李德茂，孫慧杰，孟令雷，李德尚*

（1.邢臺市人民醫(yī)院，河北 054000；2.邢臺醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北 054000）

肺癌目前是世界上病死率最高的惡性腫瘤之一，在諸多類型的肺癌中，肺腺癌是目前最常見的組織學(xué)類型，同時，也是引發(fā)肺癌相關(guān)死亡的主要類型之一。由于診斷前易發(fā)生轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散，同時具有局部浸潤的高發(fā)生率，符合外科手術(shù)適應(yīng)條件的患者相對較少［1］。為提高肺腺癌患者的生存率，臨床需要有效的藥物和療法。一氧化氮（NO）已被證實與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展有關(guān)，NO還可以介導(dǎo)與腫瘤相關(guān)的多個過程，包括血管生成和細(xì)胞周期等。CS-NO在β-半乳糖酶存在下刺激響應(yīng)釋放NO，NO的釋放率高達(dá)40%［2］。本研究表明，CS-NO在β-半乳糖酶刺激下釋放的NO，可作為一種有效的外源性NO代償，在肺腺癌的治療中具有良好的潛力。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將H1975和HCC827細(xì)胞系細(xì)胞（國家實驗細(xì)胞資源共享平臺）分別置于RPMI1640和H-DMEM培養(yǎng)基中，添加10%胎牛血清和含5%CO2的濕潤空氣，在恒定37℃下培養(yǎng)。

1.2 藥物和抗體CS-NO（實驗室制備，白色粉末狀保存于冰箱，使用時用蒸餾水配制成濃度為5 mg/ml的溶液）；β-半乳糖苷酶（東恒華道生物科技有限責(zé)任公司）；抗Ki67抗體（1∶100稀釋，ab16667，Abcam plc，Cambridge，UK），抗caspase 3抗體（1∶100稀釋，ab4051，Abcam plc，Cambridge，UK），抗MMP9抗體（1∶1000稀釋，ab38898，Abcam plc，Cambridge，UK））。

1.3 克隆形成實驗 用5 mg/ml的多糖基殼聚糖（CS）單獨處理和CS-NO聯(lián)合處理對數(shù)生長期內(nèi)的H1975和HCC827細(xì)胞系細(xì)胞24 h，同時加入0.01 mg/ml β-半乳糖苷酶，H1975和HCC827細(xì)胞系細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細(xì)胞，之后放入兩倍胰酶體積的10%胎牛血清的培養(yǎng)液中稀釋，然后種植在6孔板上，密度為每孔600個細(xì)胞，置37℃、5% CO2的濕潤空氣環(huán)境中培養(yǎng)生長14 d，期間每隔3 d進(jìn)行換液并觀察細(xì)胞狀態(tài)。14 d后在室溫下每孔加入1 ml 4%多聚甲醇固定30 min，再用1 ml 0.2%結(jié)晶紫染色20 min，之后采用PBS洗滌2次，每次5 min，去除多余液體晾干后拍攝照片。

1.4 CCK-8實驗 將H1975和HCC827細(xì)胞系細(xì)胞按“1.3”項下方法制成懸浮液轉(zhuǎn)移至離心管離心，1 000 r/min，離心3～5 min，棄上清，用1 ml含血清培養(yǎng)基重懸。使用細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)細(xì)胞，對細(xì)胞懸液進(jìn)行稀釋，稀釋至50 000個/ml。取96孔板，每孔加入2 000個細(xì)胞，每組6個復(fù)孔。在37℃培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，吸出各孔培養(yǎng)基，分別加入5 mg/ml的CS和CS-NO，同時加入0.01 mg/ml β-半乳糖苷酶，再次培養(yǎng)24 h后吸出各孔培養(yǎng)基，加入含10%CCK-8的培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h，采用微板閱讀器在570 nm處測量光學(xué)密度（OD）。

1.5細(xì)胞凋亡測定 將5 mg/ml CS和0.01 mg/ml β-半乳糖苷酶單獨處理H1975和HCC827細(xì)胞24 h，與5 mg/ml CS-NO和0.01 mg/ml β-半乳糖苷酶聯(lián)合處理的H1975和HCC827細(xì)胞24 h后，1 000 r/min離心3～5 min，棄上清。加入500 μl稀釋的1×Annexin V Binding Buffer重懸，加入5 μl的Annexin V-FITC混勻后，避光室溫孵育15 min，上機(jī)前5 min再加入5 μl的碘化丙啶（PI）染色，然后用流式細(xì)胞儀（BD）分析細(xì)胞。

1.6 Transwell實驗Transwell過濾器的上表面涂有Matrigel基質(zhì)。將5 mg/ml CS和CS-NO和0.01 mg/ml β-半乳糖苷酶分別處理過24 h的細(xì)胞懸浮在150 μl無血清培養(yǎng)基中，然后將其放入培養(yǎng)箱中，將培養(yǎng)箱放入含有800 μl完整培養(yǎng)基的24孔板中。培養(yǎng)24 h后，取出過濾器，用棉簽小心去除上表面的基質(zhì)凝膠。用4%多聚甲醛固定Transwell過濾器底部的細(xì)胞25 min，用0.2%結(jié)晶紫染色20 min，然后拍照，再用10%乙酸提取染料，并用波長為570 nm的微孔板讀取器進(jìn)行測量。通過Transwell分析，測定經(jīng)CS-NO處理對細(xì)胞遷移和侵襲的影響。

1.7 小鼠腫瘤生長檢測 本研究的動物倫理委員會已批準(zhǔn)相關(guān)的小鼠實驗操作，采用5周齡，體重18～22 g的BALB/c雌性裸鼠［由BeijingVitalRiverLaboratory Animal Technology Co Ltd提供，實驗動物供應(yīng)商的生產(chǎn)許可證編號SCXK（京）2016-0002］。喂食小鼠鼠糧和水，在20℃和60%濕度的無菌環(huán)境下培養(yǎng)，并維持光照時間和黑暗時間均為12 h。為了檢測腫瘤生長，將HCC827細(xì)胞皮下注射到雌性無胸腺裸鼠的右側(cè)腋窩，每只小鼠注入用100 μl生理鹽水混合的5×106個細(xì)胞，所有小鼠均一次性瘤體內(nèi)注射給藥。在接種成功10 d腫瘤模型建成后給藥，CS-NO組瘤內(nèi)分別注射50 μl 5 mg/ml CS-NO和10 μl 0.01 mg/ml β-半乳糖苷酶；對照組瘤內(nèi)分別注射5 mg/ml CS和10 μl 0.01 mg/ml β-半乳糖苷酶，每組的樣本數(shù)均為4只。治療周期為29 d，給藥后每間隔3 d測量腫瘤體積。治療結(jié)束后處死小鼠，分離腫瘤，拍照，稱重并計算。

1.8 免疫組化 獲得小鼠肺腺癌瘤組織并進(jìn)行免疫染色。將肺腺癌瘤組織用10%的中性緩沖福爾馬林固定24 h后進(jìn)行石蠟包埋，之后將石蠟包埋的組織切片用二甲苯溶液浸泡10 min，再放入100%、95%、85%和75%乙醇中各5 min。將切片標(biāo)本在PBS緩沖液中洗滌2次，每次2 min，在檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)并用3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，將切片用2%牛絲氨酸白蛋白在PBS中浸泡20 min，并與第一抗體一起孵化，在4℃環(huán)境下過夜。

次日，將切片室溫放置1 h，用PBS緩沖液洗滌2次，每次2 min。之后，在室溫下滴加IgG二級抗體，靜置2 h。再用PBS緩沖液再次洗滌，滴加DAB染色液（用A液和B液預(yù)先配制），室溫下染色約5～15 s。用水沖洗掉表面染料，然后用蘇木精溶液染細(xì)胞核5～8 s，用水沖洗約2 min。最后用中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察。

本實驗主要研究小鼠腫瘤的陽性細(xì)胞相對百分比，即各組切片在相同大小的鏡下視野內(nèi)拍攝細(xì)胞圖片，分別記錄圖片內(nèi)陽性細(xì)胞個數(shù)。之后，使用較小數(shù)據(jù)除以較大數(shù)據(jù)，從而得出陽性細(xì)胞相對百分比，即：陽性細(xì)胞相對百分比=較小陽性細(xì)胞個數(shù)/較大陽性細(xì)胞個數(shù)×100%，同時默認(rèn)較大數(shù)據(jù)的陽性細(xì)胞相對百分比為100%。

1.9 統(tǒng)計分析 采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行計算分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)均料以±s表示，t檢驗用以顯示兩個樣本平均值之間存在顯著差異，P<0.05被認(rèn)為是有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 克隆形成實驗CS療法對HCC827和H1975細(xì)胞系細(xì)胞起到的生長抑制作用并不明顯，HCC827細(xì)胞系細(xì)胞克隆數(shù)量平均值為（146.80±1.03），H1975細(xì)胞系細(xì)胞克隆數(shù)量平均值為（152.30±1.93）；而CSNO療法應(yīng)用時，在以上兩種肺腺癌細(xì)胞系中可觀察到癌細(xì)胞生長顯著降低，HCC827細(xì)胞系細(xì)胞克隆數(shù)量平均值為（61.00±1.47），H1975細(xì)胞系細(xì)胞克隆數(shù)量平均值為（74.25±1.93），兩組的克隆形成結(jié)果存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。表明在采用CS-NO治療后，肺腺癌細(xì)胞的增殖能力受到抑制，即抗癌細(xì)胞增殖能力得到了明顯增強。見圖1-2。

圖1 CS組和CS-NO組細(xì)胞克隆數(shù)量

2.2 CCK-8實驗 與CS處理相比，CS-NO應(yīng)用在這些HCC827和H1975細(xì)胞系細(xì)胞中570 nm的OD值顯著降低了，CS處理組的HCC827和H1975細(xì)胞570 nm OD值分別為（0.955 0±0.014 4）與（0.952 5±0.018 9），而CS-NO組的HCC827和H1975細(xì)胞OD值分別為（0.607 5±0.008 5）與（0.605 0±0.018 5），兩組的OD值之間存在明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），表明CS-NO的應(yīng)用可以有效的抑制癌細(xì)胞的增殖。見圖3。

圖2 兩組對HCC827細(xì)胞和H1975細(xì)胞克隆數(shù)量的影響

圖3 兩組對HCC827細(xì)胞和H1975細(xì)胞OD值的影響

2.3 細(xì)胞凋亡測定 流式細(xì)胞術(shù)試驗結(jié)果見圖4。CS組處理的HCC827和H1975細(xì)胞系細(xì)胞的凋亡改變相對輕微，HCC827細(xì)胞凋亡率為5.44%，H1975細(xì)胞凋亡率為19.03%，然而，CS-NO治療組的凋亡細(xì)胞百分比顯著增加了，HCC827細(xì)胞凋亡率為31.60%，H1975細(xì)胞凋亡率為38.50%，兩組的凋亡率存在統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖5。以上試驗結(jié)果表明，CSNO治療對促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的凋亡起到了積極作用。

圖4 CS組和CS-NO組流式細(xì)胞術(shù)

圖5 兩組對HCC827細(xì)胞和H1975細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率影響

2.4 Transwell實驗Transwell試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CSNO的使用降低了肺腺癌細(xì)胞的侵襲性，使通過Matrigel基質(zhì)凝膠的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，見圖6。CS治療組的HCC827細(xì)胞通過數(shù)量平均值為（95.25±1.93），H1975細(xì)胞通過數(shù)量平均值為（112.80±3.04）；而使用CS-NO的HCC827細(xì)胞通過數(shù)量平均值為（25.25±1.89），H1975細(xì)胞通過數(shù)量平均值為（26.25±2.06），兩組數(shù)據(jù)存在統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖7。以上實驗結(jié)果表明，CS-NO治療是抑制肺腺癌細(xì)胞侵襲的有效方法。

圖6 兩組HCC827細(xì)胞和H1975細(xì)胞通過Matrigel基質(zhì)凝膠的細(xì)胞數(shù)量

圖7 兩組對HCC827細(xì)胞和H1975細(xì)胞通過基質(zhì)凝膠細(xì)胞數(shù)量的影響

2.5 小鼠腫瘤生長檢測 本研究利用無胸腺裸鼠設(shè)立了CS組和CS-NO組。裸鼠皮下注射HCC827細(xì)胞，在接種成功14 d后每間隔3 d測量腫瘤體積。結(jié)果顯示，采用CS-NO治療的HCC827細(xì)胞生成的腫瘤生長更慢，見圖8。而使用CS治療則不會明顯抑制腫瘤的生長，且在接種成功17 d后，兩組小鼠腫瘤體積的差異逐漸增大，CS組的腫瘤體積增長速率明顯高于CS-NO組。至第29日，CS治療組的平均腫瘤體積為（474.80±11.38）mm3，而CS-NO治療組的平均腫瘤體積為（245.80±3.35）mm3，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖9。該實驗結(jié)果表明，CS-NO治療可以明顯抑制HCC827腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長，降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力。

圖8 兩組小鼠腫瘤體積

圖9 兩組小鼠腫瘤體積與時間的關(guān)系

2.6 小鼠腫瘤免疫組化 腫瘤組織的免疫組化分析顯示，CS-NO組的Ki67陽性細(xì)胞相對百分比為（35.00±2.27）%，明顯低于CS組的（95.00±1.87）%，而Ki67陽性表明細(xì)胞增殖能力較強，所以由上可知，兩組癌細(xì)胞的增殖能力存在差異，CS-NO治療組的癌細(xì)胞增殖能力明顯弱于CS治療組，見圖10。此外，HE染色顯示，CS-NO組小鼠腫瘤組織中caspase-3陽性細(xì)胞的相對百分比為（94.25±1.49）%，明顯高于CS治療組的（47.50±1.19）%。而作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物，caspase-3的高表達(dá)也表明了CS-NO應(yīng)用可顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，見圖11。此外，與CS組相比，CS-NO組的MMP9陽性細(xì)胞相對百分比顯著降低，CS組MMP9陽性細(xì)胞相對百分比為（97.75±0.75）%，而CS-NO組的MMP9陽性細(xì)胞相對百分比為（20.00±1.87）%。因為MMP9常作為驗證腫瘤細(xì)胞侵襲性的標(biāo)志物，所以這也表明了CS-NO對于抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲性是有效的，見圖12。以上全部結(jié)果均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），且綜合上述免疫組化結(jié)果可知，CS-NO的應(yīng)用在抑制肺腺細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡與降低侵襲性的方面是具有較為明顯的效果的。

圖10 兩組小鼠腫瘤的Ki67陽性細(xì)胞相對百分比

圖11 兩組小鼠腫瘤的Caspase 3陽性細(xì)胞相對百分比

圖12 兩組小鼠腫瘤的MMP9陽性細(xì)胞相對百分比

3 討論

3.1 肺腺癌的治療背景與預(yù)后 肺癌是全球病死率最高的惡性腫瘤之一。美國每年約有234 000例肺癌新發(fā)病例被確診，占所有癌癥診斷的13%，而僅在2018年就有大約154 000名美國公民死于肺癌，約占美國所有癌癥死亡人數(shù)的25%［3］。而在意大利，預(yù)計每年大約會有41 000例新確診的肺癌病例［4］。雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于肺癌的治療已經(jīng)取得了顯著的臨床成效，治療策略在過去幾年中不斷發(fā)展，但是不幸的是由于效率低下，各類型肺癌患者的平均5年生存率也僅為19%。而作為引發(fā)肺癌相關(guān)死亡的主要病理類型之一，預(yù)計到2030年，肺腺癌將成為肺癌相關(guān)死亡的第二大原因［5］。而且對于肺腺癌而言，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)知曉并運用成熟的化療方案的治療效果仍然是較為有限的［6］，所以臨床需要新的治療途徑來提高肺腺癌患者的5年生存率，進(jìn)而試圖提高肺腺癌患者的生活質(zhì)量。

3.2 NO的抗腫瘤作用 一氧化氮（NO）是一種普遍存在于自然界中的水溶性氣體，其在生理和病理過程中起著至關(guān)重要的作用［7］，其在人體內(nèi)是由一氧化氮合酶（NOS）內(nèi)源性產(chǎn)生的，NOS是一種在不同類型細(xì)胞中均被認(rèn)定存在的酶，可以調(diào)節(jié)抗炎反應(yīng)［8］。NO可以誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧，從而具有抑制DNA合成的作用［9］。此外，其可以通過上調(diào)p53 mRNA的表達(dá)水平，激活caspase調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［10］。

NO已被證實與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展有關(guān)，參與了腫瘤發(fā)展的不同階段，是調(diào)節(jié)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的條件之一。與正常乳腺細(xì)胞相比，浸潤性乳腺癌細(xì)胞的NOS活性下降，而且NOS的表達(dá)量與乳腺癌的不良預(yù)后呈負(fù)相關(guān)［11］。而流行病學(xué)研究表明，NO體內(nèi)濃度等一系列風(fēng)險因素與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［12］。NO體內(nèi)濃度的下降導(dǎo)致宮頸組織中p53的表達(dá)水平降低，從而誘發(fā)宮頸癌［13］。同時，也有許多研究已經(jīng)證實NOS活性下降可能導(dǎo)致了食管癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移［14］。

3.3 CS-NO的藥理作用NO可以作為腫瘤治療的新方向之一，來提高化療的效率。而提高NO供體化合物的NO釋放效率則是開發(fā)NO釋放生物材料的另一個新挑戰(zhàn)［15］。以往的研究已經(jīng)提出了將NO供體與疏水性聚合物基質(zhì)結(jié)合起來的方法，然而，這些簡單的摻雜法往往會導(dǎo)致NO在局部區(qū)域內(nèi)的積累或聚集過多等情況的發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致了NO供體分子從基質(zhì)中快速擴(kuò)散和浸出，使NO的治療效率大打折扣。目前報道了一種具有NO釋放特性的多糖基生物材料（CS-NO），有研究表明CS-NO和當(dāng)前常規(guī)藥物組合相比的優(yōu)勢在于，其可以增強這些常規(guī)藥物的作用，如非甾體抗炎藥和他汀類藥物［14］。而且CS-NO在生理條件下具有化學(xué)穩(wěn)定性，其NO釋放行為完全由人體內(nèi)的酶來催化控制，所以人體內(nèi)的酶催化具有了開關(guān)作用，可按需釋放NO［2］。因此，通過CS-NO植入物來增加外源性NO的補償可能會顯示出良好的治療潛力。

3.4 CS-NO聯(lián)合治療的結(jié)果與意義 在此項研究中發(fā)現(xiàn)，CS-NO的應(yīng)用可顯著抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，抑制肺腺癌細(xì)胞的侵襲，并可抑制小鼠體內(nèi)肺腺癌腫瘤的生長。

克隆形成實驗表明，CS-NO應(yīng)用在HCC827和H1975兩種肺腺癌細(xì)胞系中可觀察到癌細(xì)胞數(shù)量增長效果顯著降低。且為了進(jìn)一步觀察癌細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行了CCK-8實驗，其結(jié)果顯示CS-NO應(yīng)用于這些細(xì)胞系細(xì)胞中可以顯著降低570 nm的OD值，表明CS-NO應(yīng)用后抗癌細(xì)胞增殖能力得到了增強。

細(xì)胞凋亡測定結(jié)果表明，CS-NO治療組的凋亡細(xì)胞百分比與CS組相比顯著增加，說明CS-NO治療可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的凋亡。同時，本研究進(jìn)行了Transwell實驗，借以研究CS-NO治療在肺腺癌細(xì)胞侵襲中的作用。Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，CS-NO的使用降低了通過Matrigel基質(zhì)凝膠的肺腺癌細(xì)胞的侵襲性，細(xì)胞數(shù)量和570 nm的OD值都顯著降低，表明CS-NO治療明顯降低了肺腺癌細(xì)胞的侵襲性。

小鼠腫瘤生長檢測結(jié)果說明，CS-NO組的腫瘤體積抑制效果比CS組顯著。而在免疫組化實驗中發(fā)現(xiàn)：CS-NO組的Ki67陽性細(xì)胞相對百分比明顯低于CS組，作為腫瘤細(xì)胞增殖能力的標(biāo)志物，Ki67陽性細(xì)胞相對百分比下降表明腫瘤細(xì)胞增殖能力相應(yīng)的降低；小鼠腫瘤組織中caspase-3陽性細(xì)胞的相對百分比高于CS組，而作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物，caspase-3的高表達(dá)也表明了CS-NO可顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡；CS-NO組的MMP9陽性細(xì)胞相對百分比顯著降低，表明腫瘤的侵襲能力也受到明顯抑制。這些發(fā)現(xiàn)表明CS-NO的應(yīng)用在抑制肺腺細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡方面是有效的。所以，CS-NO可以作為新的治療策略來提高肺癌患者生存率和生活質(zhì)量。

3.5 實驗的不足 本實驗中對于CS-NO抑制肺腺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡的具體機(jī)制目前尚未研究清楚。目前的研究結(jié)果表明CS-NO治療對caspase-3的表達(dá)起到了增強作用，結(jié)合文獻(xiàn)中［10，13］提示的NO可以通過上調(diào)p53的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的結(jié)論，故而推測CS-NO可能參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控，但如何共同調(diào)控癌細(xì)胞凋亡尚不清楚。本研究的研究表明，CS-NO治療在抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖和介導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞的凋亡中起到重要作用，但目前如何實現(xiàn)這些效果的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。