高偉欣 黃火清 趙晶 張?chǎng)?楊寧 楊浩萌

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

近年來(lái)，基因編輯技術(shù)已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域最熱門的研究工具，其中CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)因具有成本低廉、操作簡(jiǎn)單、編輯效率高等優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物、植物、微生物中都獲得了“井噴式”的研究和應(yīng)用［1-2］。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)可以完成DNA水平上的基因敲除、基因插入、單堿基編輯；并通過(guò)與DNA的結(jié)合，進(jìn)行基因的抑制或激活，達(dá)到基因表達(dá)調(diào)控的作用；CRISPR/Cas9系統(tǒng)也可以應(yīng)用在蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化、代謝通路的優(yōu)化、表觀遺傳學(xué)分析、底盤菌株構(gòu)建等方面，使過(guò)去耗時(shí)耗力的基因改造過(guò)程變得高效，節(jié)約了大量的人力、物力和財(cái)力［3-7］。

Cas9蛋白的本質(zhì)是一種DNA內(nèi)切酶，分子量158 kD左右，目前常用于基因編輯的Cas9蛋白多來(lái)源于Streptococcus pyogenes（化膿鏈球菌）［8］。Cas9蛋白與gRNA（guide RNA）可以在細(xì)胞內(nèi)或體外自發(fā)組裝成核糖核蛋白復(fù)合體（RNP，ribonucleoprotein）。RNP可以“掃描”整個(gè)DNA序列，識(shí)別出與gRNA上互補(bǔ)的序列，并定位于PAM位點(diǎn)與互補(bǔ)序列上，使DNA雙鏈解開(kāi)而形成R-loop結(jié)構(gòu)，gRNA與互補(bǔ)鏈雜交，Cas9蛋白的HNH酶活性位點(diǎn)切割互補(bǔ)的DNA鏈，而RuvC活性位點(diǎn)將切割非互補(bǔ)鏈，最終使PAM序列上游3 nt處的DNA雙鏈斷裂，完成剪切過(guò)程［9-10］。

在對(duì)基因組DNA進(jìn)行基因編輯時(shí)，Cas9蛋白和gRNA遞送進(jìn)入細(xì)胞的方式一般有3種［11-12］。首先，也是最常用的方式，可以將它們的編碼基因克隆在特定質(zhì)粒上，通過(guò)電轉(zhuǎn)、原生質(zhì)體、農(nóng)桿菌等轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)完成轉(zhuǎn)錄、翻譯等過(guò)程，最終Cas9蛋白和gRNA結(jié)合，發(fā)揮基因編輯功能；其次是將編碼Cas9蛋白的mRNA和gRNA遞送進(jìn)細(xì)胞中，通過(guò)翻譯合成蛋白并與gRNA結(jié)合而發(fā)揮功能；也可以將成熟的Cas9蛋白與gRNA一起在體外組裝成RNP，然后通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、顯微注射等方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞，同樣可以達(dá)到切割基因組上特定位點(diǎn)的目的［13］。目前，直接遞送RNP的基因編輯已經(jīng)成功的應(yīng)用于動(dòng)物、植物、真菌等的細(xì)胞中。例如，在動(dòng)物基因編輯研究中，對(duì)人的T細(xì)胞、小鼠的胚胎細(xì)胞中與疾病相關(guān)基因成功進(jìn)行了敲除或突變。Wang等［14］研究表明，基于RNP的CRISPR/Cas9基因編輯是研究小鼠免疫系統(tǒng)中基因功能的一種有前景的新策略；Seki等［15］研究表明，采用基于RNP的CRISPR/Cas技術(shù)很大程度簡(jiǎn)化了免疫治療的基因編輯過(guò)程。在植物的基因編輯研究中，如玉米、水稻、煙草等，成功對(duì)植物抗病基因進(jìn)行了改造。Park等［16］應(yīng)用RNP的基因編輯在較短時(shí)間內(nèi)培育作物的新特性；Khatodia等［17］利用RNP技術(shù)使植物具有更持久更廣譜的病毒抗性。在里氏木霉、黑曲霉、青霉、稻瘟病菌等真菌的基因編輯研究中，基于RNP的CRISPR/Cas技術(shù)促進(jìn)了酶蛋白、有機(jī)酸、抗生素等的生產(chǎn)［18-19］。Kuivanen等［20］研究表明基于體外組裝的RNP可以提高靶向效率并且改進(jìn)了黑曲霉生產(chǎn)半乳酸的能力；Hao等［21］研究證明將Cas9/gRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)化到里氏木霉中可以實(shí)現(xiàn)快速敲除基因的目的，在菌株改良和功能基因組學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用。近年來(lái)，還發(fā)展出基于RNP的DNA內(nèi)切酶體外活性的作物基因型分析技術(shù)、基于RNP的病原體檢測(cè)技術(shù)等，也為RNP的應(yīng)用提供了新的思路［22-23］。但究竟如何獲得有活性的RNP，其詳細(xì)的體外構(gòu)建、組裝和活性檢測(cè)的方法及注意事項(xiàng)卻很少報(bào)導(dǎo)，限制了RNP復(fù)合體在基因編輯中的應(yīng)用。

本研究在大腸桿菌中成功表達(dá)了Cas9蛋白，同時(shí)，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄獲得敲除目標(biāo)基因的gRNA，并獲得了Cas9蛋白和gRNA自發(fā)組裝的RNP復(fù)合體。經(jīng)過(guò)對(duì)RNP復(fù)合體的體外活性驗(yàn)證和在黑曲霉中的基因敲除驗(yàn)證，結(jié)果表明RNP具有較好的DNA雙鏈剪切活性，在黑曲霉中成功敲除了目標(biāo)基因，為進(jìn)一步的菌種改造，提供了良好的材料并大大降低了試驗(yàn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料

黑曲霉F223菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存；表達(dá)宿主為大腸桿菌BL21（DE3），pEASY-blunt克隆載體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pET28a（+）由本實(shí)驗(yàn)室保存；pREDCas9質(zhì)粒購(gòu)自Addgene網(wǎng)站（Addgene #71541；https://www.addgene.org/71541/）。

商品化Cas9蛋白購(gòu)自GenScript公司；重組酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；硫酸卡那霉素和氨芐青霉素購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；DNA 膠回收試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技有限公司；DNA高保真聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶XhoI、SpeI和NcoI購(gòu)自TaKaRa有限公司；真菌DNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；UniversAllTMTissue Extraction Kit快速基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自益生生技；T7轉(zhuǎn)錄試劑盒MEGAscriptTMT7 High Yield Transcription Kit購(gòu)自invitrogen公司；RNA純化試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；蛋白純化介質(zhì)為Ni-NTA-agarose resin（Qiagen公司）；無(wú)填料層析柱購(gòu)自NEB；蛋白含量測(cè)定試劑盒為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)為上海生化研究所產(chǎn)品；其它所用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

LB液體培養(yǎng)基：0.5%酵母提取物、1%NaCl、1%蛋白胨；固體LB培養(yǎng)基另外加入2%的瓊脂粉；YPD液體培養(yǎng)基：2%葡萄糖、2%蛋白胨、0.5%酵母提取物；CD固體培養(yǎng)基（pH 6.0）：2%葡萄糖、0.2%氯化鉀、0.3%硝酸鈉、0.05%七水硫酸鎂、0.1%磷酸氫二鉀、0.001%七水硫酸亞鐵、2%瓊脂粉；原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后生長(zhǎng)培養(yǎng)基（pH 7.0）：1 mol/L山梨醇、1%葡萄糖、2%瓊脂粉；發(fā)酵培養(yǎng)基（pH 6.0）：5%蔗糖、3%豆粕、2%玉米漿、0.1%硫酸鎂。

1.2 方法

1.2.1 載體的構(gòu)建 以pREDCas9質(zhì)粒為模板，以Pet-Insert-F和Pet-Insert-R為引物，用高保真聚合酶擴(kuò)增cas9基因全長(zhǎng)序列，并用膠回收試劑盒回收該P(yáng)CR產(chǎn)物。同時(shí)，將pET28a（+）表達(dá)載體用XhoI和NcoI做雙酶切處理，37℃水浴反應(yīng)1 h，酶切產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收。將以上兩個(gè)回收片段與重組酶混合，50℃反應(yīng)15 min，將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法參考說(shuō)明書(shū)，將感受態(tài)細(xì)胞在37℃，200 r/min條件下孵育后涂在添加卡那霉素的固體LB平板上，將長(zhǎng)出的單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證并測(cè)序，最終獲得包含pET28a-Cas9-NLS表達(dá)載體的大腸桿菌BL21菌株。

提取黑曲霉F223的基因組DNA（詳見(jiàn)Fungal DNA Mini Kit 說(shuō)明書(shū)），并以此為模板，以glucoamylase-F和glucoamylase-R為引物，高保真聚合酶擴(kuò)增黑曲霉來(lái)源的糖化酶（基因編號(hào)：An03g06550）的DNA序列，用膠回收試劑盒回收該P(yáng)CR產(chǎn)物，克隆到pEASY-blunt載體上，進(jìn)行DNA測(cè)序，獲得正確的帶有g(shù)lucoamylase基因的重組質(zhì)粒，即pEASY-glucoamylase。重組質(zhì)粒經(jīng)SpeI酶切線性化，用于Cas9蛋白體外活性驗(yàn)證。

以黑曲霉F223的基因組DNA為模板，以223up-F和223up-R為引物，高保真聚合酶擴(kuò)增黑曲霉糖化酶上游同源臂；以223down-F和223down-R為引物，同樣獲得下游同源臂；以hph-F和hph-R為引物，擴(kuò)增潮霉素抗性基因表達(dá)框。用引物223up-F和223down-R將上述3個(gè)片段進(jìn)行融合PCR，膠回收試劑盒回收該P(yáng)CR產(chǎn)物，獲得donor DNA。用引物hph-jc-F和hph-jc-R分別進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證3個(gè)片段是否完成連接。本研究中所使用的引物及序列信息如表1所示。

表1 引物名稱及序列信息Table 1 Primer names and sequence information

1.2.2 重組Cas9蛋白的表達(dá) 將Cas9蛋白表達(dá)菌株活化，按1%接種量轉(zhuǎn)接至200 mL的LB液體培養(yǎng)基中，添加卡那霉素至終濃度為50 μg/mL。將其在37℃條件下，200 r/min搖床培養(yǎng)大約3 h，至OD600=0.6-0.8；加入0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，在30℃條件下，200 r/min搖床誘導(dǎo)大約5 h；將菌體在12 000 r/min條件下，離心3 min，用20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液洗一遍菌體，于-20℃冰箱凍存。

1.2.3 重組Cas9蛋白的純化 凍存的菌體用破碎緩 沖 液（20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）懸 浮 定 容至20 mL，進(jìn)行超聲破碎，樣品參數(shù)設(shè)置為：功率30%，超聲5 s，間隔5 s，總時(shí)間為30 min。破碎后在12 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行純化。Cas9蛋白純化的填料使用Qiagen公司的Ni-NTA-agarose resin，吸取5 mL Ni-NTA-agaroseresin 于空柱子中，注意樹(shù)脂與墊片間不要留有空隙和氣泡。使用含20 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L imidazole，500 mmol/L NaCl，pH 8.0） 洗5個(gè)柱體積，去除雜蛋白，用500 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L imidazole，500 mmol/L NaCl，pH 8.0）洗脫并收集Cas9蛋白。使用100 000 MW CO蛋白超濾管，將洗脫緩沖液替換為蛋白存儲(chǔ)液（20 mmol/L Hepes，pH 7.5，150 mmol/L KCl，1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA，10%glycerol）。最后使用蛋白含量測(cè)定試劑盒對(duì)純化前后的蛋白樣品進(jìn)行定量及SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4 gRNA體外轉(zhuǎn)錄和純化 使用E-CRISPR網(wǎng)站（http://www.e-crisp.org/E-CRISP/）選擇黑曲霉來(lái)源糖化酶基因內(nèi)部的PAM序列，對(duì)gRNA和對(duì)照cgRNA進(jìn)行DNA模板合成（北京博邁德基因技術(shù)有限公司）。使用合成的DNA為模板，T7轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄出gRNA和對(duì)照cgRNA；具體反應(yīng)體系如下：DNA模 板200 ng、ATP/UTP/CTP/GTP各4 μL、10× Reaction Buffer 4 μL、Enzyme Mix 4 μL，總 體積40 μL，37℃反應(yīng)4 h 或過(guò)夜，轉(zhuǎn)錄后的gRNA和cgRNA稀釋100倍，用NanoDrop測(cè)定濃度。使用RNA純化試劑盒對(duì)轉(zhuǎn)錄獲得的gRNA和cgRNA進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物洗脫體積控制在20 μL，純化后的gRNA用NanoDrop測(cè)定濃度。RNA體外轉(zhuǎn)錄模板的序列信息如表2所示。1.2.5 RNP復(fù)合體體外活性驗(yàn)證 取純化后的gRNA（或cgRNA）與Cas9蛋白（或商品化的Cas9蛋白，即cCas9）及線性化的pEASY-glucoamylase質(zhì)粒DNA混合，反應(yīng)緩沖液為20 mmol/L Hepes，100 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L EDTA，pH 6.5，反應(yīng)總體積為20 μL，在37℃條件下反應(yīng)1 h，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)線性化質(zhì)粒的切割情況。具體試驗(yàn)步驟如下：

表2 RNA體外轉(zhuǎn)錄模板的序列信息Table 2 Sequence information of in vitro transcription templates of RNA

首先，設(shè)計(jì)7個(gè)陰性對(duì)照試驗(yàn)。分別為線性化質(zhì)粒DNA；DNA與重組表達(dá)的Cas9蛋白；DNA與cCas9蛋 白；DNA與gRNA；DNA與cgRNA；DNA與cgRNA和Cas9蛋白；DNA與cgRNA和cCas9蛋白混合。在37℃條件下反應(yīng)2 h以上，質(zhì)粒的添加量都為200 ng，反應(yīng)總體積為25 μL，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。

其次，試驗(yàn)組分為兩組，第一組以商品化的Cas9蛋白為試驗(yàn)對(duì)象，第二組以純化的重組Cas9蛋白為試驗(yàn)對(duì)象，每組的Cas9蛋白和gRNA的添加量均如表3中所示。反應(yīng)總體積為25 μL，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)線性化質(zhì)粒的切割情況。

表3 RNP復(fù)合體活性驗(yàn)證試驗(yàn)組反應(yīng)體系Table 3 Reaction system of test group for RNP complex activity verification

1.2.6 RNP復(fù)合體體內(nèi)活性驗(yàn)證 為了驗(yàn)證RNP復(fù)合體的體內(nèi)活性，采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，將RNP和帶潮霉素篩選標(biāo)記的donor DNA共同轉(zhuǎn)化至黑曲霉糖化酶生產(chǎn)菌株中。黑曲霉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化方法參考van等［24］方法。首先將黑曲霉菌絲接種于YPD液體培養(yǎng)基，32℃搖床振蕩培養(yǎng)2 d，成為均勻的小球。將其通過(guò)目篩過(guò)濾取小球，用無(wú)菌水沖洗干凈后，取適量菌體加入到原生質(zhì)體酶解液中，30℃，70 r/min蕩培養(yǎng)2 h收集原生質(zhì)體?；旌细?0 μg的gRNA和純化得到的Cas9，在37℃條件下孵育30 min，總體積為10 μL，即得到RNP復(fù)合體。以PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將20 μL回收產(chǎn)物donor DNA和10 μL RNP復(fù)合體共同轉(zhuǎn)入黑曲霉中。轉(zhuǎn)化子在潮霉素平板中，32℃培養(yǎng)2-3 d后，挑取轉(zhuǎn)化子至24孔板中，用于陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選。

首先通過(guò)PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，用快速提取基因組試劑盒提取基因組DNA，用引物GA223homo-downjc-F和hph-jc-R檢測(cè)潮霉素基因hph是否被整合到黑曲霉基因組中，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在32℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5 d后取樣。收集上清發(fā)酵液，進(jìn)行SDSPAGE分析。

2 結(jié)果

2.1 載體的構(gòu)建

以pREDCas9質(zhì)粒為模板，成功擴(kuò)增了cas9基因全長(zhǎng)序列，并在cas9基因3'端通過(guò)引物加入了21 bp的核定位信號(hào)序列（NLS），該序列編碼含7個(gè)氨基酸的短肽，能使Cas9蛋白和gRNA復(fù)合物（RNP）被識(shí)別并通過(guò)親水性的核孔復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核而發(fā)揮功能；在核定位信號(hào)序列3'端引入了6個(gè)His-Tag蛋白純化標(biāo)簽，便于純化。將該片段和用XhoI與NcoI進(jìn)行雙酶切處理的pET28a（+）載體進(jìn)行重組轉(zhuǎn)化，經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，最終獲得了pET28a-Cas9-NLS表達(dá)載體。

以黑曲霉F223的基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到了黑曲霉來(lái)源糖化酶（基因編號(hào)：An03g06550）的DNA序列，獲得重組質(zhì)粒pEASY-glucoamylase，并且經(jīng)過(guò)SpeI酶切成為線性化DNA片段。

以黑曲霉F223的基因組DNA為模板，擴(kuò)增獲得了黑曲霉糖化酶基因上/下游同源臂序列與實(shí)驗(yàn)室保存的潮霉素抗性基因表達(dá)框進(jìn)行融合PCR，產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證為正確，成功獲得了donor DNA。

2.2 重組Cas9蛋白的表達(dá)與純化

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，細(xì)胞破碎和鎳柱純化，對(duì)純化后的Cas9蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖1），Cas9蛋白的理論分子量為158 kD，與蛋白電泳中條帶位置相符，說(shuō)明重組Cas9蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)，并獲得較純的蛋白樣品。Cas9蛋白最終的得率：共8 mL Cas9蛋白洗脫液，測(cè)得蛋白濃度約400 μg/mL，原發(fā)酵液為200 mL，得率大約為16 mg/L。

圖1 重組Cas9蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDA-PAGE analysis of recombinant Cas9

2.3 gRNA的轉(zhuǎn)錄與純化

合成的gRNA和對(duì)照cgRNA體外轉(zhuǎn)錄模板的序列信息見(jiàn)表2。其中特異識(shí)別糖化酶基因的20 nt核酸序列用小寫(xiě)字母標(biāo)注，5'端T7啟動(dòng)子序列為黑體序列，3'端gRNA非識(shí)別區(qū)序列為斜體序列，將該完整序列進(jìn)行DNA合成，同時(shí)選擇另一個(gè)在黑曲霉基因組和體外驗(yàn)證用質(zhì)粒上都不存在的20 nt核酸序列作為對(duì)照序列，同樣合成對(duì)照DNA。

按照T7轉(zhuǎn)錄試劑盒操作，獲得的gRNA和cgRNA終濃度均為10 μg/μL左右；經(jīng)RNA純化試劑盒純化，gRNA和cgRNA終濃度為5-15 μg/μL左右，該濃度不能太低，否則會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)體積過(guò)大，剪切效率下降。

2.4 RNP復(fù)合體的體外活性驗(yàn)證

如圖2-A核酸電泳所示，在7個(gè)陰性對(duì)照組中，每個(gè)反應(yīng)都在37℃反應(yīng)2 h以上，都沒(méi)有發(fā)生DNA被剪切的情況，該試驗(yàn)結(jié)果表明，Cas9蛋白、gRNA與線性化質(zhì)粒缺少任何一個(gè)，都無(wú)法完成剪切反應(yīng)；另外，因?yàn)閏gRNA無(wú)法識(shí)別線性化質(zhì)粒上的PAM位點(diǎn)，無(wú)論其是與重組Cas9蛋白還是商品化的cCas9分別反應(yīng)時(shí)，線性化DNA也都不能被切割。

如圖2-B所示，試驗(yàn)組分為兩組，第一組以商品化的cCas9蛋白為試驗(yàn)對(duì)象，第二組是以純化的重組Cas9蛋白為試驗(yàn)對(duì)象。每個(gè)試驗(yàn)組中的Cas9蛋白與gRNA的量按從200 ng到6.4 μg共設(shè)了6個(gè)反應(yīng)。當(dāng)Cas9蛋白與gRNA的量為800 ng時(shí)，核酸電泳顯示已經(jīng)有微弱的DNA條帶被切割下來(lái)，分子量約1.4 kb，與gRNA的識(shí)別位點(diǎn)切割DNA后預(yù)測(cè)大小一致。在隨著Cas9蛋白與gRNA的量不斷增加時(shí)，線性化DNA被切割的更加完全，圖中1.4 kb大小的DNA片段的亮度明顯增加，未被切割的剩余線性化質(zhì)粒的分子量也明顯降低。由此結(jié)果說(shuō)明，當(dāng)DNA、Cas9蛋白、gRNA同時(shí)存在的情況下，Cas9蛋白與gRNA結(jié)合形成RNP，此時(shí)Cas9才能發(fā)揮剪切作用；另外，隨著RNP復(fù)合體濃度的提高，剪切效果更加的明顯；但是當(dāng)RNP濃度提高到一定程度時(shí)，線性化質(zhì)粒被完全切割，剪切反應(yīng)受底物量的限制也會(huì)達(dá)到平臺(tái)期，再增加RNP濃度也不會(huì)再對(duì)質(zhì)粒的非識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行切割。由此表明，gRNA識(shí)別位點(diǎn)的專一性保證了RNP復(fù)合體沒(méi)有發(fā)生脫靶切割；在大腸桿菌中表達(dá)并且純化的重組Cas9蛋白與商業(yè)化Cas9蛋白具有相似的剪切效果，證明重組Cas9蛋白同樣有良好的核酸酶活性。最后，確定了RNP活性檢測(cè)的最適反應(yīng)體系為gRNA/Cas9 蛋白的質(zhì)量各1.6 μg。在25 μL的反應(yīng)體系中，37℃反應(yīng)1 h后，可以對(duì)200 ng DNA底物充分進(jìn)行剪切。

圖2 RNP復(fù)合體體外活性驗(yàn)證Fig.2 In vitro activity verification of RNP complex

2.5 RNP復(fù)合體的體內(nèi)活性驗(yàn)證

對(duì)黑曲霉轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，檢測(cè)引物和RNP復(fù)合體基因編輯示意見(jiàn)圖3。在11個(gè)轉(zhuǎn)化子的核酸電泳圖4中，與對(duì)照原始菌株CK相比，靶向的糖化酶基因內(nèi)部明顯被插入潮霉素抗性標(biāo)簽，獲得了特異的1.4 kb左右條帶，這些條帶經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，潮霉素抗性基因hph成功插入RNP在基因組上的剪切位點(diǎn)內(nèi)。

圖3 RNP復(fù)合體體內(nèi)編輯過(guò)程示意圖Fig.3 Schematic diagram of RNP complex editing process in vivo

圖4 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證Fig.4 Verification of positive transformants by PCR

對(duì)PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。如圖5所示，幾乎所有轉(zhuǎn)化子的糖化酶蛋白條帶消失，8號(hào)轉(zhuǎn)化子與對(duì)照菌株相比，糖化酶蛋白條帶減弱，說(shuō)明當(dāng)將RNP復(fù)合物和donor DNA一同轉(zhuǎn)化至黑曲霉中，在RNP復(fù)合物的作用下，可以在黑曲霉中實(shí)現(xiàn)高效定向整合并敲除目標(biāo)基因。

圖5 轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液上清的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of supernatant of transformant fermentation broth

3 討論

RNP復(fù)合體介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)開(kāi)啟了CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用的新篇章，成為提高編輯效率、降低脫靶率和免疫反應(yīng)的有效手段［25］。利用RNP復(fù)合體進(jìn)行基因編輯，不存在外源基因整合進(jìn)基因組的風(fēng)險(xiǎn)，在細(xì)胞內(nèi)也不會(huì)進(jìn)行RNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的翻譯，減少了Cas9蛋白在細(xì)胞內(nèi)停留的時(shí)間，減少了Cas9蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的毒性和免疫反應(yīng)；同時(shí)，RNP復(fù)合物可以提高gRNA的穩(wěn)定性，降低了gRNA和Cas9蛋白無(wú)法進(jìn)入同一細(xì)胞核的概率，也降低了Cas9蛋白的脫靶率；RNP復(fù)合體在完成DNA剪切之后會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶、核酸酶等降解，在細(xì)胞中無(wú)殘留，可以反復(fù)使用RNP轉(zhuǎn)化同一宿主細(xì)胞，達(dá)到迭代進(jìn)化的效果；由于gRNA是體外轉(zhuǎn)錄的，不受合成量和種類的限制，可以在一次轉(zhuǎn)化過(guò)程中使用多個(gè)gRNA錨定不同的目標(biāo)基因，同時(shí)進(jìn)行多個(gè)基因的編輯，提高基因編輯效率，加速細(xì)胞進(jìn)化過(guò)程［26-27］。

雖然具有以上優(yōu)勢(shì)，有剪切活性的RNP復(fù)合體的獲得卻并不簡(jiǎn)單，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中需要注意以下幾點(diǎn)：（1）Cas9蛋白的基因來(lái)源于古細(xì)菌，在大腸桿菌中表達(dá)需要注意基因中密碼子的偏好性。本研究中的cas9基因來(lái)源于pREDCas9質(zhì)粒，該基因已經(jīng)完成大腸桿菌密碼子優(yōu)化，適于在大腸桿菌中表達(dá)，并提高蛋白的表達(dá)量；（2）對(duì)20 nt的識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行選擇時(shí)，應(yīng)該與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，選擇在基因組上單一的靶位點(diǎn)，避免基因編輯過(guò)程中的脫靶和非靶基因突變，為了提高試驗(yàn)效率，一般選擇兩個(gè)以上的20 nt的識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，從中選擇剪切效果好，專一性高的識(shí)別位點(diǎn)；（3）gRNA的體外轉(zhuǎn)錄使用了T7啟動(dòng)子，保證其轉(zhuǎn)錄效率的最短序列為：TAATACGACTCACTATAGGG；（4）本研究用到的gRNA的轉(zhuǎn)錄模板DNA為基因合成，成本較高，后期的試驗(yàn)可以利用該模板DNA構(gòu)建gRNA 轉(zhuǎn)錄用“骨架質(zhì)?！?，不同識(shí)別位點(diǎn)的gRNA只需合成一對(duì)引物，更換20 nt識(shí)別序列即可合成新的gRNA，可以有效節(jié)約試驗(yàn)成本。

當(dāng)然，獲得具有活性的RNP復(fù)合體后，下一步面臨的問(wèn)題是如何將其遞送進(jìn)宿主細(xì)胞。有研究表明，RNP復(fù)合體可以通過(guò)物理方式，如電穿孔、核轉(zhuǎn)染、顯微注射等方法導(dǎo)入細(xì)胞，但對(duì)細(xì)胞有一定的傷害；也可以通過(guò)化學(xué)方法如聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、聚乙烯亞胺、樹(shù)枝狀聚合物等介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化等方法，但對(duì)不同的細(xì)胞也會(huì)有不同的毒性；另外還有納米載體介導(dǎo)的RNP復(fù)合體遞送等其他方法，在動(dòng)物、植物、微生物、藻類等不同物種中都成功的進(jìn)行了基因編輯，這些研究成果，為我們的后續(xù)試驗(yàn)提供了有效的手段和寶貴的經(jīng)驗(yàn)［26］。本試驗(yàn)通過(guò)采用聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化方法，將RNP復(fù)合體和供體DNA一同轉(zhuǎn)化至黑曲霉中，根據(jù)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)結(jié)果，RNP復(fù)合體在體外可以剪切目的基因，在黑曲霉體內(nèi)也使目的基因表達(dá)的相應(yīng)蛋白條帶消失，都說(shuō)明RNP復(fù)合體確實(shí)在體外和體內(nèi)都發(fā)揮了基因編輯的作用；通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化子的基因組DNA的提取和PCR鑒定，在目的基因上確實(shí)整合了潮霉素的篩選標(biāo)記，與推測(cè)的剪切位點(diǎn)和插入位點(diǎn)的PCR條帶大小基本一致；我們隨機(jī)對(duì)3個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序，確實(shí)是在設(shè)計(jì)的位點(diǎn)上進(jìn)行了切割和插入，因此體外和體內(nèi)驗(yàn)證結(jié)果一致，都達(dá)到了定點(diǎn)剪切的目的，并且基因編輯效率也比較高。

之所以選擇黑曲霉作為體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的受體菌株，是因?yàn)楹谇棺鳛榻z狀真菌，是發(fā)酵工業(yè)的重要生產(chǎn)菌株，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)各種酶制劑和有機(jī)酸等［28］。例如，全球市場(chǎng)上60%的檸檬酸是通過(guò)黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)的；據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，有30多種工業(yè)用酶制劑都可以通過(guò)黑曲霉菌株進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)［29］。利用RNP介導(dǎo)的基因編輯工具對(duì)黑曲霉工業(yè)菌株進(jìn)行改造，可以達(dá)到提高菌株優(yōu)化效率的目的，對(duì)黑曲霉的工業(yè)化應(yīng)用具有深遠(yuǎn)的意義。下一步，我們將對(duì)RNP在體內(nèi)基因編輯的條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提高編輯效率、降低脫靶率。

4 結(jié)論

本研究獲得了具有較好剪切活性的RNP復(fù)合體，其中純化的Cas9蛋白具有與商品化Cas9蛋白相似的作用效果，使試驗(yàn)成本大幅度降低；gRNA的轉(zhuǎn)錄采用T7轉(zhuǎn)錄試劑盒，使gRNA合成的質(zhì)量得到保證，同時(shí)可以針對(duì)不同的目標(biāo)基因合成不同的gRNA，積累成“gRNA庫(kù)”，為后續(xù)試驗(yàn)提供便利。RNP復(fù)合體的體外活性檢測(cè)方法可以在體外直觀的檢測(cè)到核酸剪切的過(guò)程，也為RNP復(fù)合體在基因編輯之外的基因型分析、病毒檢測(cè)、活體成像等方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)；RNP復(fù)合體的體內(nèi)活性檢測(cè)，選擇工業(yè)生產(chǎn)糖化酶的黑曲霉菌株，從SDS-PAGE上直觀看到蛋白條帶的消失，說(shuō)明該方法對(duì)表達(dá)量極高的蛋白也能成功完成基因敲除，為進(jìn)一步的菌株改造奠定了基礎(chǔ)。