唐光甫 桂艷玲 滿海喬 趙杰宏

（貴州中醫(yī)藥大學(xué) 貴州省中藥生藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025）

紅曲霉（Monascus）作為我國傳統(tǒng)藥食兩用真菌，已有上千年歷史［1］，目前常利用紅曲霉發(fā)酵生產(chǎn)多種食品，如娃哈哈紅曲藜麥餅干、茅臺(tái)不老紅曲酒、紅曲腐乳和紅曲腌漬魚等，紅曲色素也被廣泛用作食品添加劑?，F(xiàn)代科學(xué)證明紅曲霉能生產(chǎn)麥角固醇、洛伐他汀、γ-氨基丁酸等多種功能活性物質(zhì)［2］，已有脂必妥、血脂康等藥品和納豆紅曲、靈芝紅曲等保健品的上市銷售。但自從紅曲產(chǎn)品中檢測出桔霉素這種真菌毒素［3］以來，紅曲產(chǎn)品的生產(chǎn)和應(yīng)用受到很大影響［4］。因此深入研究紅曲霉次生代謝產(chǎn)物的遺傳調(diào)控、加快選育安全、高效的紅曲霉菌種非常重要。

已報(bào)道通過同源重組技術(shù)先后開展了CntA/Orf2［5］、CtnB/Orf4［6］、CtnE［7］、CtnF［8］、CtnG［9］、CtnH［10］、Orf1［11］、Orf3［12］、Orf6［13］、Orf7［14］和pksCT［15］等基因的敲除實(shí)驗(yàn)，初步證實(shí)了多個(gè)桔霉素合成相關(guān)基因。有研究報(bào)道尿嘧啶核苷的天然產(chǎn)物能夠成為新型小分子的抑制劑［16］，而黑曲霉pyrG基因（乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶基因）的破壞能增強(qiáng)糖酵解通量，并顯著提高檸檬酸鹽及其前體的量［17］，可見尿嘧啶核苷及其合成關(guān)鍵基因pyrG在真菌物質(zhì)代謝上有重要功能。本文通過構(gòu)建紅曲霉Cas 9底盤菌株，利用體外轉(zhuǎn)錄合成的sgRNA轉(zhuǎn)化其原生質(zhì)體實(shí)現(xiàn)對(duì)pyrG基因的定向編輯，為紅曲霉構(gòu)建了快速基因編輯體系，并證實(shí)pyrG基因?qū)t曲霉的次生代謝有重要影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 紫色紅曲霉（Monascus purpureus）菌株由貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA 105和 大 腸 桿 菌（Escherichia coli）TOP 10感受態(tài)（購自北京華越洋）。

1.1.2 試劑 pGM-T克隆試劑盒和Genegreen核酸染料（購自北京天根生化），sgRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自重慶英茂盛業(yè)），T7EI核酸內(nèi)切酶（購自北京唯尚立德），尿嘧啶核苷和5-氟乳清酸（5-FOA）（購自上海生工），纖維素酶、溶壁酶和蝸牛酶（購自北京索萊寶），pDHt/sk-PC（購自Addgene），桔霉素Elisa檢測試劑盒（購自上海紀(jì)寧）。

1.2 方法

1.2.1 CRISPR/Cas9遺傳轉(zhuǎn)化 將pDHt/sk-PC（含Ppdc-toCas9-Tpdc表達(dá)框）質(zhì)粒經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA 105感受態(tài)，涂布在含50 mg/L Kan的LB培養(yǎng)基上篩選，使用Cas 9檢測引物（表1）對(duì)抗性菌落分別PCR鑒定，將獲得的農(nóng)桿菌陽性菌株在含50 mg/L kan液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取菌液離心去除上清，用IM培養(yǎng)基稀釋至OD600值為0.15-0.2，再在相同條件下培養(yǎng)4-6 h，至其OD600值為0.6-0.8。用此菌液稀釋紅曲霉孢子至106個(gè)/mL，取200 μL涂布于鋪有0.45 μm硝酸纖維素膜的Co-IM培養(yǎng)基［18］平板上，25℃暗處共培養(yǎng)3 d，將長出的菌落和硝酸纖維素膜一起揭下倒扣在含20 mg/L潮霉素和300 mg/L頭孢霉素的沙氏培養(yǎng)基上篩選，2 d后揭下硝酸纖維素膜，挑取抗性紅曲霉單菌落使用Cas 9檢測引物分別進(jìn)行PCR分析。

表1 PCR檢測引物和sgRNA序列Table 1 Primers and sgRNA sequences for PCR detection

1.2.2 原生質(zhì)體制備 將紅曲霉底盤菌株接種在含潮霉素的PDA平板上培養(yǎng)15 d后，用無菌水沖洗孢子，制成1×108個(gè)/mL的孢子懸液涂布于鋪玻璃紙的PDA平板上，40 h后刮取菌絲，按比例（M∶V=1∶30）加入酶裂解液［19］（用1.0 mol/L MgSO4配制，含1.0 g/L纖維素酶、3.0 g/L的溶壁酶和10.0 g/L的蝸牛酶），置于60 r/min和30℃搖床中酶解2.5-3 h，然后在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體的數(shù)量。

1.2.3 sgRNA合成和轉(zhuǎn)化 將橙色紅曲pyrG基因（GenBank：GU723506.1）序列在NCBI 與紫色紅曲基因組blast，將共有序列提交到http://crispor.tefor.net/在線設(shè)計(jì)pyrG的sgRNA（圖1）及其檢測引物對(duì)（表1）送北京六合華大基因公司合成。利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒合成sgRNA，并經(jīng)電泳檢測。取100 μL原生質(zhì)體加入10 μL sgRNA，冰浴30 min后加入1 mL PTC溶 液（PEG 4000 40%、pH 8.0 Tris 50 mmol/L、CaCl250 mmol/L），室溫放置40-60 min，取300 μL涂布在含20 mg/L潮霉素、20 g/L尿嘧啶核苷和1.5 g/L 5-FOA的CM再生培養(yǎng)基（蔗糖210.38 g/L、酵母膏6 g/L、酪氨酸6 g/L、瓊脂20 g/L）上30℃恒溫培養(yǎng)4-7 d。利用Cas 9引物對(duì)長出的抗性紅曲霉菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增、T7EI酶切和測序鑒定。

圖1 pyrG基因sgRNA靶標(biāo)序列Fig. 1 Target sequence of sgRNA for gene pyrG

1.2.4 化學(xué)成分測定 將液體沙氏培養(yǎng)基二級(jí)接種培養(yǎng)14 d后的菌絲體過濾，45℃干燥后研碎。測定紅曲色素，精密稱取0.10 g菌絲粉末加入10 mL 70%乙醇搖勻，60℃水浴1 h，然后補(bǔ)足10 mL濾過，將濾液倒入25 mL容量瓶中定容，用紫外分光光度計(jì)檢測505 nm吸光度，計(jì)算紅曲色素的色價(jià)（色價(jià)U/g=吸光度×稀釋倍數(shù)×浸提溶劑體積/樣品質(zhì)量）。測定洛伐他汀，取1 mL發(fā)酵液加入9 mL 70%乙醇混勻，放入恒溫振蕩器28℃、130 r/min振蕩1 h，然后4 200 r/min離心5 min，取上清液檢測237 nm處吸光度值來判斷含量高低［20］。測定桔霉素，稱取菌絲體粉末0.30 g，加入2 mL 70%甲醇超聲10 min后，取1 mL懸濁液12 000 r/min離心10 min，取上清液用桔霉素 ELISA試劑盒進(jìn)行測定，同步制作桔霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。

圖2 桔霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Standard curve of citrinin

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及顯著性分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Graghpad prism軟件分析，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”（Mean±SD）表示。分析方法為“單因素方差分析-多重比較-Turkey檢驗(yàn)”，*P<0.05表示有顯著性差異，**P<0.01有較顯著差異，***P<0.005有極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 制備紅曲霉Cas 9底盤菌株

將含Ppdc-toCas9-Tpdc表達(dá)框的pDHt/sk-PC質(zhì)粒經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA 105感受態(tài)，對(duì)Kan平板上的抗性農(nóng)桿菌菌落PCR檢測（圖3-A），獲得陽性轉(zhuǎn)化菌株，然后與紫色紅曲霉孢子懸液共培養(yǎng)（圖3-B），再轉(zhuǎn)接到添加Hyg和Cef的平板上進(jìn)行抗性篩選，使用Cas 9引物對(duì)抗性紅曲霉菌落進(jìn)行PCR檢測（圖3-C），獲得了轉(zhuǎn)化成功的紅曲霉Cas 9底盤菌株。

圖3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)Cas 9轉(zhuǎn)化紅曲霉Fig. 3 Transformation of Cas 9 into monascus mediated by A. tumefaciens

2.2 體外sgRNA轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體

基因pyrG是否變異可以通過在添加5-FOA和尿嘧啶核苷的培養(yǎng)基上篩選，能夠正常生長的菌株，推測其pyrG基因發(fā)生突變并喪失功能，因此需建立5-FOA對(duì)紫色紅曲霉的最佳篩選濃度。通過比較不同濃度5-FOA對(duì)紅曲霉生長的抑制作用，發(fā)現(xiàn)當(dāng)5-FOA濃度達(dá)到1.5 g/L時(shí)，紅曲霉完全被抑制（圖4-A），故選擇1.5 g/L的5-FOA作為紅曲霉篩選濃度［21］。使用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒合成pyrG基因的sgRNA，電泳檢測表明條帶大小正確（圖4-B），經(jīng)PEG介導(dǎo)將sgRNA轉(zhuǎn)化到紅曲霉原生質(zhì)體中（圖4-C），在含20 mg/L潮霉素、20 g/L尿嘧啶核苷和1.5 g/L 5-FOA的培養(yǎng)基上篩選，獲得了抗性紅曲霉菌株（圖4-D）。

圖4 體外sgRNA轉(zhuǎn)化紅曲霉原生質(zhì)體Fig. 4 Transformation of monascus protoplasts by sgRNA in vitro

2.3 突變株pyrG基因變異分析

用pyrG引物對(duì)獲得的抗性紅曲霉菌株P(guān)CR擴(kuò)增，部分PCR產(chǎn)物的序列有明顯的局部套峰（圖5-A），說明序列上存在變異導(dǎo)致錯(cuò)峰。雖然5、6、7、8號(hào)菌株P(guān)CR產(chǎn)物是單條帶（圖5-B），但用T7EI核酸內(nèi)切酶檢測pyrG序列與野生型的雜合性時(shí)，結(jié)果顯示5號(hào)和6號(hào)在突變株泳道及混合泳道上均切出了第2條帶，可見5號(hào)和6號(hào)菌株有變異位點(diǎn)，屬于雜合基因型；7號(hào)菌株僅在混合泳道切出了第2條帶，屬于純合基因型（圖5-C）。經(jīng)測序證實(shí)，pyrG基因序列被CRISRP/Cas9成功編輯。4個(gè)突變菌株中，5號(hào)和8號(hào)在相同位點(diǎn)均缺失2個(gè)堿基，6號(hào)和7號(hào)在臨近位點(diǎn)各缺失1個(gè)堿基，變異均發(fā)生在PAM位點(diǎn)上游2-5 bp范圍（圖5-D）。

圖5 紅曲霉突變株pyrG基因的變異分析Fig. 5 Variation analysis of pyrG gene of monascus mutant

2.4 突變株的形態(tài)特征

通過CRISPR/Cas 9技術(shù)把pyrG基因編輯成功的紅曲霉菌株接種在含潮霉素、5-FOA和尿嘧啶核苷的培養(yǎng)基上能夠生長，而野生型不能生長，可見突變株的pyrG基因失去了功能，不受5-FOA的影響，產(chǎn)生對(duì)尿嘧啶核苷的營養(yǎng)依賴性。對(duì)突變株的菌落形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)（400×）和生長速率進(jìn)行觀察，除了pyrG突變株菌體的正面顏色略有變淡外，菌落、分生孢子和閉囊殼的形態(tài)特征沒有較明顯的變化（圖6），說明pyrG基因變異未導(dǎo)致菌株出現(xiàn)很明顯的生長發(fā)育差異甚至畸形，推測pyrG基因可能對(duì)紅曲霉的次生代謝有影響。

圖6 部分突變株的菌落形態(tài)和顯微特征Fig. 6 Colony morphology and microscopic characteristics of partial mutant strains

2.5 突變株化學(xué)成分的含量變化

比較突變株與野生型主要化學(xué)成分的含量，結(jié)果顯示（圖7），培養(yǎng)基中添加尿嘧啶核苷的野生型比不添加的對(duì)照菌株中洛伐他汀和紅曲色素含量極顯著增加，桔霉素含量極顯著減少。可見，尿嘧啶核苷對(duì)紅曲霉的次生代謝有重要影響。當(dāng)在添加尿嘧啶核苷的培養(yǎng)條件下比較突變株與野生型菌株，結(jié)果顯示，洛伐他汀含量在9個(gè)變異株中均有增加（圖7-A）；紅曲色素含量在4個(gè)變異株中有增加，在5個(gè)菌株中不同程度減少，增減比較隨機(jī)（圖7-B）；桔霉素在7個(gè)變異株中顯著增加，另2個(gè)變異株的桔霉素含量未增反降（圖7-C）。因?yàn)槁宸ニ?、紅曲色素和桔霉素皆屬于聚酮類化合物，其主干代謝途徑較一致，代謝流之間相互關(guān)聯(lián)，因此pyrG基因變異造成的影響比較復(fù)雜。

圖7 培養(yǎng)基中添加尿嘧啶核苷對(duì)不同菌株化學(xué)成分含量的影響Fig. 7 Effect of uracil riboside on the chemical composition content of different strains in medium

3 討論

CRISPR/Cas 9是一種基因靶向修飾技術(shù)，通過sgRNA與靶向基因序列結(jié)合，引導(dǎo)Cas 9核酸內(nèi)切酶對(duì)靶序列進(jìn)行切割，然后細(xì)胞在DNA修復(fù)過程中產(chǎn)生的InDel導(dǎo)致目的基因移碼和功能缺失［22］。該技術(shù)作為一種簡單、快速的基因編輯工具［23］，主要通過Cas 9核酸酶和靶向sgRNA共同發(fā)揮作用，一般需要針對(duì)不同靶向序列設(shè)計(jì)和構(gòu)建Cas 9和不同sgRNA的共表達(dá)載體，再對(duì)真菌遺傳轉(zhuǎn)化才能實(shí)現(xiàn)基因的定向編輯，導(dǎo)致基因功能研究耗時(shí)費(fèi)力。如果有表達(dá)Cas 9的底盤菌株，研究基因功能時(shí)僅需導(dǎo)入不同的sgRNA即可實(shí)現(xiàn)各種基因的編輯目的，從而簡化實(shí)驗(yàn)。

本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化獲得了Cas 9組成型表達(dá)的紅曲霉底盤菌株，再把人工合成的pyrG基因靶向sgRNA通過PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化Cas 9底盤菌株原生質(zhì)體，構(gòu)建了體外sgRNA對(duì)紅曲霉Cas 9底盤菌株中pyrG基因的定向編輯。pyrG基因是尿嘧啶核苷合成中的關(guān)鍵酶，能把5-FOA轉(zhuǎn)化為有很強(qiáng)細(xì)胞毒性的 5-氟尿嘧啶核苷酸，從而抑制野生型菌株的生長［24］，因此pyrG突變后即獲得了5-FOA抗性，并對(duì)尿嘧啶核苷形成依賴。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，獲得的4株pyrG突變株能夠在添加5-FOA的培養(yǎng)基上正常生長，并且未出現(xiàn)明顯的生長發(fā)育差異，這樣突變株與生產(chǎn)用菌株的形態(tài)差異很小，比較容易被生產(chǎn)上接受。經(jīng)化學(xué)成分分析顯示，添加尿嘧啶核苷能夠顯著增加野生型紅曲霉的洛伐他汀和色素含量，同時(shí)顯著降低桔霉素含量，符合紅曲霉菌種對(duì)這3種成分的研發(fā)要求。

因pyrG突變會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源性尿嘧啶核苷的合成減少，理論上突變株將比野生型的洛伐他汀和紅曲色素含量減少，桔霉素含量增加。當(dāng)在添加尿嘧啶核苷的培養(yǎng)條件下比較突變型與野生型菌株，結(jié)果顯示：（1）洛伐他汀在9個(gè)變異株中均有增加，與推測結(jié)果相反，可能與添加20 g/L尿嘧啶核苷的劑量過高有關(guān)，導(dǎo)致突變株的洛伐他汀含量未減少，同時(shí)來自紅曲色素、桔霉素等其他聚酮類化合物的代謝流可能也有彌補(bǔ)作用。（2）紅曲色素含量在4個(gè)變異株中有增加，在5個(gè)菌株中不同程度減少，增減比較隨機(jī)?？紤]到紅曲色素包含安卡黃素、夢那紅、潘紅胺等多種組分，且易受光照等環(huán)境因素的影響，因此推測突變株中紅曲色素的含量變化與pyrG基因突變沒有很明顯的相關(guān)性。（3）桔霉素含量在7個(gè)變異株中顯著增加，與推測結(jié)果一致，但另外2個(gè)變異株的桔霉素含量未增反降，可能與sgRNA的非特異性打靶有關(guān)，另外，不同變異菌株之間的個(gè)體差異也會(huì)產(chǎn)生影響。因?yàn)槁宸ニ?、紅曲色素和桔霉素皆屬于聚酮類化合物，其主干代謝途徑較一致，代謝流之間存在相互聯(lián)系，而尿嘧啶核苷對(duì)三者的作用卻并不相同，因此推測尿嘧啶核苷對(duì)代謝流的影響可能發(fā)生在桔霉素的分支代謝途徑上，導(dǎo)致桔霉素減少時(shí)，增加了洛伐他汀的代謝流。

本研究成功構(gòu)建了體外sgRNA對(duì)紅曲霉Cas 9底盤菌株定向基因編輯的技術(shù)體系，并獲得pyrG突變株，為大量研究紅曲霉的基因功能奠定了基礎(chǔ)，也為研究其他真菌提供參考。補(bǔ)充尿嘧啶核苷能夠提高洛伐他汀和紅曲色素的含量，同時(shí)降低了桔霉素的含量，因此該研究對(duì)紅曲產(chǎn)品的生產(chǎn)有一定的指導(dǎo)價(jià)值。

4 結(jié)論

利用表達(dá)Cas 9的紅曲霉作為底盤菌株，通過原生質(zhì)體導(dǎo)入外源sgRNA可以實(shí)現(xiàn)快速基因編輯，為重復(fù)使用底盤菌株開展大規(guī)?；蜓芯刻峁┝思夹g(shù)參考。通過pyrG基因編輯發(fā)現(xiàn)，外源或內(nèi)源尿嘧啶核苷的含量變化對(duì)紅曲霉桔霉素的含量有較大影響。