎等[40]的研究結(jié)果相似，說明胚珠內(nèi)較低的(GA3+IAA+ZR)/ABA、GA3/ABA、IAA/ABA，以及較高的ABA/(GA3+IAA)不利于大花黃牡丹胚珠的正常發(fā)育。

本研究形態(tài)觀察結(jié)果表明，花后13 d出現(xiàn)了首輪敗育，20 d時又出現(xiàn)了部分胚珠體積異于正常胚珠，切片觀察發(fā)現(xiàn)這部分胚珠胚囊內(nèi)的胚和胚乳有退化趨勢，敗育胚珠的生理指標及內(nèi)源激素含量及比值也均在花后20 d時發(fā)生了明顯變化，說明大花黃牡丹花后20 d存在新一輪胚珠敗育，相關(guān)調(diào)控機理尚待進一步研究。

綜上所述，大花黃牡丹胚珠敗育的過程受多種因素影響，比如營養(yǎng)供應(yīng)不足、有機物合成能力弱及內(nèi)源激素代謝變化等都可能是引起胚珠敗育的生理原因。在發(fā)育早期，胚珠生理活性較低時，應(yīng)及時減少結(jié)果枝的營養(yǎng)消耗，如去除部分花蕾或二次枝。有研究表明，追肥有助于提高植株的結(jié)實率，Song等[41]給羊草追施氮肥使單株種子數(shù)增加40%；李嘉玨等[42]對引種栽培4年的大花黃牡丹植株每年人工噴施磷酸二氫鉀3次后，其自交結(jié)實率為66.7%。因此，在大花黃牡丹胚珠明顯敗育前(即花后12 d)，施用外源營養(yǎng)素可能有助于提高其結(jié)實率，但處理前需結(jié)合胚珠發(fā)育的狀態(tài)確定，如何提高胚珠早期發(fā)育的生理活性將是今后大花黃牡丹引種、繁殖，特別是提高雜交結(jié)實率的重要研究內(nèi)容。