文/許 培 史文青 葛傳軍 劉 虎 卞從明[安徽安科生物工程（集團(tuán)）股份有限公司]

多肽是指由3～50 個(gè)α- 氨基酸縮合后以酰胺鍵連接的一類(lèi)化合物。分子量介于化藥與蛋白藥物之間，兼顧了化藥純度高、穩(wěn)定性好及低免疫原性的特點(diǎn)，也具有蛋白藥物特異性強(qiáng)、生物活性高等特點(diǎn)，在腫瘤、糖尿病、心血管疾病、感染等領(lǐng)域有顯著療效[1]。

多肽的制備方式包括生物組織提取、基因重組表達(dá)和化學(xué)合成法，其中化學(xué)合成法有液相合成和固相合成兩種。目前，全球上市的多肽藥物中90%以上是由化學(xué)合成制備，且固相合成法應(yīng)用最為普遍。固相合成法是采用α- 氨基被保護(hù)的Boc- 氨基酸或Fmoc- 氨基酸作為起始物料，將其C 端固定在樹(shù)脂上，通過(guò)一系列“縮合”和“脫保護(hù)”操作，直至合成目標(biāo)序列后再將樹(shù)脂與肽鏈裂解，獲得目標(biāo)肽粗品。由于Fomc- 氨基酸可在堿性條件下進(jìn)行脫保護(hù)，避免中間體反復(fù)經(jīng)強(qiáng)酸處理，可有效降低反應(yīng)副產(chǎn)物，是目前固相合成法中的最為常用的起始物料[2]。

QbD（質(zhì)量源于設(shè)計(jì)）重要理念之一是強(qiáng)調(diào)對(duì)關(guān)鍵原料的關(guān)鍵質(zhì)量屬性進(jìn)行評(píng)估和控制。目前各國(guó)藥監(jiān)部門(mén)或國(guó)際組織均對(duì)API 起始物料質(zhì)量控制提出要求[3]，如ICHQ11[4]中強(qiáng)調(diào)了起始物料的監(jiān)控及其雜質(zhì)譜研究的必要性，要求研究者充分了解并評(píng)估其在生產(chǎn)過(guò)程中的行為，建立其與API 雜質(zhì)的關(guān)系；EMA 于2014 年發(fā)布的《化學(xué)原料藥生產(chǎn)起始物料的選擇和論證要求的思考》[5]明確了起始物料的評(píng)估意見(jiàn)和要求，于2016 年發(fā)布的《活性物質(zhì)化學(xué)部分指南》[6]強(qiáng)調(diào)“應(yīng)討論起始物料中的所有種類(lèi)雜質(zhì)，如異構(gòu)體雜質(zhì)，在后續(xù)合成過(guò)程中保持不變或作為衍生物留存的可能性。適當(dāng)時(shí)，此類(lèi)雜質(zhì)應(yīng)當(dāng)在起始物料中通過(guò)驗(yàn)證的檢驗(yàn)方法控制在合適的限度”；FDA 也發(fā)布了多項(xiàng)指導(dǎo)原則[7-8]，明確了起始物料的選擇及控制要求。

芴甲氧羰基氨基酸（Fmoc-aminos）是固相合成多肽的關(guān)鍵起始物料，其雜質(zhì)與最終API 雜質(zhì)具有顯著的相關(guān)性，其中以對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)影響最為顯著。該雜質(zhì)參與縮合反應(yīng)，會(huì)產(chǎn)生與目標(biāo)物結(jié)構(gòu)、性質(zhì)極為接近的差向肽雜質(zhì)[9]。差向肽雜質(zhì)與API 通常難以分離，給后續(xù)提純工藝及產(chǎn)品質(zhì)量控制帶來(lái)挑戰(zhàn)，臨床應(yīng)用時(shí)也可能存在安全及有效性的風(fēng)險(xiǎn)。因此，需建立嚴(yán)格的質(zhì)控要求。

本文以固相合成多肽中較為常用的Fmoc-L-Leu-OH 為研究對(duì)象，建立了HPLC 檢測(cè)Fmoc-L-Leu-OH 對(duì)映異構(gòu)體Fmoc-D-Leu-OH 含量的方法，并開(kāi)展了系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證。

一、材料

1.主要材料和試劑

芴甲氧羰基-L- 亮氨酸（Fmoc-L-Leu-OH），芴甲氧羰基-D- 亮氨酸（Fmoc-D-Leu-OH），注射用水，正己烷，無(wú)水乙醇，異丙醇，三氟乙酸。

2.主要儀器設(shè)備

賽默飛U3000 高效液相色譜系統(tǒng)，紫外檢測(cè)器，電子天平。

二、方法與結(jié)果

1.試液配制

空白溶液：正己烷∶無(wú)水乙醇（55∶45）。

系統(tǒng)適用性溶液：取Fmoc-L-Leu-OH 對(duì)照品與Fmoc-D-Leu-OH 對(duì)照品適量，用空白溶液配制成Fmoc- L- Leu-OH、Fmoc-D-Leu-OH 濃度分別為2.0 mg/mL、10.0 μg/mL 的混合溶液。

Fmoc-Leu-OH 供試品溶液：取Fmoc-L-Leu-OH供試品，用空白溶液制成濃度為2.0 mg/mL 的溶液。

Fmoc-L-Leu-OH 對(duì)照品溶液：取Fmoc-L-Leu-OH對(duì)照品，用空白溶液制成濃度為2.0 mg/mL的溶液。

Fmoc-D-Leu-OH 對(duì)照品溶液：取Fmoc-D-Leu-OH 對(duì)照品，用空白溶液制成濃度為2.0 mg/mL 的溶液。

2.色譜條件

3.專(zhuān)屬性考察

分別取空白溶液、系統(tǒng)適用性溶液按前述色譜條件進(jìn)樣，考察方法專(zhuān)屬性。空白溶液在Fmoc-D-Leu-OH 色譜峰保留時(shí)間9.900 min 左右無(wú)吸收峰；系統(tǒng)適用性溶液中Fmoc-L-Leu-OH 色譜峰保留時(shí)間為9.900 min，其對(duì)映異構(gòu)體Fmoc-D-Leu-OH 色譜峰保留時(shí)間為14.297 min，二者之間分離度為6.38，分離度遠(yuǎn)大于2.0，表明方法專(zhuān)屬性良好。

4.檢測(cè)限及定量限

取Fmoc-D-Leu-OH 對(duì)照品溶液，用空白溶液逐級(jí)稀釋至適宜濃度，按前述色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，分別以信噪比為3∶1、10∶1 時(shí)注入儀器的量作為檢測(cè)限和定量限。Fmoc-D-Leu-OH 的檢測(cè)限、定量限分別為0.300 ng 和1.001 ng，即分別相當(dāng)于主成分的0.0015%、0.0050%，表明方法色譜靈敏度高。

5.線(xiàn)性范圍考察

取Fmoc-D-Leu-OH 對(duì)照品溶液，用空白溶液稀釋成系列濃度分別為0.1 μg/mL（定量限）、0.2μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0μg/mL 的溶液，按前述色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，確定線(xiàn)性范圍?；貧w方程為Y=0.5126X-0.0049，R2=1.0000，表明Fmoc-D-Leu-OH 在質(zhì)量濃度0.1 ～10.0 μg/mL 范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好。

6.準(zhǔn)確度（加樣回收）

取Fmoc-L-Leu-OH 供試品、Fmoc-D-Leu-OH 對(duì)照品，用空白溶液配制成Fmoc-L-Leu-OH 濃度為2.0 mg/mL、Fmoc-D-Leu-OH 質(zhì)量濃度分別約為16μg/mL、20 μg/mL、24 μg/mL 溶液各3 份（對(duì)映異構(gòu)體含量相當(dāng)于質(zhì)控限度的80%、100%、120%）；另取Fmoc-LLeu-OH 供試品溶液，按照前述色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，考察高、中、低3 個(gè)水平的加樣回收率。3 個(gè)不同水平的Fmoc-D-Leu-OH 的平均回收率（n=3）分別為100.85%、100.76%和100.89%；3 個(gè)水平總平均回收率（n=9）為100.83%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=9）為0.90%，表明方法準(zhǔn)確度高。

7.精密度（重復(fù)性）

取Fmoc-L-Leu-OH 供試品、Fmoc-D-Leu-OH 對(duì)照品，用空白溶液配制成Fmoc-L-Leu-OH 濃度為2.0 mg/mL、Fmoc-D-Leu-OH 濃度為20 μg/mL 溶液，按照前述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算Fmoc-D-Leu-OH色譜峰保留時(shí)間和面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6），結(jié)果分別為0.18%（n=6）和1.86%，說(shuō)明精密度良好。

8.供試品溶液穩(wěn)定性

取Fmoc-L-Leu-OH 供試品適量，精密稱(chēng)定，用空白溶液溶解并稀釋制成每1 mL 中約含2.0 mg 的供試品溶液，于室溫下分別放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h，按照前述色譜條件分別進(jìn)樣，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，供試品中對(duì)映異構(gòu)體Fmoc-D-Leu-OH 含量未發(fā)生變化，空白溶劑對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，表明供試品溶液于室溫存放12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

9.耐用性實(shí)驗(yàn)

改變流速。將色譜條件中的流速分別設(shè)定為0.9 mL/min、1.0 mL/min 和1.1 mL/min，其余色譜條件不變，分別進(jìn)樣，考察不同流速對(duì)測(cè)定供試品中對(duì)映異構(gòu)體含量的影響。結(jié)果顯示，同一供試品在3 種不同流速下Fmoc-D-Leu-OH 檢出結(jié)果一致。

改變柱溫。將色譜條件中的溫度分別設(shè)定為28℃、30 ℃和32 ℃，其余色譜條件不變，分別進(jìn)樣，考察不同溫度對(duì)測(cè)定供試品中對(duì)映異構(gòu)體含量的影響。結(jié)果顯示，同一供試品在3 種不同溫度下Fmoc-D-Leu-OH 檢出結(jié)果一致。

10. 供試品Fmoc-L-Leu-OH 中Fmoc-D-Leu-OH 含量測(cè)定結(jié)果

按照建立的方法對(duì)3 批Fmoc-L-Leu-OH 進(jìn)行測(cè)定，均未檢出Fmoc-D-Leu-OH，表明供試品中對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)含量均低于檢測(cè)限（0.0015%），遠(yuǎn)低于質(zhì)控限度（0.1%）。

三、結(jié)論

本文按自建的HPLC 方法，通過(guò)全面的方法學(xué)驗(yàn)證，建立了Fmoc-L-Leu-OH 中對(duì)映異構(gòu)體含量測(cè)定方法。驗(yàn)證結(jié)果表明：空白溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，各組分可完全分離；對(duì)映異構(gòu)體檢測(cè)限及定量限分別為主成分的0.0015%、0.0050%，本方法靈敏度良好；對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)含量在0.1～10.00 μg/mL（相當(dāng)于雜質(zhì)含量為0.005%～0.5%）范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好（R2=1.0000）；低、中、高3 個(gè)對(duì)映異構(gòu)體不同濃度的加樣回收率分別為100.85%、100.76%及100.89%；該色譜條件下樣品存放、柱溫、流速耐受性良好。該方法可用于Fmoc-LLeu-OH 中對(duì)映異構(gòu)體含量的測(cè)定和控制。