穆寧 楊川艷 馬康 全玉蓮 王詩 賴穎 李飛 王與燁 陳圖南? 徐德剛 馮華

1) (陸軍軍醫(yī)大學(第三軍醫(yī)大學)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,重慶 400038)

2) (天津大學精密儀器與光電子工程學院,天津 300072)

太赫茲波(terahertz,THz)是位于微波和紅外之間介觀尺度波長的電磁波,因其低電離性和指紋性的特點,在生物醫(yī)學領域有著巨大的應用潛力,尤其是在腫瘤的術中定位定性診斷方面.而對于定位定性診斷需求最迫切的腫瘤為膠質(zhì)瘤,因其侵襲性和異質(zhì)性,切除后極易復發(fā)且對臨近腦區(qū)神經(jīng)功能有顯著影響,快速確定瘤體邊界以及腫瘤病理學特征,是開展膠質(zhì)瘤精準診療和臨床研究的重要前提.本文總結(jié)了膠質(zhì)瘤診斷的生物物理技術,梳理了太赫茲波這一新興技術在膠質(zhì)瘤診斷方面所取得的研究成果.進一步,基于膠質(zhì)瘤組織病理和分子病理整合診斷研究進展,提出不同分子分型腫瘤組織在太赫茲波段可能具有不同 “特異性蛋白組成”的太赫茲腫瘤亞型識別機制假說,結(jié)合腦組織生物學特點與體液中膠質(zhì)瘤標志物檢測潛力,全面設想了未來太赫茲波在膠質(zhì)瘤臨床診療中的應用模式和發(fā)展前景.

1 引言

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性實體瘤,惡性膠質(zhì)瘤具有高度的侵襲性和異質(zhì)性,在神經(jīng)功能豐富而重要結(jié)構(gòu)密集的大腦中可不斷生長,而被破壞的中樞神經(jīng)系統(tǒng)又難以實現(xiàn)結(jié)構(gòu)再生和功能重建,其后果是惡性膠質(zhì)瘤患者的身心殘疾率高、生存期短且生存質(zhì)量差[1].與絕大多數(shù)實體瘤治療策略類似,盡可能精準地切除瘤體是膠質(zhì)瘤目前得到有效控制的基礎,而精準手術的前提是精準的識別[2].目前,盡管現(xiàn)有的神經(jīng)腫瘤檢測技術和儀器較好地解決了術前腫瘤的定位問題,但對于術中診斷與病灶識別,特別是面對浸潤型神經(jīng)腫瘤的深度、邊界與分子分型精準識別,始終缺乏快捷而有效的技術手段.因此,發(fā)展快速定位和定性診斷技術為目前腫瘤研究的熱點之一.為了實現(xiàn)膠質(zhì)瘤的精準識別,多個領域?qū)＜揖鶎⑻掌澆ㄗV與成像列為了重要的候選方案.

太赫茲(terahertz,THz)波因其低電離、無標記、指紋性等特性廣泛應用于生物醫(yī)學研究[3,4].太赫茲時域光譜(terahertz time-domain spectroscopy,THz-TDS)可反映生物樣品的分子集體的非對稱性振動/轉(zhuǎn)動和極性基團振動/轉(zhuǎn)動引起的偶極矩的變化,獲得特異性介電參數(shù);同時在復雜生物組織檢測中,由于太赫茲波的單光子能量較低且對水吸收敏感,其光譜成像可以安全有效地反映不同生物組織成分結(jié)構(gòu)的宏觀整體差異.因此,近幾年太赫茲技術在腫瘤病灶區(qū)域定位及病理學定性快速檢測方面得到了大量應用研究[5-14].

本綜述主要圍繞太赫茲技術在膠質(zhì)瘤診斷的研究進展和展望,分為以下幾個部分: 1) 總結(jié)當前膠質(zhì)瘤診斷的生物物理技術及其局限性;2) 簡要回顧應用于生物醫(yī)學的太赫茲探測技術,以及基于太赫茲光譜成像技術在膠質(zhì)瘤診斷方面所取得的研究成果,進而提出不同分子分型腫瘤組織在太赫茲波段可能具有不同“特異性蛋白組成”的太赫茲腫瘤亞型識別機制假說;3) 結(jié)合膠質(zhì)瘤腦組織生物學特點和體液中膠質(zhì)瘤標志物,探討太赫茲波在膠質(zhì)瘤檢測中的臨床應用模式和前景.

2 膠質(zhì)瘤客觀診斷技術需求與現(xiàn)實局限

2.1 膠質(zhì)瘤疾病特性決定了其對“同步定位定性”的高度精準診斷需求

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)腫瘤,其發(fā)病率大約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的80%[15].即使采用標準化的治療,膠質(zhì)瘤患者的預后仍不容樂觀[1].由于腦膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長,當腫瘤毗鄰或累及神經(jīng)功能結(jié)構(gòu)時,即便應用手術顯微技術,也不能達到既安全切除腫瘤、又不損傷神經(jīng)結(jié)構(gòu)的理想狀態(tài).因此,實現(xiàn)膠質(zhì)瘤精準切除是當前神經(jīng)外科診治最基本的目標.這就要求術中實現(xiàn)膠質(zhì)瘤的“定位”及“定性”: 定位需要實現(xiàn)的是變腫瘤邊界的不可見為可見,定性需要實現(xiàn)腫瘤病理性質(zhì)的不可見為可見;實現(xiàn)了腫瘤位置和性質(zhì)的“可見”,就有可能以手術為起點,開展包括手術策略、綜合診療策略上的精準診療.

當前臨床腫瘤定性主要依賴于病理學方法.根據(jù)腫瘤組織的形態(tài)學特征(細胞性質(zhì)、核分裂、核異型、微血管增殖和壞死等)可將神經(jīng)膠質(zhì)瘤分為1—4 級[15,16];這種組織學分級是判斷和區(qū)分不同神經(jīng)膠質(zhì)瘤預后的傳統(tǒng)手段,也是確定治療方案的重要依據(jù).但在長期使用過程中,這種組織病理分型的不足也逐漸顯現(xiàn),首先這種分型主要依據(jù)膠質(zhì)瘤在傳統(tǒng)光學顯微鏡下的形態(tài)學表現(xiàn)基礎上再輔以免疫組化技術,更多的是依靠病理科醫(yī)師的主觀觀察,然而組織學觀察者的判讀可能存在差異[17];其次,膠質(zhì)瘤細胞存在多樣性,導致組織病理學診斷結(jié)果可能囊括不同的細胞亞群,而不同亞型的腫瘤細胞可能帶來顯著差異的疾病預后,僅僅依賴組織分型無法做到盡可能細致的判斷[2,15,18-20].2016 年,世界衛(wèi)生組織中樞神經(jīng)系統(tǒng)(World Health Organization-Central Nervous System,WHO-CNS)納入了異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)、地中海貧血/智力低下基因(Alpha Thalassemia/mental Retardation syndrome X-linked gene,ATRX)、染色體1p 和19q 雜合性缺失(lp/19q loss of heterozygosity,lp/19q LOH)等分子標志物,在腫瘤分類中結(jié)合腫瘤組織病理及其分子病理信息,使相關診斷水平有所提高.這標志著中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤診斷進入“整合”診斷時代[20,21](圖1).因此,快速提取腫瘤分子病理特征是膠質(zhì)瘤準確診斷和臨床研究的重要依據(jù),也是提高臨床治療效果的重要前提[16,22].

圖1 基于“組織病理”和“分子病理”聯(lián)合診斷標準 (a) 腫瘤細胞形態(tài)學特征;(b) 膠質(zhì)瘤分子分型Fig.1.Based on a combination of histopathology and molecular pathology: (a) Morphological characteristics of tumor cells;(b) molecular typing of gliomas.

腫瘤的定位主要依賴影像學方法.由于影像學“定位”和病理學“定性”無法完美結(jié)合,當前臨床上主要依賴影像學技術行手術前規(guī)劃,依靠可見光波段顯微鏡進行手術,當手術中腫瘤邊界區(qū)域難以抉擇時,往往根據(jù)術者經(jīng)驗判斷,先行切除少量臨界組織進行快速(15—60 min)術中病理檢測來獲得初步定性提示,再根據(jù)提示判斷是否已經(jīng)到達腫瘤邊界.即便如此“粗略”,由于缺乏“定性同時定位”的技術,該模式已然成為當前醫(yī)學領域最優(yōu)的選擇和應用最廣的方法.

在臨床治療和研究過程中,快速獲取膠質(zhì)瘤定位及定性信息,是開展膠質(zhì)瘤精準診療和臨床研究的重要前提.盡可能早地獲取腫瘤分子分型信息,將帶來一系列重要的臨床進展.1) 彌補術中快速病理檢測的局限: 在手術中,部分患者組織病理學未見某種特定腫瘤大體特征,但依據(jù)其分子特點,仍可做出診斷,輔助手術決策(如存在IDH 突變、1p/19q 共缺失,則高度提示少突膠質(zhì)細胞瘤的診斷結(jié)果);2) 輔助手術策略的制定: 例如,IDH 突變型膠質(zhì)瘤術后預后良好,在手術實行全切方案最佳,若術中快速獲取的這一結(jié)果,可供主刀醫(yī)師進行術中決策;3) 術中精準劃定腫瘤邊界: 膠質(zhì)瘤具有極強的侵襲性和異質(zhì)性,依據(jù)視覺判斷和影像導航難以實現(xiàn)精準的邊界識別,多切造成殘疾、少切極易復發(fā),術中快速病理,可以實現(xiàn)神經(jīng)醫(yī)生“定位同時定性”的術中病理學邊界劃定追求;4) 為術后綜合治療方案的制定提供更早、更全面的分子病理學依據(jù).

2.2 現(xiàn)有定位定性技術及其局限性

當前主流的膠質(zhì)瘤“定位定性”技術如圖2 所示,主要分為影像學技術與病理學技術、分子生物學技術等,表1 重點闡述這些技術的優(yōu)缺點.

表1 當前膠質(zhì)瘤臨床診斷方法Table 1. Current clinical diagnosis of glioma.

圖2 膠質(zhì)瘤診斷方法Fig.2.Diagnostic methods for glioma.

2.2.1 影像學技術

電子計算機斷層掃描(computed tomography,CT)[23,24]又稱X 射線電子計算機斷層掃描儀,分為平掃和增強掃描,具有高分辨率、無前后重疊、病灶細節(jié)清晰、分期準確、掃描時間短等諸多優(yōu)點.CT 可顯示顱內(nèi)占位性病變,能較清楚的對比分析術后滲血或積血,因此該技術可減少積血對膠質(zhì)瘤術后影像學診斷所受的干擾;可有效檢測腦組織血流動力學改變及腫瘤內(nèi)部微血管改變,對鑒別良惡性腫瘤及對腫瘤分級有較重要的意義;但是相較于磁共振(magnetic resonance imaging,MRI),其對軟組織分辨率低,同時成像參數(shù)少,可獲得的診斷信息有限,因此單獨應用CT 發(fā)生誤診或漏診的風險較大;CT 增強則需要注射造影劑,但部分患者對造影劑過敏;另外,CT 也具有一定的放射性損害,可能引起醫(yī)源性傷害.

正電子發(fā)射斷層成像—X 線計算機斷層成像儀(positron emission tomography-computed tomography,PET-CT)[25]是一種將PET 和CT 拼接在一起的診斷技術,CT 主要顯示病灶的形態(tài)結(jié)構(gòu)信息,PET 具有測定腫瘤代謝水平的能力,PETCT 掃描將兩者結(jié)合,提高了診斷的準確性.PETCT 在判斷膠質(zhì)瘤良惡性、殘留情況、以及鑒別腫瘤復發(fā)和放射性壞死具有一定的意義,其缺點主要有: 1) PET-CT 輻射較大(10—15 mSv/次),一部分是CT 檢查出現(xiàn)的X 射線,另一部分則是氟代脫氧葡萄糖(fludeoxyglucose,FDG)等示蹤劑造成的伽馬射線;2) 價格昂貴.

單光子排放計算斷層掃描(single photon emission computed tomography,SPECT)實際上是一種由CT 與核醫(yī)學示蹤原理相結(jié)合的影像技術.對判斷膠質(zhì)瘤惡性程度可提供一定的幫助,價格較便宜,輻射劑量也較少,但其空間分辨率及特異性不及PET-CT.

磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)[26,27]是膠質(zhì)瘤影像學診斷的金標準.以其優(yōu)良的軟組織分辨率在腦腫瘤檢查中發(fā)揮了十分重要的作用.在生物組織發(fā)生病變時,其含水量會發(fā)生相應的改變,磁共振可靈敏地探測出這種差異[28];相較于CT,MRI 具有較高的圖像分辨率,且MRI為多參數(shù)、多角度成像,清晰度和對比度高,偽影影響小,可實現(xiàn)腫瘤冠狀面、矢狀面、橫斷面等多方位成像,顯示腫瘤病灶及周圍組織、血管的關系,提高膠質(zhì)瘤檢出率及定位定性準確性.但是術區(qū)腦組織在術后會伴隨有水腫及積血等情況;受此干擾,MRI 影像較為混雜.同時MRI 診斷也存在一定客觀局限性: 1) 組織移動性;2) 如果患者存在金屬心臟瓣膜、金屬物體、迷走神經(jīng)刺激器、子彈彈片等,則無法進行MRI 檢查;3) 補牙使用的填充物和支撐物會影響頭顱MRI 成像的質(zhì)量;4) 幽閉恐懼癥、兒童等患者無法忍受密閉性MRI,須在鎮(zhèn)定劑作用下進行MRI 檢查.

除此之外,術中影像學診斷還發(fā)展了多光子顯微術[29,30]、以及基于5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)誘導的原卟啉IX (protoporphyrin IX)熒光光譜診斷成像技術[31,32].這些技術價格相對低廉,且可以有效識別高級別膠質(zhì)瘤,但是對低級別膠質(zhì)瘤不敏感.科學家們嘗試開發(fā)更多的新興技術,如從紫外到近紅外光譜范圍的光譜學[33-35]、拉曼光譜和成像[36]以及光聲成像[14]、太赫茲光譜成像等.

2.2.2 病理學技術

組織病理學診斷是最理想、最可靠的診斷依據(jù),是腫瘤定性診斷的金標準.通過病理檢測對疾病進行判定,為臨床治療提供可靠的科學依據(jù).目前常用方法主要有術中快速蘇木素-伊紅染色(hematoxylin and eosin staining,HE)切片和術后免疫組化.1) 術中冰凍病理HE: 由于膠質(zhì)瘤的異質(zhì)性,在術中病理檢查時需要考慮盡可能多的部位,進行快速HE 切片,根據(jù)細胞形態(tài)等特征進行判斷.盡管術中病理檢查可以快速(大約30 min)確定有無癌組織殘留,但也存在一定的局限: 冰凍病理切片的質(zhì)量與常規(guī)石蠟切片有一定差距,準確率只有90%,存在誤診和漏診的可能性,且只有經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)生才能夠進行冰凍病理診斷;冰凍切片取材十分局限,局部組織難以代表整個腫瘤的全貌,且膠質(zhì)瘤的侵襲性強,術中組織運動難以準確跟蹤[14],須考慮較多的檢查部位,不僅費時,而且加大了病理醫(yī)師的工作量,從而難以準確地選擇病理檢查部位;術中診斷沒有免疫組化等輔助手段,部分病變僅憑形態(tài)學特征并不能明確作出診斷.2) 免疫組化診斷: 通過對活檢或手術切除的腫瘤組織切片,結(jié)合相關抗體進行染色觀察;對于膠質(zhì)瘤而言,術后的免疫組化可進一步確定分子分型等信息,為臨床提供治療方案的選擇;但免疫組化技術具有抗體特異性及穩(wěn)定性不足、工作量大、病理結(jié)果滯后等局限性.

2.2.3 分子生物學技術

目前,實驗室分子生物學技術則主要有聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)、熒光原位雜交(fluorescencein situhybridization,FISH)、生物芯片、基因檢測及測序等.

1) 聚合酶鏈反應.實時熒光定量PCR 是現(xiàn)在最普遍的檢測技術,其操作簡單,結(jié)果可靠,在生物實驗中得到了廣泛應用.其原理是在目的基因區(qū)域設計引物和探針,當探針和序列結(jié)合時,DNA聚合酶將熒光淬滅基團切斷從而發(fā)出熒光,其假陽性低,成本也低.

2) 原位熒光雜交.該方法是最常用的原位檢測方式,能夠檢測如細胞、組織和小型生物體等不同水平樣本的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP).

3) 生物芯片.屬于微型生物化學分析系統(tǒng),能檢測不同時空條件下的基因變化;能顯示反應特征性的組織類型、發(fā)育階段和環(huán)境應答等.

4) 基因檢測及測序.近十年來,基因組學及基因測序技術被廣泛應用于臨床,并在個體化醫(yī)療中優(yōu)勢明顯.應用高通量測序技術(next generation sequencing,NGS)對腫瘤細胞基因組測序,并通過數(shù)據(jù)庫比對關聯(lián)腫瘤與特定基因,不僅有助于診斷分類,更有助于進一步深刻地理解各類型膠質(zhì)瘤的生物學信息,為研發(fā)新的抗腫瘤藥物、指導治療方案并對預后判斷提供強有力的依據(jù),最終為膠質(zhì)瘤患者制定最佳的個體化治療方案.Sanger 法測序是目前檢測腫瘤基因突變的金標準,靈敏度僅有20%左右,且基因檢測、焦磷酸測序檢測平臺準入成本高、經(jīng)驗及人才缺乏,對于大多數(shù)病患而言高昂的自費檢查難以承擔.

定位定性存在時空差異性也是上述診斷技術最大的術中應用缺陷.近年來,以太赫茲光譜成像、拉曼光譜成像為代表的無標記分子光譜檢測技術將電磁波作為激發(fā)媒介,光散射能量譜作為表征手段,通過對樣品中固有生物大分子的振動/轉(zhuǎn)動能級信息進行直接測量,實現(xiàn)特異性“指紋識別”表征;適用于腫瘤組織診斷.太赫茲波因其高空間分辨率和水敏感等特性,廣泛應用于膠質(zhì)瘤組織、細胞、特征性分子等的識別,實現(xiàn)膠質(zhì)瘤診斷影像學“定位”和病理學“定性”同步.同時,太赫茲技術在膠質(zhì)瘤術中診斷中還具有以下優(yōu)勢: 1) 太赫茲技術可解決術中組織移位問題,傳統(tǒng)的術中導航即基于定位系統(tǒng)引導下將探針引入腦內(nèi),可能會造成組織移位,而太赫茲技術有望突破這一限制;2) 太赫茲波具有無損、無標記等特征,因此它不受造影劑、光透明劑、時間窗口、熒光素酶的限制,可快速檢測不清楚的腫瘤邊界,為疾病預后提供完整的腫瘤切除.由此可見,太赫茲波有望成為以神經(jīng)腫瘤為代表的實體腫瘤術中“定位同時定性”識別的新型、快速、無標記診斷方法.

3 太赫茲探測技術在膠質(zhì)瘤診斷中的應用研究

太赫茲波因其安全、水敏感、指紋性、無標記等特點,廣泛應用于腫瘤診斷[3,4,7].擬通過以下兩個方面系統(tǒng)梳理太赫茲技術在膠質(zhì)瘤檢測中的應用: 一是檢測技術方面,分析當前最常應用于腫瘤檢測的太赫茲檢測模式,并對目前應用于腫瘤的相關研究進行了整理;二是檢測效果方面,將重點闡述太赫茲光譜成像在膠質(zhì)瘤診斷中的研究進展.

3.1 太赫茲光譜技術及其在腫瘤檢測中的應用

根據(jù)太赫茲源產(chǎn)生方式的不同,太赫茲光譜系統(tǒng)主要分為太赫茲時域光譜和太赫茲頻域光譜.其中太赫茲時域光譜系統(tǒng)在生物醫(yī)學領域應用最為廣泛,該系統(tǒng)主要由飛秒激光器、光電導探測器、測量模塊(透射式、反射式、衰減全反射)等裝置組成.其中最核心部分為飛秒激光器,它很大程度上決定了THz-TDS 的信噪比和動態(tài)范圍.根據(jù)太赫茲波與樣本作用機理的不同,太赫茲時域光譜系統(tǒng)可以分為透射、反射、衰減全反射三大類(圖3),具體特點描述見3.1.1 節(jié)和3.1.2 節(jié).在該系統(tǒng)中,飛秒激光器產(chǎn)生的激光脈沖經(jīng)過分束分成兩路,一路作為信號用于產(chǎn)生太赫茲波進而進行樣品探測,另一路作為參考用于信號光的探測.信號路的飛秒激光被聚焦到光電導天線產(chǎn)生太赫茲脈沖,太赫茲脈沖在光路中通過樣品并攜帶樣品的信息;參考路的飛秒激光經(jīng)過延遲線與攜帶樣品信息的太赫茲脈沖一起到達電光探測晶體碲化鋅(ZnTe),從而實現(xiàn)太赫茲波的探測.THz-TDS 技術相對于傳統(tǒng)的傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared,FTIR)技術有以下優(yōu)勢: 1) 基于相干探測技術,可以同時測得物質(zhì)的相位信息和強度信息,并得到樣品在太赫茲波段的介電響應信息;2) 太赫茲源的功率較高,可以在常溫下工作,信噪比和穩(wěn)定性高,同時其光譜的動態(tài)范圍較大,頻率分辨率高;3) 太赫茲波對水、蛋白質(zhì)等生物大分子十分敏感,且太赫茲波對許多生物大分子具有指紋譜特性.基于上述優(yōu)點,可以利用THz-TDS 技術實現(xiàn)對生物病變組織和細胞的檢測,該方法受到研究學者的廣泛關注.表2 整理了近10 年太赫茲光譜技術在腫瘤診斷中的應用.

表2 近10 年太赫茲技術在腫瘤診斷中的工作模式Table 2. Patterns of THz technique in tumor diagnosis over the last 10 years.

圖3 太赫茲光譜檢測技術 (a) 透射式太赫茲光譜系統(tǒng);(b) 反射式太赫茲光譜系統(tǒng);(c)衰減全反射太赫茲光譜系統(tǒng)Fig.3.Terahertz spectral detection technology: (a) Transmitted THz spectral system;(b) reflected THz spectral system;(c) attenuated total reflection THz spectral system.

3.1.1 透射式太赫茲光譜系統(tǒng)

對于低吸收的材料如高透明的固體等,太赫茲波穿透這些物質(zhì)后衰減很小,一般采用透射式的探測方法對其進行檢測[37].典型的透射式太赫茲時域系統(tǒng)的原理是: 激光器發(fā)出脈寬飛秒量級的激光脈沖經(jīng)過分光鏡后被分成兩束,分別為泵浦光和探測光;其中泵浦光用于產(chǎn)生太赫茲脈沖,然后經(jīng)過拋物面鏡及透鏡的作用聚焦到樣品表面,透過樣品的太赫茲波束被探測器收集,在光學延遲平移臺的調(diào)控下,和相干的探測光束一起聚焦在探測器上進行光電導探測,經(jīng)過鎖相放大器后讀出攜帶樣品信息的太赫茲時域波形.近10 年來,學者們先后用該系統(tǒng)對基底細胞癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌等組織進行檢測[38-45].

3.1.2 反射式和衰減全反射式太赫茲時域光譜

對于反射式太赫茲時域光譜,其檢測樣品主要為高吸收的材料如厚的固體材料和溶液等,由于太赫茲系統(tǒng)的功率和動態(tài)范圍有限,透射式方法檢測得到的結(jié)果很不理想,這種情況下可使用反射式的探測方法.反射式與透射式太赫茲系統(tǒng)的區(qū)別在于太赫茲波束傳播的光路不同.除此之外,當太赫茲波從光密介質(zhì)入射到光疏介質(zhì),且入射到樣品中的入射角大于臨界角時,也會發(fā)生衰減全反射,系統(tǒng)則變?yōu)樗p全反射測量.衰減全反射系統(tǒng)探測原理是: 當太赫茲波進入棱鏡內(nèi),在棱鏡-樣品面上發(fā)生全內(nèi)反射而產(chǎn)生倏逝波,界面上的倏逝波與樣品相互作用,反射到棱鏡出射面的光波攜帶了樣品信息,經(jīng)棱鏡-空氣界面折射后,水平射出到檢測器上;

此時,出射的太赫茲波束主要攜帶了樣品的相關信息,通過分析太赫茲波信號,可以獲得樣品的太赫茲物理化學性質(zhì).近10 年來,學者們先后通過優(yōu)化太赫茲反射系統(tǒng),檢測了肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌、皮膚病、膠質(zhì)瘤等[46-53],證明了該檢測系統(tǒng)在腫瘤診斷的應用價值及優(yōu)勢.

3.2 太赫茲波成像技術及其在腫瘤研究中的應用

隨著太赫茲波譜檢測技術的不斷發(fā)展,出現(xiàn)了各種原理和結(jié)構(gòu)的太赫茲成像裝置.根據(jù)太赫茲源的不同,太赫茲成像可以分為連續(xù)波成像[54]和脈沖成像[55];根據(jù)成像模式的不同,太赫茲成像可以分為透射式[56]、反射式、衰減全反射[57]等.

連續(xù)波太赫茲成像根據(jù)物體內(nèi)部缺陷或損傷邊緣對太赫茲光的散射效應,從而影響太赫茲波電磁場的強度分布.在檢測過程中,樣品放在太赫茲源的焦點處,將太赫茲源或樣品固定在X-Y二維平移臺上,通過計算機控制平移臺,實現(xiàn)太赫茲源相對樣品的移動.計算機采集樣品表面或金屬底板透射或反射回的強度信息,實現(xiàn)對樣品不同點的成像,獲得樣品的二維圖像.

脈沖式太赫茲成像則是在THz-TDS 的基礎上利用二維移動平臺控制樣品的移動,在每個位置得到的時域波形即為脈沖式太赫茲成像的像素信息.后期可以將時域波形或計算得到的折射率、吸收系數(shù)等參數(shù)作為像素信息對圖像進行重構(gòu).表2總結(jié)了近10 年太赫茲成像技術在腫瘤研究中的應用,實驗證明太赫茲成像能夠區(qū)分生物組織中的水分分布,有望于應用于腫瘤診斷成像[58-60].

在上述系列研究中,研究者主要從以下角度解釋太赫茲波識別腫瘤的內(nèi)在機理.1) 含水量差異:基于太赫茲波水敏感性特征,由于腫瘤代謝旺盛、生長迅速且具有較強的免疫原性,腫瘤區(qū)域往往伴有大量的血管生成和炎癥反應,使得腫瘤區(qū)域的含水量較高,水的折射率和吸收系數(shù)高于正常組織,可據(jù)此區(qū)分腫瘤與正常組織[92-94];2) 宏觀結(jié)構(gòu)差異[95]: 低級別的腫瘤新生毛細血管較少、代謝相對較慢,局部呈現(xiàn)相對較低的血流灌注狀態(tài);而高級別腫瘤新生血管較為豐富,且生長速度較快,易發(fā)生組織壞死與囊變,呈現(xiàn)不均勻灌注,太赫茲技術可以反映組織微循環(huán)狀態(tài),據(jù)此進一步區(qū)分不同惡性程度腫瘤;3) 介觀尺度差異: 癌細胞侵襲性生長,腫瘤區(qū)域的細胞核數(shù)量大于正常區(qū)域,從而導致更多的細胞,其細胞密度、結(jié)構(gòu)以及對應生物大分子含量與正常組織差異明顯[95];4) 微觀結(jié)構(gòu)差異: 即分子構(gòu)成差異,從物理表征來看,太赫茲波對腫瘤的表征,實際上是對其內(nèi)所含生物分子(主要是蛋白)集體振動、轉(zhuǎn)動模式差異的檢測,太赫茲波對腫瘤特征分子蛋白構(gòu)象、蛋白與蛋白相互作用及突變等敏感,證明了利用太赫茲光譜診斷腫瘤的可行性[96].

3.3 太赫茲光譜和成像技術在膠質(zhì)瘤診斷中的應用

研究者為了探索太赫茲技術在膠質(zhì)瘤診斷中的應用價值,大多數(shù)都是采用太赫茲光譜及成像技術對膠質(zhì)瘤組織進行檢測.隨著研究的進一步深入,也出現(xiàn)了利用太赫茲技術檢測膠質(zhì)瘤細胞和膠質(zhì)瘤特征性分子的研究,進一步拓展了太赫茲技術的應用范圍.我們總結(jié)了太赫茲技術在膠質(zhì)瘤不同物理尺度樣本檢測中的研究現(xiàn)狀,主要包括組織、細胞和特征性分子的檢測研究,圖4 展示了近10 年來太赫茲技術在膠質(zhì)瘤診斷研究領域的發(fā)文情況(圖4).當前基于太赫茲技術研究膠質(zhì)瘤的結(jié)果如表3 所示.

表3 當前基于太赫茲技術研究膠質(zhì)瘤的結(jié)果Table 3. Current results of glioma studies using the terahertz techniques.

圖4 近10 年太赫茲技術在膠質(zhì)瘤診斷研究中的發(fā)文情況Fig.4.Publication of THz technology in glioma diagnosis in recent 10 years.

3.3.1 膠質(zhì)瘤組織的太赫茲檢測

太赫茲技術作為一種“圖譜合一”的檢測方法,可在獲取樣本光譜信號的同時進行成像研究.典型的太赫茲成像系統(tǒng)產(chǎn)生的輻射波長范圍為30 μm—3 mm,所以太赫茲波不太容易在生物組織內(nèi)散射,且太赫茲波具有水敏感性,而膠質(zhì)瘤組織比周圍組織水濃度高,所以太赫茲技術在膠質(zhì)瘤診斷方面具有良好的前景.2011 年,韓國延世大學Oh 等[62]首次將太赫茲技術應用于膠質(zhì)瘤組織的檢測研究,他們采用反射式太赫茲脈沖成像系統(tǒng)(THz pulsed imaging,TPI)研究了新鮮離體大鼠腦膠質(zhì)瘤模型.結(jié)果顯示太赫茲波成像顯示的腫瘤區(qū)域與核磁檢測區(qū)域相吻合.進一步,他們發(fā)現(xiàn)大鼠腦灰質(zhì)和白質(zhì)的太赫茲反射參數(shù)存在差異,并推測這可能源于灰質(zhì)中髓鞘的含量較低.這項研究初步證明了太赫茲波對腦膠質(zhì)瘤識別的潛力,為后續(xù)腦膠質(zhì)瘤檢測研究奠定了基礎.為了進一步解釋太赫茲波生物組織成像機制,2014 年,Oh 等[69]再次利用TPI 技術進行腦膠質(zhì)瘤組織識別研究,結(jié)果驗證了太赫茲波技術可實現(xiàn)新鮮離體腦組織腫瘤邊界的清晰劃分,且可識別腦組織中的灰質(zhì)和白質(zhì)區(qū)域.另外,他們還實現(xiàn)了石蠟包埋腦組織中腫瘤區(qū)域的識別,通過與HE 染色結(jié)果對比,推測TPI 技術識別腫瘤主要源于該區(qū)域的高密度細胞.同年,Meng 等[42]利用太赫茲時域光譜系統(tǒng)檢測石蠟包埋腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織.結(jié)果顯示,與正常組織相比,石蠟包埋腦膠質(zhì)瘤具有更高的折射率、吸收系數(shù)和介電常數(shù);進一步分析了石蠟包埋腦膠質(zhì)瘤成像的最佳太赫茲參數(shù).

以往基于太赫茲技術進行的腦膠質(zhì)瘤研究證明正常和腫瘤組織的差異主要來源于含水量和細胞密度的差異,但是尚未進行定量的解釋.為了回答這一問題,2016 年,Yamaguchi 等[53]獲得了新鮮和石蠟大鼠腦組織的太赫茲波反射率光譜.通過定量分析,計算得出新鮮腦膠質(zhì)瘤組織中的含水量比正常組織增加了大約5%,腦膠質(zhì)瘤組織單位面積的細胞核密度比正常組織增加15%以上,這兩者的共同作用導致腫瘤區(qū)域的折射率高于正常組織.基于此結(jié)果,Yamaguchi 等[78]嘗試采用復折射率獲得鼠腦太赫茲圖像,探索使用太赫茲波檢測腦腫瘤的內(nèi)在機理.結(jié)果顯示,利用太赫茲檢測區(qū)域的復折射率結(jié)合主成分分析,可進行新鮮離體大鼠腦組織的腫瘤區(qū)域可視化.他們發(fā)現(xiàn)太赫茲成像中顯示的腫瘤區(qū)域大于染色圖像中,這主要與腫瘤病灶周圍存在的水腫區(qū)域有關.通常,為了改善缺氧和營養(yǎng)物質(zhì)的微環(huán)境,腫瘤組織的新生血管增加,進一步導致了該區(qū)域含水量增大.另外,細胞代謝的病理變化也將導致腫瘤區(qū)域周圍出現(xiàn)水腫,此變化僅影響水腫組織區(qū)域的含水量,對細胞密度沒有影響.Kucheryavenko 等[91]研究了腦組織區(qū)域結(jié)構(gòu)及膠質(zhì)瘤異質(zhì)特性的太赫茲光學特性.發(fā)現(xiàn)正常組織和腫瘤組織間存在差異,且腦組織中有異質(zhì)特征,這可能源于白質(zhì)和灰質(zhì)的不同反應、不同神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)的存在以及壞死碎片和出血等.在術中診斷過程中,這種異質(zhì)性可能會導致神經(jīng)腫瘤邊緣描繪的復雜化.

為了分析太赫茲技術在術中神經(jīng)診斷方面的潛在價值,韓國延世大學Ji 等[79]在2016 年嘗試進行原位移植瘤及不同級別(WHO 2—4 級)離體人腦膠質(zhì)瘤組織的太赫茲成像研究.結(jié)果表明,太赫茲波識別腫瘤區(qū)域與組織病理顯示區(qū)域基本吻合,證實了太赫茲技術可用于神經(jīng)腫瘤宏觀區(qū)域識別和邊界檢測,且可有效地解決組織移位和標記等問題.隨后,Gavdush 等[87]采用太赫茲脈沖光譜技術研究了26 例不同WHO 級別明膠包埋的人腦膠質(zhì)瘤組織的太赫茲光學特征,結(jié)果顯示,不同病理級別組織間與瘤旁組織的太赫茲波折射率和吸收系數(shù)等參數(shù)具有顯著差異,且瘤周水腫區(qū)域與腫瘤具有類似的太赫茲響應.這客觀地揭示了太赫茲技術在不同WHO 級別人腦膠質(zhì)瘤手術診斷中的優(yōu)勢.基于太赫茲波腫瘤診斷的迅速發(fā)展,太赫茲波與腫瘤組織相互作用的物理模型也逐漸得到關注.基于此,Gavdush 等[90]用雙德拜(double Debye,DD)模型和雙過阻尼振子(double overdamped oscillator,DO)分析不同分級膠質(zhì)瘤組織和瘤旁的太赫茲介電響應常數(shù).這兩個模型均可以準確地再現(xiàn)太赫茲范圍內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤響應,證實DD 模型和DO 模型可被用于參數(shù)化腦組織在太赫茲頻率下介電響應分析.2019 年,Wu 等[58]基于反射式連續(xù)太赫茲波成像系統(tǒng),研究了新鮮離體和在體小鼠腦膠質(zhì)瘤模型.結(jié)果顯示,采用頻率為2.52 THz的太赫茲波反射成像系統(tǒng)可實現(xiàn)在體和新鮮離體腦組織的腫瘤區(qū)域識別,且太赫茲波成像與磁共振、HE 圖像中顯示的腫瘤區(qū)域具有良好的相關性;通過太赫茲時域光譜儀檢測發(fā)現(xiàn),在0.6—2.8 THz范圍內(nèi),腦膠質(zhì)瘤與正常腦組織的太赫茲光譜差異較大,其中腦膠質(zhì)瘤的折射率和吸收系數(shù)較正常組織高,且在高頻范圍內(nèi)差異較大.這些結(jié)果表明,太赫茲成像技術作為術中無標記診斷腦膠質(zhì)瘤的替代方法具有巨大的潛力.并且解釋了小鼠正常和腫瘤腦組織的區(qū)別在于腫瘤組織中水分含量的增加,主要是由于新血管、壞死碎片的體液和細胞密度變化引起的.證實了單點掃描太赫茲成像技術可通過檢測膠質(zhì)瘤細胞特征識別腫瘤邊界,為臨床應用檢測腦膠質(zhì)瘤疾病提供了一種新的腫瘤檢測方法.為了提高太赫茲波在膠質(zhì)瘤成像中的分辨率,Wu等[59]在2020 年報道了水平掃描連續(xù)波太赫茲ATR成像系統(tǒng).通過優(yōu)化ATR 棱鏡,使得成像面積達到與棱鏡成像面一樣大,其不僅可避免二次反射的影響,且系統(tǒng)在水平和垂直方向上的成像分辨率可分別達400 μm 和450 μm.通過采用高折射率材料的全反射棱鏡和較大的太赫茲波入射角,有助于更小尺寸腫瘤組織的識別.此外,通過該成像系統(tǒng)可以清晰區(qū)分大小不同的膠質(zhì)瘤區(qū)域.且太赫茲圖像顯示的腫瘤區(qū)域的體積、位置與肉眼及HE 染色圖像的宏觀顯示相似.同年,該團隊Wang 等[89]針對連續(xù)波太赫茲圖像提出了一種混合ROI 分割方法.該方法結(jié)合了塊匹配3D 去噪、模糊c-means聚類、形態(tài)學操作和canny 邊緣檢測,實現(xiàn)連續(xù)太赫茲圖像的ROI 高效識別.結(jié)果顯示使用這種混合ROI 分割方法能夠精確分割腫瘤區(qū)域,準確度、靈敏度和特異性分別為95.6%,84.5% 和97.7%.

3.3.2 膠質(zhì)瘤細胞的太赫茲波檢測

與膠質(zhì)瘤組織波譜成像研究相比,太赫茲技術檢測膠質(zhì)瘤細胞研究起步較晚.2019 年,Wang 等[97]對膠質(zhì)瘤細胞及神經(jīng)細胞進行了太赫茲光譜檢測,提出了一種在細胞厚度未知情況下,結(jié)合單層和雙層ATR 模型來確定活細胞介電響應的方法.實驗結(jié)果表明,太赫茲介電響應特性與細胞數(shù)量、細胞內(nèi)液體和細胞結(jié)構(gòu)顯著相關.此外,膠質(zhì)瘤細胞(C6 和U87)與正常膠質(zhì)細胞相比具有不同的介電特性,這可能是太赫茲波識別膠質(zhì)瘤組織的原因之一.隨著膠質(zhì)瘤分子分型的提出,Zhang 等[98]提出了由切割線和裂環(huán)諧振器組成的超材料生物傳感器,在生物傳感器表面培養(yǎng)了兩種類型的膠質(zhì)瘤細胞(IDH 突變型和野生型).測量結(jié)果表明,在沒有抗體引入的情況下,通過觀察任何細胞濃度下EIT 共振頻率和幅度的變化,可以直接區(qū)分突變型和野生型膠質(zhì)瘤細胞.這為太赫茲波識別膠質(zhì)瘤分子分型開辟了新途徑.

3.3.3 膠質(zhì)瘤特征性分子的太赫茲波檢測

除此之外,研究者還對膠質(zhì)瘤特征性分子等進行了檢測.γ-氨基丁酸(GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),其構(gòu)象對選擇生物功能和信號傳遞過程至關重要.雖然這種神經(jīng)活性分子已經(jīng)被廣泛研究,但是其在太赫茲波段的構(gòu)象和分子間相互作用有關的振動特性尚未在實驗中確定.Cheng 等[99]應用0.5—18.0 THz 的寬帶THz-TDS系統(tǒng)來表征GABA 獨特的指紋信息.研究結(jié)果表明,GABA 在1.15 和1.39 THz 有明顯的集體振動.太赫茲波高頻下的吸收攜帶部分集體振動,但更多地反映了特定的局部振動信息,包括骨架變形和官能團的搖擺,這些與GABA 的構(gòu)象和靈活性密切相關.這項研究可能有助于理解神經(jīng)遞質(zhì)分子的構(gòu)象轉(zhuǎn)變和與太赫茲波的共振反應.L-谷氨酸(L-Glu)在膠質(zhì)瘤細胞中迅速積累,然后轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺[100].Ruggiero 等[101]測量了左旋谷氨酸的多晶型.結(jié)果表明,太赫茲光譜可以區(qū)分左旋谷氨酸構(gòu)象形式.IDH1 突變在膠質(zhì)瘤中很常見,可產(chǎn)生s2-羥基戊二酸二鈉鹽(2-hydroxyglutarate,2HG),其作為膠質(zhì)瘤的標志物,可用于研究腫瘤的發(fā)展階段,以及識別正常組織與癌組織的邊界.盡管磁共振波譜法(magnetic resonance spectroscopy,MRS)可對2HG 進行有效地檢測,但是檢測時間至少為20 min,且2HG(連續(xù)合成和分解)存在變異性,將導致2HG 的圖像檢測結(jié)果無法作為醫(yī)療外科診斷時的實時圖像.Chen 等[94]利用太赫茲時域光譜系統(tǒng)研究了2HG 同分異構(gòu)體的振動光譜,并利用密度泛函理論進一步區(qū)分了它們的物理性質(zhì).研究發(fā)現(xiàn)同分異構(gòu)體L-2HGDS 和D-2HGDS 具有不同的特征吸收峰(L-2HGDS: 0.769,1.337,1.456 和1.933 THz;D-2HGDS: 0.760,1.200,1.695 和2.217 THz).但是2-HG 和2HGDS 還是有區(qū)別的,酸基在二鈉鹽狀態(tài)下可能有不同的振動模式.異構(gòu)體之間的差異主要歸因于碳鏈內(nèi)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移.這些結(jié)果表明,太赫茲技術能夠準確、快速地識別2HG 的異構(gòu)體,對膠質(zhì)瘤的進一步研究和臨床手術具有重要意義.表皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor,EGFR)在膠質(zhì)瘤增殖中起重要作用,膠質(zhì)瘤組織中EGFR 的表達水平可為診斷和預后提供依據(jù).改進EGFR 檢測技術,實現(xiàn)更高的靈敏度和更快的速度,將有利于多種腫瘤的診斷.Liu 等[102]2021 年嘗試基于太赫茲技術結(jié)合金納米粒子(gold nanoparticles,GNPs)和EGFR 抗體修飾,實現(xiàn)了對EGFR 的增敏.該超材料生物傳感器還可以實現(xiàn)微小體積的EGFR 溶液檢測.因此,該技術可能應用于實現(xiàn)EGFR 相關腫瘤的快速準確檢測.

除此之外,研究者還先后對NAA、肌醇、肌酸等進行了檢測.腫瘤引起的神經(jīng)元丟失導致NAA濃度降低[103].且NAA 在1.466,1.695,1.979 和2.879 THz 處發(fā)現(xiàn)了4 個特征峰.肌醇/肌酸在星形膠質(zhì)細胞病相關的腦疾病具有顯著差異[104]: 例如,高級別間變性星形細胞瘤和膠質(zhì)母細胞瘤中,肌醇/肌酸比值較低,具體為(0.39±0.11),(0.025±0.06);反之,低級別星形細胞瘤患者的肌醇/肌酸較高,數(shù)值為(2.14±1.4)[105].Yang 等[106]測量了肌醇的太赫茲光譜,發(fā)現(xiàn)在1.00,1.46,1.58,1.85 和2.05 THz有五個特征峰.King 等[107]測量了肌酸的太赫茲光譜,發(fā)現(xiàn)在1.23 和1.97 THz 有兩個特征峰.

十年間,基于太赫茲技術的腦膠質(zhì)瘤研究不斷涌現(xiàn),主要包括: 1) 從正常與病灶組織鑒別,到不同惡性程度組織的識別;2) 從離體樣品檢測,到動物在體樣本檢測;3) 膠質(zhì)瘤細胞自身具有的或外來添加的特征性分子識別.這三方面的研究為太赫茲波腫瘤檢測的應用發(fā)展奠定了基礎,但是從檢測機制、結(jié)果一致性、生物對照單一及臨床價值等方面,太赫茲技術仍然難以達到輔助手術醫(yī)師或病理醫(yī)師進行診斷的效果,更鮮有關于參考分子病理學知識進行腦膠質(zhì)瘤研究的報道.

不同的膠質(zhì)瘤分子分型,意味著各型腫瘤細胞具有截然不同分子生物學特征,由于它們蛋白表達的差異性,從而發(fā)生不一樣的生化反應過程、顯現(xiàn)不同的疾病進展或復發(fā)特性、對同一治療手段產(chǎn)生不同的響應模式,最終產(chǎn)生了截然不同的治療方法.聚類具有“近似分子特征”的腫瘤細胞亞群,這些細胞亞群,才最有可能產(chǎn)生較為穩(wěn)定的太赫茲波物理表征結(jié)果,從而實現(xiàn)膠質(zhì)瘤合理精細的分子分型.

從物理表征原理上看,包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的腫瘤細胞,其尺寸一般介于亞微米到數(shù)個微米之間,在太赫茲光譜中一般不會表現(xiàn)出特征光譜結(jié)構(gòu).由多種細胞及其間質(zhì)構(gòu)成的腫瘤組織,更難以在太赫茲波譜中出現(xiàn)“吸收峰”等典型特征.太赫茲波對腫瘤的表征,實質(zhì)上是對其內(nèi)所含生物分子(主要是蛋白)集體振動、轉(zhuǎn)動模式差異的檢測.如果一類腫瘤細胞或者組織,具有某種相對穩(wěn)定的“特異性分子集合”,那么,這類腫瘤就有可能被太赫茲技術檢測出來.因此,我們提出不同分子分型腫瘤組織可能在太赫茲波段具有不同“特異性蛋白組成”的太赫茲腫瘤亞型識別機制假說.

在我國太赫茲波膠質(zhì)瘤研究進展中,最早由天津大學姚建銓院士團隊發(fā)起,帶動了多家研究機構(gòu)的跨學科團隊參與研究,該研究團隊的膠質(zhì)瘤系列研究是目前國際上最為豐富和前沿的[58-60,89,97].2021 年初,上海理工大學專家和俄羅斯科學院聯(lián)合發(fā)表了針對膠質(zhì)瘤分子標記物進行膠質(zhì)瘤檢測的研究綜述,總結(jié)和展望了針對膠質(zhì)瘤內(nèi)分子標記物進行特異性識別的太赫茲波譜識別方法,這代表了研究膠質(zhì)瘤病理分類的一個實用策略[108].近年來,常超研究員領導的跨學科研究團隊不斷推進太赫茲生物學領域研究深度[99,109-114],其創(chuàng)新研究成果對腫瘤診斷領域也具有重要理論啟發(fā)和技術借鑒價值.

4 太赫茲技術在膠質(zhì)瘤診斷應用模式展望

基于上述研究進展可知,研究人員利用太赫茲波譜差異性可初步實現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織、細胞、特征性分子等樣本的識別.為促進太赫茲診斷技術的臨床應用,推進臨床診療技術水平的提高,結(jié)合太赫茲技術特點,進一步提出太赫茲技術在膠質(zhì)瘤整個診療過程中的潛在應用方式.

4.1 太赫茲技術在膠質(zhì)瘤術前診治中的應用

快速準確地檢測體液(血液及腦脊液等)中分離的循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTCs)、細胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)、分子標志物、代謝物、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)和微小RNA(microRNAs,miRNA)等遺傳腫瘤材料[115-118],可實現(xiàn)膠質(zhì)瘤早期病理診斷.Kumar 等[119]提出了一種高靈敏度、低約束損耗的SC-PCF 傳感器,可基于太赫茲技術高效檢測血細胞.CTCs 是腫瘤細胞從原發(fā)性腫瘤中脫散并進入人外周血循環(huán),可用于診斷癌癥和監(jiān)測癌癥的狀態(tài)[120,121].目前通過FDA 認證的CTCs 檢測方法為細胞搜索系統(tǒng).但該方法的陽性率低,而且現(xiàn)有的所有CTCs 檢測方法都無法判定檢測到的細胞是存活還是凋亡的,而只有功能細胞才能夠促成轉(zhuǎn)移灶的形成.Zhu 等[122]提出了三維超材料設計將其集成到微流體芯片中,利用這種相似性與具有物理結(jié)構(gòu)的紅細胞(red blood cell,RBC)分離CTC,并用太赫茲光譜檢測CTCs,實現(xiàn)了CSCs 的分離和鑒定.腫瘤細胞釋放也會釋放ctDNA,miRNA等到體液中,并在體液中表達穩(wěn)定.目前這兩種遺傳資料主要基于PCR 技術進行跟蹤腫瘤突變模式的變化[116,118,123].楊柯等[124]構(gòu)建并優(yōu)化了一種集成超材料技術、納米材料技術和SDA 技術的太赫茲超材料納米芯片,獲取了其檢測microRNA-21的靈敏度、特異性和重復性等一系列重要方法學指標并進行了臨床樣本檢測.除了體液中的分離物,體液中一些蛋白質(zhì)同樣也參與了膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展,可作為膠質(zhì)瘤的診斷指標之一[115,125-129].在這些蛋白質(zhì)中,最具代表性的是血管內(nèi)皮生長因子和血管生成相關蛋白(FGF-B,IGFBP-2,EGF),細胞外基質(zhì)蛋白(TSP12,TNC,Cyr61,CCN1,OPN等),基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2,MMP-9,AEG-1),膠質(zhì)纖維酸性蛋白,巨噬細胞遷移抑制因子和功能相關的蛋白質(zhì)(DD-T,CD74,CD44,CXCR2,CXCR4)[130,131]、髓鞘堿性蛋白(MBP)[132]等,均為腦脊液或膠質(zhì)瘤的血液生物標志物.目前,膠質(zhì)瘤體液蛋白的檢測手段主要為質(zhì)譜等,曹燦等[133]基于太赫茲光譜技術實現(xiàn)了蛋白質(zhì)構(gòu)象識別及分子間的相互作用,研究發(fā)現(xiàn)太赫茲波可識別體液中的標志蛋白物.代謝產(chǎn)物譜與腫瘤中特定代謝途徑的激活密切相關,目前膠質(zhì)瘤血漿樣品篩選出224 種代謝產(chǎn)物[134],特別在高級別和低級別膠質(zhì)瘤,有五種代謝物(尿嘧啶、精氨酸、乳酸、胱胺酸和鳥氨酸)具有顯著差異,而且已經(jīng)觀察到與核苷酸(例如,嘧啶),氨基酸(例如,精氨酸、谷胱甘肽、丙氨酸)和碳水化合物(例如,糖酵解和丙酮酸)代謝有關途徑的顯著變化,這與腫瘤的特征發(fā)展一致[135].另外,燕芳等[136]通過對氨基酸官能團太赫茲振動模式研究,為太赫茲代謝物的診斷提供了可能.

除此之外,神經(jīng)膠質(zhì)瘤可通過細胞外囊泡、外泌體等與鄰近細胞進行信息交流,幾乎可以從所有體液中提取[116,137-140].據(jù)文獻報道,膠質(zhì)母細胞瘤EVs中MicroRNA-301a[141-143],核酸變化[144],miRNA-21[145],miRNA-1587[146]和Epha2[147]等顯著增加.太赫茲波可通過檢測EVS 中物質(zhì)成分進行膠質(zhì)瘤診斷.然而由于水敏感問題的存在,既往研究多局限在固相或干燥狀態(tài)下分子、細胞、組織等,為了降低水溶液對太赫茲波的強烈吸收,增強太赫茲信號,提高檢測的精度和靈敏度,因此可針對液相環(huán)境的傳感器芯片方向設計,或者采用分子動力學等構(gòu)建生物分子溶液檢測模型[148].Zhang 等[149]設計了一種新型的微流體多通道超材料生物傳感器(multi-microfluidic-channel metamaterial biosensor,MMCMMB).多通道主要設置在超材料強電場增強區(qū)域,大大減少了液量,增強了傳感目標與太赫茲波的相互作用,從而提高了靈敏度.通過異丙醇-水混合物和牛血清白蛋白溶液的傳感結(jié)果證明了該設計的有效性和在THz 生物傳感方面的巨大潛力.此設計具有靈敏度高、無標簽、成本低、操作方便、液體量的優(yōu)點,可為液體基物質(zhì)的太赫茲無標記生物傳感提供了一條可靠的途徑[149].Zhou等[150]通過太赫茲石墨烯-超表面微流控平臺增強生物分子與太赫茲波的相互作用,從而提高靈敏度.為了驗證這一概念,采用了純微流控單元、超表面微流控單元和石墨烯微流控單元進行對比實驗,探索并驗證了微流控單元的傳感機理.證明了基于石墨烯-超表面THz 雜化微流控器件的精密傳感的高靈敏度[149].此外,研究者也采用分子動力學實現(xiàn)水溶液樣品檢測.例如: Sebastiani 等[151]基于對甘氨酸等氨基酸溶液進行THz 測量,通過abinitio 分子動力學模擬證實在315 cm 處的N-C-CO 開/關模式可作為敏感的、無標記的酰胺基局部質(zhì)子化探針.實驗證實了,由于質(zhì)子化引起的強度變化可以通過THz 時域(0—50 cm)和精確的THzft 光譜(50—400 cm)探測到,實現(xiàn)了太赫茲光譜在無標記方式下探測天然氨基酸在水中的電荷狀態(tài)[151].

4.2 太赫茲波譜與成像技術在膠質(zhì)瘤手術中的應用前景

除了術前的體液診斷,太赫茲波技術對于術中組織、細胞的診斷研究也是可靠的.術中實現(xiàn)膠質(zhì)瘤邊界從不可見變?yōu)榭梢?以及快速實時獲得腫瘤分子分型信息,有效指導術中腫瘤切除.

與正常細胞相比,癌細胞中有更多的自由水和較少的結(jié)合水.更重要的是,細胞水化程度隨著癌細胞的惡性程度而增加,表明細胞內(nèi)水合可能是致癌物中的主要因素,例如,增加水化可以促進細胞內(nèi)的呼吸,一定程度上可以增強用于使用營養(yǎng)素的癌細胞的競爭優(yōu)勢.Zhang 等[152]提供了一種非免疫生物傳感技術,即基于太赫茲范圍內(nèi)各向異性共振分裂環(huán)諧振器的等離子體生物傳感器成功地實現(xiàn)了癌細胞的無抗體識別,證明了太赫茲光譜檢測腫瘤細胞的可能性.組織的定位及定性對于膠質(zhì)瘤術中的精準切除同樣至關重要.太赫茲技術可以實現(xiàn)膠質(zhì)瘤術中定位,克服膠質(zhì)瘤組織移位、無標記等,從而有效地區(qū)分腫瘤邊緣及腦組織成分[42,58,59].太赫茲技術實現(xiàn)膠質(zhì)瘤定性,可根據(jù)分子分型結(jié)果決定手術切除程度,從而指導手術策略的制定.盡管如此,由于太赫茲光譜成像系統(tǒng)的高成本和人體工程學低,臨床實踐目前還很遙遠.另外,考慮到太赫茲光學的功能材料和器件,將太赫茲反射或光譜學集成到傳統(tǒng)的神經(jīng)外科工作流程和神經(jīng)探針中非常具有挑戰(zhàn)性.

4.3 太赫茲技術在膠質(zhì)瘤術后病理診斷及預后監(jiān)測中的應用前景

病理信息進一步明確有助于患者治療方案制定.目前已證實膠質(zhì)瘤組織新鮮切片及石蠟切片的太赫茲波譜成像[42].然而輔助組織學的太赫茲波檢測技術需要優(yōu)化組織固定程序,目前已經(jīng)考慮了在太赫茲光譜范圍內(nèi)使用的多種固定組織的方法,其中包括福爾馬林[153]、明膠[154],及各種浸漬劑的組織脫水,以使太赫茲波穿透組織的深度增加,并突出正常和病理組織的非水因素的相關差異[155-157].石蠟包埋[7,42,158],組織凍結(jié)等可以增加組織探測深度并揭示組織的非水相關特征,包括癌癥DNA 中的準共振反應DNA 甲基化[50,159].除此之外,術后監(jiān)測對于膠質(zhì)瘤診療和預后同樣重要,術后監(jiān)測主要是體液檢測,基于4.1 節(jié)的描述,太赫茲技術也有望實現(xiàn)膠質(zhì)瘤術后定期監(jiān)測.

圖5 給出了THz 技術在臨床膠質(zhì)瘤診斷方面的新模式.總之,太赫茲因其獨特性質(zhì)在腫瘤診斷方面取得了很多前瞻性的進展,并且在膠質(zhì)瘤整個診療過程中具有潛在應用價值,有望實現(xiàn)“定位同時定性”的外科目標.

圖5 THz 技術在臨床膠質(zhì)瘤診斷方面的新模式Fig.5.New models of THz technology in clinical glioma diagnosis.