蘇來曼·哈力克 蔣晨昊

新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中藥(維藥)質(zhì)量控制重點實驗室,新疆 烏魯木齊 830054

西帕依固齦液合劑是由單味藥材沒食子經(jīng)提取制成的口腔抗感染國藥準(zhǔn)字號制劑，臨床上廣泛用于牙周炎、牙齦炎的治療，效果顯著[1-4]。本品具健齒固齦、清血止痛功效，可用于牙周疾病引起的牙齒酸軟、咀嚼無力、松動移位、牙齦出血、口舌生瘡、咽喉腫痛、口臭煙臭等癥。標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)-維吾爾藥分冊》(1998)[5]，標(biāo)準(zhǔn)號為WS3-BW-0122-98。原標(biāo)準(zhǔn)只有試管鑒別、薄層色譜鑒別和pH值測定項，未見質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究文獻報道。為了更好地控制產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量，修訂了性狀、沒食子酸的TLC鑒別，刪去了化學(xué)鑒別，增加了其主成分沒食子酸的HPLC含量測定，使質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可控性得到全面提高。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 1525 Binary HPLC Pump，2487 Daul Absorbence Detector, Waters 717 Autosampler，Empower色譜工作站，島津LC-20AT液相色譜儀及工作站，Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，定量毛細管(美國Drummond Scientific Company)，CAMMAG REPROSTAR3薄層色譜成像系統(tǒng)(瑞士CAMMAG)。Waters高效液相色譜儀(美國Waters公司)。

1.2 試藥 西帕依固齦液(批號：20130108，20130109,20130112,20130114,20130116,20130117,20130118,20130143,20130144, 20130203,20130205)；沒食子藥材陰性對照液，均由新疆新奇康藥業(yè)股份有限公司提供。沒食子藥材(批號：20110501,201108,20120925,20130612，分別購于新疆麥迪森藥業(yè)有限公司、新疆熱益罕維吾爾藥材公司、新疆新奇康藥業(yè)有限公司、和田安薩爾維吾爾藥材公司)。對照品：沒食子酸(批號：110831-200302供含量測定用，110831-200803含量為 90.3%)，購于中國食品藥品檢定研究院。沒食子對照藥材(批號：XJYJS-YC-201008，本院自制)。硅膠薄層板試劑(預(yù)制板)(中國青島海洋化工集團公司出品)，水為超純水，其它化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀描述 本品為淡黃色至淡棕色液體；氣微香，味澀、微甜。

2.2 薄層色譜鑒別 取本品直接作為供試品溶液。取沒食子酸對照品加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。另取沒食子對照藥材0.1g加甲醇20 mL,超聲處理20 min, 濾過，濾液濃縮至2 mL作為對照藥材溶液。照薄層色譜法《中國藥典》四部0502試驗，吸取供試品和對照藥材溶液各4μL,對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以二氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(5∶5∶1)為展開劑，展開，取出，揮干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。噴以1%三氯化鐵乙醇溶液，供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。如圖1所示。

A: 254 nm 紫外光燈 B：1%三氯化鐵乙醇溶液顯色

2.3 HPLC含量測定 西帕依固齦液由沒食子單味藥材經(jīng)提取制成。沒食子(Turkish galls)化學(xué)成分中含鞣質(zhì)(tannins)50%～70%、沒食子酸(gallic acid)2%～4%、間-雙沒食子酸(m-digallic acid)、沒食子酸甲酯(methyl gallate)、1，2，3，6-四-0-沒食子酰基-β-D-葡萄糖(1，2，3，6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose、1，2，3，4，6-五-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖(1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)、樹脂等成分[6]。沒食子酸含量測定方法報道中，彭燕等[7]用差示分光光度法測定西帕依固齦液中沒食子酸的含量，結(jié)果樣品含量為6.85～9.79 mg·mL-1，測得值偏高。司馬義江等[8]報道，HPLC法測定西帕依固齦液中沒食子酸含量為0.03489 mg·mL-1，含量明顯偏低。吳雪釵等[9]研究報道沒食子酸為弱極性物質(zhì)，在強氧化條件下降解迅速，不穩(wěn)定；當(dāng)pH值為7.0～10.0時，3 h 已降解完全，極不穩(wěn)定；而對強酸、強光、高溫較穩(wěn)定；當(dāng)pH值為2.0～6.0的條件下，即酸性環(huán)境中穩(wěn)定。本研究參考文獻方法，經(jīng)多次預(yù)試驗，采用梯度洗脫建立了西帕依固齦液中沒食子酸的HPLC含量測定方法。

2.3.1 對照品溶液的制備 取沒食子酸對照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加甲醇制成 15 μg·mL-1的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 西帕依固齦液為水溶液，其主成分沒食子酸易溶于水。分別精密量取樣品1 mL，分別加水、50%甲醇和甲醇稀釋至 100 mL，按上述方法考察其峰面積。結(jié)果用水和50%甲醇稀釋處理的樣品峰面積差異不大，甲醇稀釋液樣品峰面積略高，因水經(jīng)濟且環(huán)保，故選擇用水稀釋樣品。

2.3.3 陰性對照液的制備 按處方輔料比例及工藝制備缺沒食子的陰性對照液，并按上述“2.3.2”項下方法制備陰性對照液。

2.3.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm 5 μm)，以甲醇為流動相A，以0.1%磷酸為流動相B,按表1中的規(guī)定進行梯度洗脫；檢測波長273 nm。理論板數(shù)按沒食子酸峰計算應(yīng)不低于8000。西帕依固齦液樣品、陰性對照及沒食子酸對照品HPLC色譜圖如圖2～4所示。

圖2 西帕依固齦液樣品HPLC色譜圖

表1 流動相系統(tǒng)程序

2.3.5 線形關(guān)系考察 精密稱取沒食子酸對照品7.54 mg置10 mL量瓶中，加甲醇適量溶解并定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含沒食子酸0.754 mg的儲備液。精密吸取此儲備液適量加甲醇制成每 1 mL 含沒食子酸0.4 μg、2 μg、15 μg、20 μg、40 μg、80 μg和100 μg的系列濃度對照品溶液，分別進樣10 μL，以對照品峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對照品質(zhì)量(X，μg)為橫坐標(biāo)，進行線性回歸計算，得回歸方程為：Y=4×106X-7865.5，r=0.9991。結(jié)果表明，沒食子酸對照品在0.04～100 μg/mL 范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。

2.3.6 精密度試驗 取沒食子酸對照品溶液(16.42μg/mL), 重復(fù)進樣6次，每次10 μL，記錄沒食子酸的峰面積值，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果RSD=0.2%，顯示儀器精密度良好。

圖3 西帕依固齦液陰性對照HPLC色譜圖

圖4 沒食子酸對照品HPLC色譜圖

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，室溫下放置，每隔一定時間，進樣10 μL, 連續(xù)進樣6次依法測定沒食子酸峰面積值，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，24 h內(nèi)RSD為2.51%。結(jié)果表明，供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 重復(fù)性試驗 取同一供試品溶液6份，分別進樣10 μL,依法測定沒食子酸峰面積值，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果RSD為1.40%，方法的重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 精密量取同一供試品 0.5 mL 置100 mL量瓶中，同時制備6份。精密稱取沒食子酸對照品10.16 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，精密量取1 mL置 25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得(0.4064 mg·mL-1)。分別置供試品中精密加入每1 mL含沒食子酸0.4064 mg的對照品溶液2.0 mL，加水稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果沒食子酸平均回收率(n=6)為99.28%, RSD為1.21%。

2.3.10 樣品測定 分別精密量取11批樣品溶液各 1 mL， 按2.3.9項下方法測定，記錄HPLC圖譜，外標(biāo)法計算含量，結(jié)果沒食子酸含量在1.07～1.36 mg·mL-1之間,平均(1.17±0.134)mg·mL-1(n=11)。根據(jù)上述測定結(jié)果，以平均值1.17下浮20%其值為0.94，暫定西帕依固齦液含沒食子按沒食子酸(C27H30O16)計，應(yīng)不得少于0.90 mg/mL。測定結(jié)果見表2。

表2 西帕依固齦液中沒食子酸含量測定結(jié)果 (n=2)

3 討論

3.1 HPLC法流動相的選擇 西帕依固齦液為水溶液，其主成分沒食子酸易溶于水，樣品液直接加水稀釋成一定量測定簡便可行。流動相曾用《中國藥典》一部五倍子項下沒食子酸含量測定用的甲醇-0.1%磷酸(15∶85)，結(jié)果出峰時間較長且沒食子酸峰得不到基線分離，有雜峰干擾。改用甲醇-0.1%磷酸(6∶94),流速：1.0 mL/min ，柱溫：30℃，沒食子酸峰得到基線分離，但雜峰出盡需80 min。后經(jīng)多次改變梯度洗脫條件，確定流動相為：甲醇A-0.1%磷酸B，按文中梯度洗脫程序，時間縮短為30 min，分離效果滿意。

3.2 有害元素測定 照《中國藥典》2020年版四部通則2321鉛、鎘、砷、汞、銅測定法(電感耦合等離子質(zhì)譜法)測定了11批次供試品中的鉛、汞、銅、總砷、鎘含量，結(jié)果均未檢出或未超出相關(guān)規(guī)定。

3.3 農(nóng)藥殘留測定 照《中國藥典》2020年版四部通則2341農(nóng)藥殘留量測定法測定11批次樣品中的六六六、滴滴涕、林丹、七氯、艾氏劑含量及氯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、三氯殺螨醇含量，結(jié)果均未檢出。

3.4 原料沒食子中沒食子酸的含量測定 為了控制原料沒食子的質(zhì)量，采用前述制劑含量測定方法，對沒食子進行了含量測定。精密稱取沒食子藥材粉末(過3號篩)0.1 g，至25 mL棕色容量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理15 min，放置室溫，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。其余同西帕依固齦液的測定。測定4批次沒食子藥材樣品，結(jié)果按干燥品計含沒食子酸(C7H6O5)為1.52%～4.60%，平均為2.86%。

本文新建立的方法，根據(jù)11批次樣品性狀實際觀察，將原標(biāo)準(zhǔn)性狀鑒別描述“本品為淡棕色液體”修改為“本品為淡黃色至淡棕色液體”；刪除專屬性差的試管鑒別項；對原薄層色譜鑒別項因色譜斑點拖尾，將提取過程簡化為直接點樣，采用新展開劑系統(tǒng)，結(jié)果色譜斑點清晰穩(wěn)定；為控制制劑內(nèi)在質(zhì)量，新增主成分沒食子酸HPLC法含量測定，沒食子藥材中沒食子酸含量不低于1.50%，制劑中沒食子酸含量不低于0.90 mg/mL。整個質(zhì)控方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，使西帕依固齦液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)得到顯著提升。