金小霞，韋 滿，程 康，唐 明，張好強(qiáng)

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)在自然生態(tài)系統(tǒng)中廣泛分布，能夠與陸地上80%以上植物形成共生體[1]。AMF侵染植物后形成直徑僅有數(shù)微米的根外菌絲，根外菌絲高度分枝，有效增加了與土壤的接觸面積，促進(jìn)寄主植物對(duì)水分及氮、磷、鉀等礦質(zhì)元素的吸收[2-3]。

AMF不僅能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)，還在植物抵抗鉛脅迫方面發(fā)揮積極作用，主要通過(guò)調(diào)控植物吸收養(yǎng)分和提高生物量以增強(qiáng)植物對(duì)鉛脅迫的抗性。研究發(fā)現(xiàn)，接種AMF能夠顯著增加鉛處理宿主植物的株高和地徑，提高生物量[4]，增加葉綠素含量，提高光合效率[5]和營(yíng)養(yǎng)元素(磷)含量[6]。此外，AMF還能增強(qiáng)植物根系的鉛固定能力，提高根系鉛含量并限制鉛向地上部轉(zhuǎn)移[7]，同時(shí)改善根際微生物環(huán)境[8]，并通過(guò)根外菌絲分泌土壤酶[9]和提高球囊霉素含量[10]來(lái)降低土壤鉛毒害作用[11]。

異形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis，Ri)和摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae，F(xiàn)m)是土壤中常見(jiàn)的2種AMF，常用于比較不同AMF種類的功能差異[12]。研究表明，接種異形根孢囊霉主要可增加宿主植物光合速率[13]，降低植株丙二醛含量和提高抗氧化酶活性[14]，增強(qiáng)植株的抗氧化能力，促進(jìn)植株對(duì)鉀和磷元素的吸收[15-16]；接種摩西斗管囊霉則主要表現(xiàn)出更強(qiáng)的促生作用、水分利用效率[17]和根系定植能力[18]。

以往針對(duì)AMF調(diào)控宿主植物鉛吸收的盆栽試驗(yàn)中，植物根系與AMF根外菌絲生長(zhǎng)在一起，因此不能明確菌根植物根系鉛吸收是否來(lái)自AMF根外菌絲。因此，本研究以菌根植物蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)和非菌根植物油菜(Brassicanapus)為供試植物，利用三室(菌根室-施鉛室-非菌根室)培養(yǎng)系統(tǒng)(僅AMF根外菌絲能夠穿透各分室間濾膜，鉛僅與AMF根外菌絲接觸)，當(dāng)AMF根外菌絲從菌根室生長(zhǎng)到非菌根室后在施鉛室進(jìn)行鉛處理，通過(guò)比較菌根植物與非菌根植物鉛含量差異以及2種AMF的作用差異，明確異形根孢囊霉和摩西斗管囊霉根外菌絲的鉛轉(zhuǎn)運(yùn)能力，為明確AMF根外菌絲的鉛轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物 蒺藜苜蓿A17(Medicagotruncatula)種子由柏林洪堡大學(xué)Philipp Franken教授饋贈(zèng)，油菜(Brassicanapus)種子購(gòu)于陜西省楊凌種子市場(chǎng)。蒺藜苜蓿種子用濃硫酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%～98%)處理10 min，無(wú)菌水沖洗干凈于4 ℃冰箱放置2 h，然后將種子均勻置于7 g/L水瓊脂培養(yǎng)基中，4 ℃暗培養(yǎng)4 d，25 ℃下暗培養(yǎng)1 d，25 ℃光照培養(yǎng)3 d催芽，種子萌發(fā)后于穴盤(pán)中育苗。油菜種子依次用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇和10 g/L NaClO溶液表面消毒，無(wú)菌水多次沖洗后置于放有濕潤(rùn)無(wú)菌濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中，25 ℃下光照培養(yǎng)4 d，待胚根長(zhǎng)出后于穴盤(pán)中育苗。

1.1.2 供試菌劑 摩西斗管囊霉(Fm)和異形根孢囊霉(Ri)均由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所提供。以河沙為基質(zhì)，以車前草(Plantagoasiatica)為宿主進(jìn)行擴(kuò)繁，供試菌劑包含孢子(孢子密度約20個(gè)/g)、菌絲、侵染根段。

1.1.3 供試基質(zhì) 培養(yǎng)基質(zhì)為過(guò)2 mm篩的河沙和蛭石混合物(河沙與蛭石體積比為1∶1)，121 ℃滅菌2 h后風(fēng)干備用。培養(yǎng)基質(zhì)速效氮、速效磷、速效鉀含量分別為11.25，2.58，25.08 mg/kg，鉛含量為6.27 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)利用三室培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)由3個(gè)大小相等(長(zhǎng)×寬×高為7 cm×7 cm×10 cm)的亞克力有機(jī)玻璃隔室組合而成，包括1個(gè)中心隔室(施鉛室)和2個(gè)側(cè)隔室(菌根室和非菌根室)。中心隔室兩邊留有5 cm直徑孔穴，2個(gè)側(cè)隔室一邊留有5 cm孔穴，將3個(gè)分室組合固定作為三室培養(yǎng)系統(tǒng)，具體結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 三室培養(yǎng)系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the three-chamber culture system

孔穴之間由38 μm濾布隔開(kāi)，允許AMF根外菌絲通過(guò)而植物根系無(wú)法通過(guò)，從而將植物根系與叢枝菌根真菌根外菌絲有效分離。

試驗(yàn)設(shè)AMF和鉛2個(gè)試驗(yàn)因素。其中菌根室種植蒺藜苜蓿，進(jìn)行AMF處理，包括接種Ri、Fm和未接種對(duì)照(CK)；中間隔室設(shè)置鉛處理，設(shè)置鉛 含量為0和800 mg/kg 2個(gè)處理；非菌根室種植油菜。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置6個(gè)處理組合，即CK、Ri、Fm、Pb、Ri×Pb、Fm×Pb。其中CK、Ri、Fm分別表示在菌根室設(shè)置不接種、接種異形根孢囊霉、接種摩西斗管囊霉處理基礎(chǔ)上，于施鉛室進(jìn)行0 mg/kg Pb2+處理；Pb、Ri×Pb、Fm×Pb分別表示在菌根室設(shè)置不接種、接種異形根孢囊霉、接種摩西斗管囊霉處理基礎(chǔ)上，于施鉛室進(jìn)行800 mg/kg Pb2+處理，每處理3次重復(fù)，取平均值。

菌根室裝280 g培養(yǎng)基質(zhì)，在5 cm深處接種20 g AMF菌劑，對(duì)照接種等體積滅菌沙，選取2株長(zhǎng)勢(shì)一致的蒺藜苜蓿幼苗移栽到菌根室；非菌根室裝300 g培養(yǎng)基質(zhì)，選取10株長(zhǎng)勢(shì)一致的油菜幼苗移栽到非菌根室；中間隔室裝300 g培養(yǎng)基質(zhì)。另外，2個(gè)AMF接種處理各多設(shè)3個(gè)重復(fù)(檢測(cè)組)，在菌根室和非菌根室都種植蒺藜苜蓿幼苗用以確認(rèn)AMF根外菌絲的生長(zhǎng)(通過(guò)測(cè)定菌根室和非菌根室植物根系A(chǔ)MF侵染率)。培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度2 000 lx，溫度22～28 ℃，相對(duì)濕度50%～75%。鉛處理前每2 d澆1次水(20 mL/室)，以保證幼苗的正常生長(zhǎng)；每3 d澆1次含1/10磷元素的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(20 mL/室)。幼苗移栽后培養(yǎng)8周，在檢測(cè)組菌根室和非菌根室蒺藜苜蓿根系均檢測(cè)到菌根定植后，在相應(yīng)的中間隔室(施鉛室)進(jìn)行鉛處理，通過(guò)注射器將20 mL 28 g/L Pb(NO3)2溶液注入培養(yǎng)基質(zhì)，使培養(yǎng)基質(zhì)鉛含量達(dá)到800 mg/kg，4周后分別收獲植株地上部和地下部，用于生理指標(biāo)測(cè)定。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 生物量 將蒺藜苜蓿和油菜地上部和根系分開(kāi)收獲，留取部分根系剪成1 cm長(zhǎng)根段用于測(cè)定菌根侵染率，剩余植株根系和地上部樣品經(jīng)105 ℃殺青30 min，70 ℃烘48 h至恒質(zhì)量后稱取干質(zhì)量。

1.3.2 侵染率 采用曲利苯藍(lán)染色-根段法[19]測(cè)定。隨機(jī)挑選30條完成脫色的根段制片鏡檢，將每條根的分級(jí)定義輸入“MYCOCALC”軟件，計(jì)算菌根侵染率、侵染根段強(qiáng)度、侵染根段叢枝豐度[20]，其具體計(jì)算公式如下：

菌根侵染率=(菌根侵染的根段數(shù)/檢測(cè)的根段總數(shù))×100%；

侵染根段強(qiáng)度=(根系的菌根侵染強(qiáng)度/菌根侵染率)×100%；

侵染根段叢枝豐度=(根系的叢枝豐度/菌根侵染率)×100%。

1.3.3 菌絲密度 取部分混合均勻的培養(yǎng)基質(zhì)樣品，采用真空泵微孔濾膜抽濾-網(wǎng)格交叉法[21]測(cè)定培養(yǎng)基質(zhì)中菌絲密度。

1.3.4 鉛含量 將植物地上部和根系樣品分別粉碎過(guò)孔徑為0.15 mm篩，用硝酸消解后采用火焰原子吸收法[22]測(cè)定地上部和根系鉛含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2020軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 25對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和多重比較(P<0.05)，使用Origin Pro 2021繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉛處理下接種AMF對(duì)植物生長(zhǎng)的影響

由圖2-A可知，與CK處理相比，Ri、Fm處理蒺藜苜?？偵锪糠謩e提高了43.55%和256.98%；與Pb處理相比，Ri×Pb和Fm×Pb處理蒺藜苜?？偵锪糠謩e提高了62.17%和210.83%。Fm×Pb處理蒺藜苜蓿地上部和根系生物量分別是Ri×Pb處理的1.69和3.17倍，表明接種Fm比接種Ri更能促進(jìn)蒺藜苜蓿的生長(zhǎng)。

A.蒺藜苜蓿；B.油菜。圖柱上標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同 A.Medicago truncatula;B.Brassica napus.Different lowercase letters indicate significant difference among treatments(P<0.05).The same below圖2 鉛脅迫下接種AMF對(duì)蒺藜苜蓿和油菜幼苗生物量的影響Fig.2 Effect of AMF inoculation on biomass of Medicago truncatula and Brassica napus seedlings under Pb treatment

由圖2-B可知，與CK處理相比，F(xiàn)m處理油菜根系生物量顯著下降了46.80%，地上部生物量下降了21.16%。與Fm處理相比，Ri處理油菜總生物量顯著升高87.45%。其他處理間油菜總生物量無(wú)顯著差異。

2.2 鉛處理下接種AMF對(duì)植物根系侵染率的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，非菌根植物油菜根系未被AMF侵染，菌根植物蒺藜苜蓿根系被AMF侵染形成菌根的情況如圖3所示。由圖3可知，未接種蒺藜苜蓿根系未被AMF侵染(圖3-A、D)，接種Fm和Ri處理的蒺藜苜蓿根系均被侵染,并形成根內(nèi)菌絲、孢子、泡囊(圖3-B、E)和叢枝(圖3-C、F)等典型叢枝菌根結(jié)構(gòu)。

A.CK處理；B.Ri處理；C.Fm處理；D.Pb處理；E.Ri×Pb處理；F.Fm×Pb處理 ih.根內(nèi)菌絲；a.叢枝；v.泡囊；s.孢子 A.CK treatment；B.Ri treatment；C.Fm treatment；D.Pb treatment；E.Ri×Pb treatment；F.Fm×Pb treatment ih.Intraradical hyphae;a.Arbuscule;v.Vesicle;s.Spore圖3 AMF侵染蒺藜苜蓿根系后主要菌根的結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of main mycorrhiza after AMF infection to M. truncatula roots

由表1可知，與Ri處理比，Ri×Pb處理蒺藜苜蓿菌根侵染率無(wú)顯著變化，侵染根段菌根侵染強(qiáng)度降低了25.93%，侵染根段叢枝豐度顯著增加了225.24%；與Fm處理比，F(xiàn)m×Pb處理蒺藜苜蓿菌根侵染率顯著降低了40.16%，侵染根段菌根侵染強(qiáng)度降低了42.42%，侵染根段叢枝豐度無(wú)顯著變化。Fm和Fm×Pb處理侵染根段叢枝豐度分別是Ri、Ri×Pb處理的8.75和2.51倍。表明同一鉛水平下2種AMF對(duì)蒺藜苜蓿根系的侵染能力存在顯著差異，F(xiàn)m對(duì)鉛處理更敏感，且主要是叢枝定殖根系。

表1 不同鉛水平下AMF對(duì)蒺藜苜蓿根系的侵染狀況Table 1 Infection of AMF on roots of M. truncatula under different Pb levels

2.3 鉛處理下接種AMF對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)中菌絲密度的影響

不同鉛水平處理下，三室培養(yǎng)系統(tǒng)中接種AMF后培養(yǎng)基質(zhì)中菌絲密度如圖4所示。由圖4可知，在未接種AMF的CK中未發(fā)現(xiàn)根外菌絲；根外菌絲在施鉛室和非菌根室中增殖，且這些隔室中未發(fā)現(xiàn)植物根系。與0 mg/kg鉛水平下接種Ri、Fm相比，800 mg/kg鉛水平下接種Ri、Fm菌根室菌絲密度分別顯著提高了231.57%和314.09%，施鉛室菌絲密度分別顯著降低了49.56%和21.09%。AMF根外菌絲可以延伸到非菌根室，但不同鉛水平下接種AMF對(duì)非菌根室菌絲密度無(wú)顯著影響。

A.菌根室；B.施鉛室；C.非菌根室。ND表示未檢測(cè)到菌絲 A.Mycorrhiza chamber;B.Pb application chamber;C.Non-mycorrhiza chamber.ND indicates that mycelium is not detected圖4 不同鉛水平下接種AMF對(duì)三室培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)基質(zhì)菌絲密度的影響Fig.4 Effect of AMF inoculation under different Pb levels on extraradical hyphae density of culture substrate in the three-chamber culture system

2.4 鉛處理下接種AMF對(duì)植物鉛含量的影響

鉛處理下接種AMF對(duì)菌根植物蒺藜苜蓿和非菌根植物油菜鉛含量的影響如圖5和圖6所示。

圖5 鉛處理下接種AMF對(duì)蒺藜苜蓿鉛含量的影響Fig.5 Effect of AMF inoculation on Pb content in M. truncatula under Pb treatment

圖6 鉛處理下接種AMF對(duì)油菜鉛含量的影響Fig.6 Effect of AMF inoculation on Pb content in B. napus under Pb treatment

由圖5可知，0 mg/kg鉛水平下，與CK處理相比，接種Ri、Fm 處理中AMF根外菌絲顯著促進(jìn)了鉛運(yùn)輸至蒺藜苜蓿地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。800 mg/kg鉛水平下，與CK處理相比，接種Ri和Fm其根外菌絲轉(zhuǎn)運(yùn)至蒺藜苜蓿地上部和根系的鉛含量顯著升高，分別是CK的3.60，8.45和7.45，217.87倍。

由圖6可知，800 mg/kg鉛水平下，與CK處理相比，接種Fm處理顯著促進(jìn)了根外菌絲吸收轉(zhuǎn)運(yùn)鉛至非菌根室油菜根系，其鉛含量是CK的62.15倍。因此，在鉛處理下，接種Ri、Fm能夠促進(jìn)根外菌絲對(duì)鉛的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，且接種Fm的促進(jìn)作用更顯著。

3 討 論

菌絲網(wǎng)絡(luò)能夠提高菌根植物的競(jìng)爭(zhēng)能力[23]，根外菌絲介導(dǎo)下AMF不利于臨近非菌根物種(尤其是十字花科植物)的生長(zhǎng)[24]。本研究中，與CK處理相比， Fm處理顯著提高了菌根室蒺藜苜蓿的生物量，降低了非菌根室油菜的生物量，表明其抑制了同系統(tǒng)下非菌根植物油菜的生長(zhǎng)。一方面是由于AMF能夠借助根外菌絲在植物根系與基質(zhì)之間建立物質(zhì)傳輸通道[25]，吸收礦質(zhì)養(yǎng)分供給寄主[26]；另一方面是根外菌絲能改變根際分泌物或菌絲相關(guān)細(xì)菌群落，進(jìn)而影響植物養(yǎng)分吸收[27]。

菌根侵染率反映了AMF在植物根內(nèi)的生長(zhǎng)狀況，關(guān)系到真菌與宿主之間的雙向營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸。本研究中，鉛處理顯著降低了Fm處理的菌根侵染率，這可能是根外菌絲接觸到鉛后，營(yíng)養(yǎng)吸收受到了抑制。叢枝是AMF與植物共生關(guān)系形成后二者物質(zhì)交換的主要場(chǎng)所[28]。本研究中，與0 mg/kg鉛水平相比，800 mg/kg鉛水平下Ri處理的侵染根段叢枝豐度顯著增加，這可能是鉛脅迫下AMF在植物根系內(nèi)的生存機(jī)制[29]。本研究中，無(wú)論鉛脅迫與否， Ri處理的侵染根段叢枝豐度顯著低于Fm處理，這可能是造成2種AMF處理對(duì)寄主植物生長(zhǎng)有明顯差異的主要原因。本研究中，與0 mg/kg鉛水平相比，800 mg/kg鉛水平下Ri、Fm處理顯著提高了菌根室培養(yǎng)基質(zhì)的菌絲密度，但降低了施鉛室培養(yǎng)基質(zhì)的菌絲密度，這可能是由于菌絲接觸鉛后的“逃避”策略，限制了菌絲的生長(zhǎng)，導(dǎo)致更多菌絲滯留在菌根室。

陳雪等[30]研究表明，不同AMF對(duì)重金屬的富集和轉(zhuǎn)運(yùn)能力不同，鉛脅迫下接種Fm的麥冬鉛含量高于接種Ri。本研究中，與0 mg/kg鉛水平相比，800 mg/kg鉛脅迫下，F(xiàn)m處理蒺藜苜蓿根系的鉛含量顯著高于接種Ri，可知利用根外菌絲對(duì)鉛的轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)修復(fù)植物，選擇寄主和AMF的組合具有重要意義。菌根植物常常將更多的鉛固定在根系，以保證地上部免受損害。本研究中，800 mg/kg鉛脅迫下，F(xiàn)m和Ri處理明顯增加了蒺藜苜蓿地上部和根系對(duì)鉛的吸收，尤其是根系對(duì)鉛的吸收，說(shuō)明接種AMF后植物根系對(duì)重金屬鉛有較強(qiáng)的固持作用，這與前人的研究結(jié)果[31-32]一致。此外，根外菌絲在接觸鉛后，將鉛向油菜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而增加了油菜根系對(duì)鉛的吸收，這可能是根外菌絲吸收轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬存在外排現(xiàn)象[33]。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)首次利用三室培養(yǎng)系統(tǒng)(菌根室-施鉛室-非菌根室)，研究了鉛脅迫下Ri、Fm 2種AMF根外菌絲對(duì)菌根植物蒺藜苜蓿(寄主)和非菌根植物油菜植物生長(zhǎng)及鉛富集的影響，結(jié)果表明，AMF根外菌絲能夠直接吸收土壤鉛并轉(zhuǎn)運(yùn)固持在寄主植物根系，還可借由“外排”效應(yīng)將鉛轉(zhuǎn)運(yùn)至非菌根植物根系，且與Ri相比，F(xiàn)m具有更強(qiáng)的促進(jìn)寄主生長(zhǎng)和鉛轉(zhuǎn)運(yùn)能力。