李佳樂 林晟豪 許文濤，

（1. 中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 農業(yè)農村部農業(yè)轉基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京 100083；2. 中國農業(yè)大學營養(yǎng)與健康系 食品精準營養(yǎng)與質量控制教育部重點實驗室，北京 100083）

具有抗蟲特性的轉基因作物是借助DNA重組技術，將外源抗蟲基因整合到對應生物體中，使其表達出良好的抗蟲特性并且能穩(wěn)定遺傳給后代的一類作物。抗蟲基因源于蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）中的Bt基因，該基因被廣泛用作抗蟲外源基因。目前，Bt基因中運用最廣泛的是Cry1A基因，在已商業(yè)化的49個抗蟲轉基因作物轉化體中有32 個含有Cry1A基因，占65.3%［1］，而Cry1A基 因 又 包 括Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ab/Ac、Cry1A.105［2］和mCry1Ac［3］。利用轉基因技術改造的抗蟲農作物可以很好的減少農藥使用，減少農業(yè)生產成本，保護生態(tài)環(huán)境和人類健康［4-5］。目前一些商業(yè)化轉基因作物已經(jīng)得到了推廣，包括抗蟲水稻、玉米和棉花等。但由于抗蟲轉基因作物的推廣和轉基因技術的不斷發(fā)展，對于相應的檢測技術也提出了挑戰(zhàn)。

目前，具有抗蟲特性的轉基因產品的檢測可以從DNA、mRNA轉錄、蛋白質或代謝物水平等多個不同層面進行［6-8］。DNA和RNA水平的外源核酸檢測技術具有高靈敏度、高特異性和穩(wěn)定性，核酸檢測方法則以PCR和環(huán)介導等溫核酸擴增技術（loopmediated isothermal amplification，LAMP）為主［9-10］。LAMP最早由Notomi提出，在60-65℃恒溫條件下，通過鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶）的作用，4-6條特殊設計的引物可以特異性結合到模板基因的6-8個區(qū)域上，可以在30-60 min完成核酸擴增［11］。該恒溫方法常見的信號輸出方式有比色法［12］、熒光法［10，13］、電化學法［14-15］。其中，比色法因其操作簡單、現(xiàn)象明顯、可以與微流控結合形成快速檢測芯片等優(yōu)勢得到更為廣泛的應用。目前比色法常用染料如基于pH變化的中性紅［16］、羥基溴酚藍（hydroxynaphthol blue，HNB）［17］，基于Mg2+濃度的鈣黃綠素［18］，均可在檢測終點形成明顯的顏色變化，指示目標基因擴增反應的發(fā)生。

基于pH指示劑的方法原理是在LAMP擴增中，隨著dNTP大量引入到擴增子中，會產生焦磷酸根和大量H+，而焦磷酸的部分水解也會產生一定量的H+，在弱緩沖體系下，積累的H+可以實現(xiàn)體系的pH明顯降低，跨越pH指示劑的突變區(qū)間，使pH指示劑變色。LAMP體系反應前的pH值約為8.8，反應后下降到6.0-6.5，可以依據(jù)此選取指示劑以表征反應的發(fā)生［19］。通常選用的pH指示劑包括中性紅［20］、苯酚紅［21］、甲酚紅［22］和二甲酚橙［23］，分別能實現(xiàn)黃色到粉紅色、粉紅色到黃色、紫紅色到黃色、粉紅色到橙黃色的轉變。然而上述4種常用的指示劑的顏色變化均為突變，尚不具備半定量潛力。溴百里酚藍（bromothymol blue，BTB）是一種性能穩(wěn)定的pH指示劑，其可以依據(jù)溶液pH由堿性到酸性實現(xiàn)由藍色（pH 7.6）到黃色（pH 6.0）的漸變，發(fā)生顏色改變的pH區(qū)間與LAMP反應前后pH變化區(qū)間有很大重合，且顏色變化可以在自然光下由裸眼區(qū)分［24］。因為其在一定區(qū)間內隨pH變化可以產生裸眼可視的明顯顏色變化，在肉類［25］、奶類［26］質量安全的現(xiàn)場快速檢測方面有良好的適用性。此外BTB還可以用于紫外分光光度計實現(xiàn)定量檢測，例如，Ong等［27］利用pH 7.2的BTB溶液快速篩選可生產脂肽的菌株，并且可以在410 nm和616 nm處實現(xiàn)對脂肽的定量檢測。Ramadan等［28］基于格列美脲（GLM）與BTB可形成黃色離子復合物開發(fā)了一種簡便、精準的紫外分光光度法用于測定純制劑和藥物制劑中的GLM，可在412 nm處定量。近期，Gul等［29］還提出了一種基于BTB指示的非儀器化環(huán)氧化物檢測方法，利用鹵素脫鹵酶（HheC）催化環(huán)氧化物底物開環(huán)引起pH變化從而使BTB變色，使用智能手機即可完成對圖像采集和數(shù)據(jù)處理，完成對環(huán)氧化物含量的測定，大大降低了分析成本和難度。

但目前將BTB作為LAMP反應指示劑的相關研究暫無，基于此，本研究以科豐6號（Kefeng 6，KF6號）轉基因水稻作為模式植物，根據(jù)Cry1Ac和Cry1Ab/Ac基因的同源區(qū)域設計6條LAMP特異性引物，選取BTB作為顯色指示劑，構建pH響應的LAMP生物傳感器，以期快速、靈敏、一步法篩查靶基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 本實驗中的轉基因作物均由實驗室保存，測試樣品品種及Cry1A基因具體信息見表1。所用天根生化科技（北京）有限公司的多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒和RNase A購于TIANGEN公司，dNTP Mixture購于日本TaKaRa公司，Bst 2.0 polymerase、10×Thermopol Reaction Buffer、MgSO4購于NEB公司，甜菜堿（betaine）購于美國Sigma，SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain購于美國Invitrogen公司，溴百里酚藍（BTB）購于天津市科密歐化學試劑有限公司，瓊脂糖購于上海百晶生物技術有限公司，Tris購于北京博奧拓達科技有限公司。

表1 測試轉基因及非轉基因樣品Cry1A基因具體信息Table 1 Test specific information of Cry1A gene in GMO and non-GMO samples

1.1.2 實驗儀器 FQD-96A熒光定量PCR擴增儀（杭州博日科技股份有限公司）、NanoDrop one分光光度計（美國Thermo Fisher公司）、HZP-L502 pH計（華志電子科技有限公司）、SH-510凝膠成像系統(tǒng)（杭州申花科技有限公司）。

1.2 方法

本文的LAMP生物傳感器利用環(huán)介導等溫擴增實現(xiàn)Cry1Ac或Cry1Ab/Ac基因核酸信號放大，在保證酶活的同時將緩沖液的緩沖能力降低，使得LAMP反應前后體系有更大的pH變化，并以BTB為指示劑實現(xiàn)一步可視化檢測。檢測原理如圖1所示。在LAMP擴增中有大量的DNA鏈合成，每一分子的dNTPs被合成到新的鏈上時都會產生一分子的焦磷酸根和H+，焦磷酸根的部分水解也伴隨著一定量H+產生。以BTB為指示劑的LAMP生物傳感器可以響應LAMP反應過程中產生的H+，從而實現(xiàn)體系從綠色到黃綠色，再到黃色的變色。

1.2.1 植物基因組DNA的提取 所有轉基因和非轉基因植物的基因組DNA提取參照天根生化科技（北京）有限公司的多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒說明書。所得的基因組使用NanoDrop one分光光度計測定基因組DNA濃度，并將基因組濃度調整至50、25和5 ng/μL。

1.2.2 引物序列設計 比較Cry1A基因中Cry1Ab（AY326434.1）、Cry1Ac（Y09787.1）、Cry1Ab/Ac（EU816953.1）、Cry1A.105［2］和mCryAc［3］的序列，選取Cry1 Ac和Cry1Ab/Ac的同源區(qū)域（附圖1-A），及Cry1Ab、Cry1A.105和mCry1Ac的非同源區(qū)域為靶標基因（附圖1-B），命名為Cry1Ac&Ab/Ac。利用LAMP Primer Explorer 5在線軟件（http://primerexplorer.jp/e/v5_manual/index.html）設計3組引物，其中第二套與第三套的BIP引物相同（表2）。所有引物均由上海生工生物工程公司合成，PAGE純化。

表2 LAMP引物設計表Table 2 LAMP primer design table

圖1 檢測原理圖Fig. 1 Detection principle diagram

1.2.3 LAMP非開蓋可視化體系的構建與優(yōu)化 建立25 μL的LAMP擴增體系，包 括10×Isothermal amplification buffer、0.6 mol/L Betaine、0.5 mmol/L dNTP、3 mmol/L MgSO4、0.2 μmol/L F3和B3、1.6 μmol/L FIP和BIP、0.8 μmol/L LF和LB、0.4 μmol/L SYTO 9、8 U Bst 2.0 polymerase、400 pg/μL Kefeng 6轉基因水稻基因組，以下涉及的所有操作均進行了3次生物學平行。反應液充分混勻后置于博日熒光定量PCR儀中，64℃反應1 h，每1 min讀取一次FAM信號，85℃ 3 min。調整10×Isothermal amplification buffer中的Tris終濃度分別為0、6.5、13、19.5、26、32.5、39、52、65、130 mmol/L，并保持緩沖液的天然pH，隨后在弱緩沖體系中添加1 μL的0.1% BTB pH指示劑，肉眼觀察反應終點的顏色變化。最后優(yōu)化0.1% BTB的添加量分別為0.75、1.0、1.25、1.5、2.0 μL。

1.2.4 LAMP特異性測試 分別以常見的商業(yè)化轉基因作物的基因組DNA為模版，評價本文中LAMP方法的特異性。7種轉基因作物分別為轉基因水稻Kefeng8號、轉基因水稻TT51、轉基因玉米Bt11、轉基因玉米Bt176、轉基因玉米MON810、轉基因棉花MON 15985、轉基因甜菜H7-1，2種非轉基因作物包括五優(yōu)稻4號和粳稻糙米。采用優(yōu)化后的LAMP反應體系，64℃恒溫反應1 h，85℃ 3 min，添加1.5 μL BTB用于可視化分析，隨著LAMP反應中H+的不斷生成，構建的生物傳感器能夠響應pH的變化，當體系中存在靶標時響應為黃色，當沒有靶標存在時則為綠色。裸眼判定終點后，結合瓊脂糖電泳進行雙重驗證。

1.2.5 LAMP靈敏度分析 將Kefeng 6轉基因水稻的基因組進行梯度稀釋，依據(jù)公式：拷貝/μL=（ng/μL×NA）/（堿基對長度×109×650D）得到濃度分別為2.12×105、1.06×105、2.12×104、4.24×103、8.48×102、3.4×100、1.7×100拷貝/μL的基因組樣品，通過瓊脂糖電泳和可視化方法進行比較分析。

2 結果

2.1 最佳引物篩選

為了篩選出最優(yōu)的引物，比較了3套引物的實時定量擴增曲線和終點時的凝膠電泳圖。從圖2-A中可以看出，Cry1Ac&Ab/Ac -2引物在20 min左右就出現(xiàn)了擴增曲線，相比于其他兩套引物具有最小的Ct值。圖2-B的電泳結果中Lane 3的條帶亮度最強，表明Cry1Ac&Ab/Ac-2引物可以在相同擴增時間內得到最多的擴增產物。為了獲得更低的檢測限線和使得終產物中有更多的H+，選擇Cry1Ac&Ab/Ac-2引物進行后續(xù)實驗。

圖2 引物篩選圖Fig.2 Primer screening diagram

2.2 比色方法的可行性及優(yōu)化

顯色體系中的Tris濃度優(yōu)化結果如圖3-A所示，Tris的最優(yōu)終濃度為3.25 mmol/L，而不是經(jīng)典的20 mmol/L，可能是20 mmol/L的Tris終濃度的體系更具有普適性和擴增過程中的穩(wěn)定性，但是3.25 mmol/L Tris的環(huán)境對于該體系的擴增初期最有利。BTB的添加量優(yōu)化結果如圖3-B，C所示，隨著0.1%BTB的添加量的增加，即該生物傳感器中的顯色劑含量增加，可視化響應效果也隨之增加，尤其在添加量0.75-1.5 μL時。但是可能是由于BTB溶液中含有乙醇，其添加量的增加對于傳感器的LAMP擴增效率有一定抑制作用，但是抑制效果較小，所以優(yōu)先考慮BTB的指示效果，選取其添加量為1.5 μL，見圖3-B中的紅框。

圖3 比色方法可行性及優(yōu)化Fig. 3 Feasibility and optimization of colorimetric method

2.3 特異性驗證

在最優(yōu)的體系條件下，LAMP生物傳感器可以響應轉基因水稻Kefeng 6、Kefeng 8、TT51和轉基因棉花MON 15985這4種含有Cry1Ac或者Cry1Ab/Ac基因的轉基因樣本，裸眼可視化結果為黃色或黃綠色。轉基因玉米Bt11、Bt176、MON 810、轉基因甜菜H7-1、五優(yōu)稻4號和粳稻糙米這6種不含有靶標基因的轉基因或者非轉基因作物則不能實現(xiàn)LAMP生物傳感器的響應，裸眼可視化結果為綠色。瓊脂糖電泳的結果與生物傳感器響應的結果保持一致（圖4）。

圖4 LAMP方法特異性驗證Fig. 4 Specificity verification of LAMP method

2.4 靈敏度分析

LAMP生物傳感器對于2.12×105-1.7 拷貝/μL的樣本的響應都為黃色，瓊脂糖凝膠電泳的表征也具有典型的梯型擴增條帶，表明該生物傳感器的檢測靈敏度可以達到1.7 拷貝/μL，相比于其他檢測方法（附表1），具有更高的靈敏度。并且隨著靶標基因的拷貝數(shù)降低，LAMP擴增中產生的H+未達到飽和，該生物傳感器在響應黃色信號的同時還保持有綠色色調（圖5）。相比于瓊脂糖電泳分析中的結果，該生物傳感器對于在檢測限附近不同濃度的靶標所響應的顏色有細微的可視化區(qū)別，說明該方法具有一定的半定量潛力，在儀器分析下可以實現(xiàn)半定量。

圖5 LAMP方法靈敏度分析Fig. 5 Sensitivity analysis of LAMP method

3 討論

轉基因作物在帶來一系列好處的同時也可能對環(huán)境和人類健康造成威脅，其中抗蟲基因作物的擴增風險較高，為了保障公民的知情權，建立新型的抗蟲基因檢測方法對于完善我國轉基因檢測體系具有重要意義。Cry1A基因是使用頻率最高的外源抗蟲基因，該基因還可以進一步細分為其他基因。為了進一步區(qū)分Cry1A抗蟲基因家族的具體特異性基因，本文針對Cry1Ac與Cry1Ac/Ab基因的的同源區(qū)域設計了3套特異性LAMP引物。

轉基因作物基因水平檢測的金標準仍然是PCR方法，但是PCR方法依賴熱循環(huán)儀，這限制了其在現(xiàn)場檢測的運用。而近10年興起的環(huán)介導等溫擴增技術彌補了這一缺陷，并伴生了包含有比色、熒光、電化學等方式的生物傳感器。這些傳感器中比色方法可以實現(xiàn)一步裸眼可視化、成本低廉、儀器要求低，但是目前的比色試劑的研發(fā)集中于HNB和中性紅。隨著NEB等公司的中性紅比色試劑盒的上市，這一同質化現(xiàn)象進一步加深。

本研究根據(jù)LAMP反應過程中能夠產生大量H+，以及Bst 2.0聚合酶能夠耐受6.0-10.0的pH變化的基礎［19］，挑選了在pH 6.0-7.6存在連續(xù)變色現(xiàn)象的pH指示劑BTB作為顯色劑。與中性紅類似，使用BTB作為顯色劑也具有一系列優(yōu)點，如裸眼可視化、顯色現(xiàn)象明顯、一步閉管操作、操作簡單等。同時該方法還具有中性紅不具備的優(yōu)勢：（1）BTB水溶性更好，只需溶解在20%的乙醇溶液中，而同質量的中性紅需要溶解在60%的乙醇溶液中，所以添加BTB指示劑可以更少地在體系中引入乙醇，降低乙醇對于反應的影響。（2）BTB在變色區(qū)間內會實現(xiàn)藍色、藍綠色、綠色、黃綠色、黃色的依次轉變，中性紅則為黃色至紅色的突變。所以BTB的比色結果更加豐富，可以與比色卡聯(lián)用，更具有商業(yè)化潛力。

選擇了pH比色試劑后，本文對于LAMP體系的緩沖能力進行了調整，相比于在無緩沖能力的體系中直接使用pH指示劑，本研究保留了體系的部分緩沖能力，使Bst酶在擴增過程中的環(huán)境更接近于理論最優(yōu)。不過Bst酶的緩沖體系仍然需要進一步優(yōu)化，在本研究中尚只能實現(xiàn)反應前后從綠色轉變?yōu)辄S綠色再轉變?yōu)辄S色，若想要實現(xiàn)反應前后從藍色轉變?yōu)辄S色，在兼顧反應效率的同時，還需要進一步調整體系的初始pH、緩沖能力以及增加H+的產生量。

4 結論

本文針對Cry1Ac/Ab和Cry1Ac的同源序列設計LAMP引物，并首次在弱緩沖體系中引入BTB作為生物傳感器的響應試劑，一步法實現(xiàn)比色信號輸出。該方法可以在1 h內檢測到1.7 拷貝的Cry1Ac或Cry1Ac/Ab基因，同時具有良好的特異性。

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