袁存霞 李艷楠 張肖沖 楊瑞 劉建利，3 李靖宇，3

（1.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，銀川 750021；2.寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021；3.國(guó)家民委黃河流域農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)生態(tài)保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021）

快速的工業(yè)化進(jìn)程導(dǎo)致重金屬污染物大量排放到生態(tài)環(huán)境中，對(duì)人類、動(dòng)物、植物和微生物造成嚴(yán)重的危害，其危害程度取決于重金屬在環(huán)境、食品和生物體中的濃度和化學(xué)形態(tài)［1］。砷（arsenic，As）作為痕量類金屬元素，在自然環(huán)境中存在形式主要有無機(jī)形態(tài)砷酸鹽（As5+）、亞砷酸鹽（As3+），有機(jī)形態(tài)包括一甲基砷酸、二甲基砷酸、三甲基砷酸［2］，其中As3+的毒性和遷移能力比As5+更強(qiáng)，前者的毒性是后者的100倍。砷在土壤中可與鐵、磷、硫和硅等元素相互作用通過植物進(jìn)入食物鏈，作為磷酸鹽的結(jié)構(gòu)類似物，砷酸鹽和亞砷酸鹽分別通過抑制氧化磷酸化和對(duì)半胱氨酸殘基的巰基的親和力來發(fā)揮毒性作用，對(duì)人具有高度致癌性［3-4］。由于自然環(huán)境的變化和人類活動(dòng)的影響導(dǎo)致局部區(qū)域砷污染嚴(yán)重［5］。目前，對(duì)土壤砷污染的修復(fù)中微生物修復(fù)可通過自身的代謝對(duì)重金屬進(jìn)行積累，將高毒性的重金屬轉(zhuǎn)化為低毒性或無毒性的或?qū)χ亟饘龠M(jìn)行吸附等方式［6］，減少重金屬對(duì)土壤的污染的同時(shí)也具有節(jié)能環(huán)保的優(yōu)勢(shì)。

在自然界中對(duì)砷離子具有耐受性的微生物很多，其中包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）［4］、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和棘孢木霉（Trichoderma asperellum）［7］等，這些微生物可通過亞砷酸鹽氧化、砷酸鹽還原、亞砷酸鹽甲基化、亞砷酸鹽的外排、生物積累和吸附等耐受機(jī)制來適應(yīng)砷的脅迫［8］。微生物對(duì)砷的耐受機(jī)制與其在質(zhì)?；蛉旧w上的基因編碼或調(diào)控密切相關(guān)。其體內(nèi)砷相關(guān)基因主要分為抗性基因或新陳代謝基因［9］。砷氧化是將高毒性的As3+氧化為低毒性的As5+。微生物As3+氧化是微氧土壤和沉積物中砷固定化的重要地球化學(xué)過程，加速了砷濃度的衰減，并顯著控制了微氧條件下砷的行為，降低砷的遷移率，提高砷的固定效率［10］。砷還原的作用機(jī)理可以通過操縱子編碼的蛋白參與As3+解毒或者在還原過程中充當(dāng)最終的電子受體［11-12］。此外，微生物可分泌多糖、蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)組成胞外聚合物（EPS）等，通過-COOH、-NH2、-CH2、-OH和-C=O等官能團(tuán)的離子交換、氧化還原、絡(luò)合以及分子間的相互作用來吸附重金屬［13-14］。有研究表明，蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）在24 h時(shí)對(duì)砷的吸附率分別為（16.8±4.2）mg/g、（15.4±3.1）mg/g、（9.4±0.6）mg/g［15］。微生物對(duì)砷吸附能力的強(qiáng)弱與砷的轉(zhuǎn)化率有關(guān)［16］。

本研究選擇實(shí)驗(yàn)室先前從生物土壤結(jié)皮（biological soil crusts，BSCs）中篩選得到的對(duì)多種重金屬具有耐受性的Bacillus sp.ZJS3進(jìn)行研究，探究Bacillus sp.ZJS3對(duì)As3+的耐受機(jī)制，以期為砷污染的治理提供優(yōu)勢(shì)菌株和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料是采集自騰格里沙漠東南緣地區(qū)生物土壤結(jié)皮（藻結(jié)皮和蘚結(jié)皮），于-80℃冰箱保存的菌種。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母浸粉5 g。

硫酸溶液：在75 mL水中加入25 mL濃硫酸。

抗壞血酸溶液：將1 g抗壞血酸和0.5 g亞硫酸鈉溶于100 mL蒸餾水中。

1.2 方法

1.2.1 菌株砷耐受范圍及其生長(zhǎng)曲線測(cè)定 從-80℃冰箱取出保存菌種的甘油管，用接種環(huán)挑取菌落接種到LB瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)形成菌落，用無菌水沖洗斜面培養(yǎng)基，配制成200 mL菌懸液，培養(yǎng)24 h。查閱文獻(xiàn)［17］確定菌株ZJS3對(duì)砷的最低耐受濃度為100 mg/L，吸取0.2 mL菌懸液采用涂布法接種在不同As3+濃度梯度的LB固體培養(yǎng)基上，在30℃恒溫條件下培養(yǎng)2 d，觀察菌落是否生長(zhǎng)，進(jìn)一步確定As3+菌株最高耐受濃度。

選取As3+的濃度梯度為0 mg/L、100 mg/L、140mg/L、180 mg/L、220 mg/L、260 mg/L、300 mg/L，配制成LB液體培養(yǎng)基。將菌懸液以5%的接種量接種到培養(yǎng)基中，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，在恒溫30℃、轉(zhuǎn)速150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，每2 h用微量分光光度計(jì)測(cè)定其OD600，以空白LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.2.2 菌株最適生長(zhǎng)條件的單因素實(shí)驗(yàn) 控制As3+的濃度為最低耐受濃度100 mg/L。pH影響實(shí)驗(yàn)過程中，控制培養(yǎng)基pH分別為4.0、6.0、7.0、8.0、10.0，轉(zhuǎn)速為150 r/min，溫度為30℃；轉(zhuǎn)速影響實(shí)驗(yàn)過程中，控制轉(zhuǎn)速分別為50 r/min、100 r/min、150 r/min、200 r/min、250 r/min，pH為7.0，溫度為30℃；溫度影響實(shí)驗(yàn)過程中，控制培養(yǎng)溫度分別為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min，pH為7.0。配制成液體培養(yǎng)基，將菌懸液以5%的接種量接種到培養(yǎng)基中，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，在恒溫30℃、轉(zhuǎn)速150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，用微量分光光度計(jì)測(cè)定其OD600，以空白LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.2.3 As3+和Na+共同處理下菌株的生長(zhǎng) 設(shè)置As3+濃 度 為 100 mg/L、130 mg/L、160 mg/L、190 mg/L、220 mg/L、250 mg/L、280 mg/L、300 mg/L（分別標(biāo)記為As1-As8），及不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化鈉1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%（分別標(biāo)記為Na1-Na8），分別加入到錐形瓶中，配制成液體培養(yǎng)基，將菌懸液以5%的接種量接種到培養(yǎng)基中，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，在恒溫30℃、轉(zhuǎn)速200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，用微量分光光度計(jì)測(cè)定其OD600，以空白LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.2.4 菌株的氧化還原特性測(cè)定

1.2.4.1 定性硝酸銀（AgNO3）染色實(shí)驗(yàn)［18］根據(jù)菌株最低耐受濃度100 mg/L和最高耐受濃度300 mg/L，配制液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，以空白LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，將培養(yǎng)好的菌液和對(duì)照吸取到10 mL EP管中，向EP管中滴加0.1 mol/L AgNO3溶液，觀察其顏色的變化（Ag+與As3+反應(yīng)形成黃色沉淀，與As5+反應(yīng)形成深棕色沉淀）。

1.2.4.2 砷鉬藍(lán)法［19］測(cè)定砷含量及價(jià)態(tài) 選取As3+濃度為100 mg/L和300 mg/L，配制成液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的菌液分別移取10 mL經(jīng)100 mg/L及300 mg/L砷脅迫的菌液于200 mL容量瓶用蒸餾水稀釋至刻度。

As5+含量的測(cè)定（處理一）：分別量取稀釋后的菌液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，加2 mL硫酸溶液，加2 mL鉬酸銨（30 g/L）溶液，加1 mL抗壞血酸溶液。

總砷含量的測(cè)定（處理二）：分別量取稀釋后的菌液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，加2 mL硫酸溶液，滴加高錳酸鉀溶液（0.01 mol/L），使溶液滴定至微紅色，加2 mL鉬酸銨溶液，加1 mL抗壞血酸溶液。

將上述兩個(gè)處理在沸水浴中放置10 min，取出冷卻，用水定容至50 mL容量瓶中，搖勻。使用紫外分光光度計(jì)在OD620處，以蒸餾水為對(duì)照，測(cè)定溶液的吸光度，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

As3+含量的測(cè)定：總砷含量減去As5+含量剩余的即為As3+的含量。

1.2.5 活性氧（ROS）、抗氧化酶活性和丙二醛含量測(cè)定 培養(yǎng)As3+（140 mg/L、260 mg/L）處理和不加As3+處理的菌株。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算出稀釋1 mL菌株的數(shù)量，控制菌體數(shù)量一樣，用索萊寶（Solarbio）科技有限公司研發(fā)的活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒、丙二醛（MDA）含量檢測(cè)試劑盒和抗氧化酶活檢測(cè)試劑盒測(cè)定菌株的酶活性及含量。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，均用Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛）測(cè)定。

1.2.6 生物掃描電鏡（SEM）觀察 根據(jù)ZJS3對(duì)As3+的耐受范圍，選取0 mg/L、140 mg/L和260 mg/L三個(gè)濃度梯度進(jìn)行培養(yǎng)，將ZJS3及As3+脅迫的培養(yǎng)物，3 000 r/min離心后棄培養(yǎng)基，收集菌體沉淀于管底（黃豆大小），用磷酸緩沖液洗1-2次，棄掉上清液，沿管壁緩慢加入4℃預(yù)冷的固定液，然后放入4℃冰箱保存12 h以上，將樣品送至杭州研趣信息技術(shù)有限公司進(jìn)行掃描電鏡拍攝（SU8010）。

1.2.7 EPS中蛋白質(zhì)和多糖測(cè)定 通過加熱法提取 EPS［20］。培養(yǎng)含 As3+量 0 mg/L、100 mg/L、180 mg/L、220 mg/L的菌液，吸取10 mL菌液，放到溫度為80℃水浴鍋中保溫10 min左右。冷卻后用高速冷凍離心機(jī)（TGL 16MB）以9 000 r/min常溫離心20 min，吸取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.2.7.1 采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量［21］制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL各以水補(bǔ)至2 mL，然后加入1.0 mL的6%苯酚和5.0 mL濃硫酸，靜置10 min，搖勻，室溫放置20 min以后測(cè)定OD490，以2.0 mL的dH2O按同樣操作為空白，縱坐標(biāo)為吸光值，橫坐標(biāo)為多糖含量，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品多糖含量測(cè)定：準(zhǔn)確吸取樣品溶液2.0 mL按上述步驟同樣操作，測(cè)吸光值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

1.2.7.2 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量［21］制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL， 加 入 NaCl溶液補(bǔ)至1 mL，加入考馬斯亮藍(lán)試劑5 mL，搖勻，反應(yīng)5-10 min后，于OD595測(cè)定吸光值，以1 mL的NaCl溶液按同樣顯色操作作為空白，縱坐標(biāo)為吸光值，橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)含量，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品蛋白含量測(cè)定：準(zhǔn)確吸取樣品溶液1.0 mL按上述步驟同樣操作，測(cè)吸光值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

1.2.8 菌株的吸附特性 測(cè)定pH對(duì)菌株As3+吸附率的影響時(shí)，設(shè)置pH為4.0、6.0、7.0、8.0、10.0，保持加菌量為5%，As3+濃度為最低脅迫濃度；測(cè)定加菌量對(duì)菌株As3+吸附率的影響時(shí)，設(shè)置加菌量為1%、3%、5%、7%、10%，保持pH為最佳pH（即7.0），As3+濃度為最低脅迫濃度；測(cè)定As3+濃度對(duì)菌株As3+吸附率的影響時(shí)，設(shè)置As3+濃度梯度為 100 mg/L、140 mg/L、180 mg/L、260 mg/L、300 mg/L，保持加菌量為5%，pH為最佳pH（即7.0）。將菌液培養(yǎng)24 h后13 000 r/min，常溫離心10 min取上清液過濾，用于測(cè)定剩余As3+濃度。As3+的吸附率R和吸附量qe計(jì)算分別見式（1）和式（2）。

式中，c0為處理前水中原有As3+濃度（mg/L）；ce為處理后水中剩余As3+濃度（mg/L）；V為溶液體積（mL）；m為菌株質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果

2.1 菌株Bacillus sp.ZJS3的砷耐受范圍和生長(zhǎng)曲線

對(duì)菌株Bacillus sp.ZJS3進(jìn)行不同As3+濃度梯度的培養(yǎng)，最終得到該菌株對(duì)于As3+的耐受濃度范圍100-300 mg/L。菌株Bacillus sp.ZJS3在不同As3+濃度脅迫下的生長(zhǎng)曲線如圖1所示。與對(duì)照組相比，由于受到砷的脅迫，菌株的生長(zhǎng)數(shù)量始終比對(duì)照組低，且隨著砷濃度梯度的增大，菌株的生長(zhǎng)數(shù)量也隨著濃度的增大呈梯度降低的趨勢(shì)。砷濃度為100 mg/L，菌株在10 h時(shí)生長(zhǎng)數(shù)量達(dá)到一定值后，開始下降；在16 h時(shí)，菌株的數(shù)量出現(xiàn)回升且持續(xù)增長(zhǎng)。砷濃度為140 mg/L，菌株在12 h時(shí)生長(zhǎng)數(shù)量達(dá)到最大值。砷濃度為180 mg/L、220 mg/L，菌株在14 h和16 h時(shí)生長(zhǎng)數(shù)量達(dá)到最大值。砷濃度為260 mg/L和300 mg/L，菌株在24 h內(nèi)數(shù)量未達(dá)到最大值。

圖1 菌株Bacillus sp.ZJS3在不同As3+濃度脅迫下的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of strain Bacillus sp.ZJS3 under stress of different As3+ concentrations

2.2 菌株Bacillus sp.ZJS3較適宜生長(zhǎng)條件的確定

pH值、轉(zhuǎn)速、溫度對(duì)菌株Bacillus sp.ZJS3生長(zhǎng)的影響如圖2。pH=7.0時(shí)，菌株生長(zhǎng)的濃度顯著高于其他pH值下菌株的生長(zhǎng)濃度，因此在As3+脅迫下Bacillus sp.ZJS3更適合在中性條件下生長(zhǎng)且弱堿性條件下生長(zhǎng)較好。隨著轉(zhuǎn)速的增加，菌株濃度先下降后升高，在轉(zhuǎn)速為200 r/min和250 r/min時(shí)，菌株的濃度達(dá)到最高且差異不顯著，所以在As3+脅迫下Bacillus sp.ZJS3轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)生長(zhǎng)較好。隨著溫度值的上升，菌株濃度呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在溫度為30℃時(shí)菌株生長(zhǎng)濃度顯著高于其余溫度下菌株的生長(zhǎng)濃度，說明在As3+脅迫下Bacillus sp.ZJS3在30℃條件下生長(zhǎng)較好。

圖2 不同條件對(duì)As3+脅迫Bacillus sp.ZJS3生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of different conditions on the growth of Bacillus sp.ZJS3 under As3+ stress

2.3 As3+和Na+共同處理下菌株Bacillus sp.ZJS3的生長(zhǎng)

在 Na+（1%-8%）與 As3+（100 mg/L、130 mg/L、160 mg/L、190 mg/L、220 mg/L、250 mg/L、280 mg/L、300 mg/L編號(hào)為As1-As8）的共同脅迫下，低濃度的As3+和Na+脅迫下菌株的生長(zhǎng)數(shù)量與對(duì)照組相比無顯著性差異，并且隨著Na+濃度的增加，菌株的生長(zhǎng)數(shù)量逐漸降低。在As3+濃度為3（160 mg/L）和4（190 mg/L）時(shí)，與低濃度的Na+（1%-3%）共同脅迫下，菌株的生長(zhǎng)數(shù)量與對(duì)照組相比差異顯著，對(duì)菌株的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用；在高濃度As3+和Na+的脅迫下，對(duì)菌株生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用（圖3）。所以，在一定濃度As3+脅迫下，適當(dāng)?shù)脑黾覰a+的濃度，可以促進(jìn)菌株Bacillus sp.ZJS3生長(zhǎng)。

圖3 As3+和Na+共同脅迫下Bacillus sp.ZJS3的生長(zhǎng)Fig.3 Growth of Bacillus sp.ZJS3 under the combined stress of As3+ and Na+

2.4 菌株Bacillus sp.ZJS3的氧化還原特性

圖4中5個(gè)EP管中最左邊為對(duì)照組（不加菌），右邊4個(gè)均為樣本組（加菌）。向砷濃度為100 mg/L和300 mg/L的EP管中滴加硝酸銀，觀察到溶液逐漸由黃色變?yōu)樯钭厣?，說明溶液中含有As5+。

圖4 定性硝酸銀（AgNO3）染色Fig.4 Qualitative silver nitrate（AgNO3）staining

砷鉬藍(lán)法測(cè)定溶液中不同價(jià)態(tài)砷含量的結(jié)果表明，隨著時(shí)間的增加As3+含量逐漸降低，而As5+含量逐漸升高（圖5）。A、B是在100 mg/L As3+脅迫下24 h和48 h測(cè)得的溶液中As3+、As5+和總砷的含量；C、D是在300 mg/L As3+脅迫下24 h和48 h測(cè)得的溶液中As3+、As5+和總砷的含量。硝酸銀（AgNO3）染色和砷鉬藍(lán)法測(cè)定結(jié)果表明菌株Bacillus sp.ZJS3具有氧化還原的能力。

圖5 砷鉬藍(lán)法測(cè)定砷含量Fig.5 Determination of arsenic content by arseno-molybdenum blue method

2.5 活性氧（ROS）、抗氧化酶活和MDA含量測(cè)定

ROS為氧的正常代謝的天然副產(chǎn)物，主要來源于氧的自由基和非自由基。Bacillus sp.ZJS3胞內(nèi)ROS的含量在高濃度As3+的脅迫逐漸降低，在較低濃度下ROS含量可能會(huì)升高（圖6）。細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶可以有效的避免細(xì)胞內(nèi)活性氧和過氧化氫等對(duì)細(xì)胞的影響。隨著As3+濃度的增加，與對(duì)照組相比，過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性和MDA整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，MDA含量的升高證明了細(xì)胞膜發(fā)生了脂質(zhì)過氧化（圖7）。

圖6 As3+脅迫下Bacillus sp.ZJS3胞內(nèi)的ROS含量Fig.6 Content of ROS in Bacillus sp.ZJS3 cell under As3+stress

圖7 As3+脅迫對(duì)Bacillus sp.ZJS3的抗氧化酶活及MDA含量的影響Fig.7 Effects of As3+ stress on the antioxidant enzyme activity and MDA content of Bacillus sp.ZJS3

2.6 生物掃描電鏡（SEM）

在未受砷脅迫時(shí)，ZJS3的形態(tài)呈現(xiàn)粗短狀，且細(xì)胞表面附著褶皺（圖8-A）。隨著砷脅迫程度的增強(qiáng)，ZJS3細(xì)胞表面的物質(zhì)逐漸增多，菌體表面變得略光滑，菌體形狀呈現(xiàn)變長(zhǎng)的狀態(tài)，且表面出現(xiàn)一層顆粒狀的物質(zhì)（圖8-B、C）。可能是由于砷代謝過程中，某個(gè)基因的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞膜表面變長(zhǎng)，也可能是有砷吸附在細(xì)胞膜的表面，因此需要對(duì)Bacillus sp.ZJS3對(duì)砷的耐受機(jī)制需要進(jìn)一步研究確定。

圖8 不同As3+濃度脅迫下Bacillus sp.ZJS3的掃描電鏡圖Fig.8 SEM of Bacillus sp.ZJS3 under different As3+ stress

2.7 菌株Bacillus sp.ZJS3 EPS的蛋白質(zhì)和多糖測(cè)定

在0 mg/L、100 mg/L、180 mg/L、220 mg/L的砷濃度的脅迫下菌體胞外多糖的含量隨著砷濃度的增加顯著增大，這說明可溶性多糖可能螯合砷離子，阻止砷離子靠近細(xì)胞減少砷離子對(duì)菌株的危害（圖9-A）；而菌體胞內(nèi)蛋白質(zhì)的含量隨著砷離子濃度的增加先升高后降低，低濃度的砷脅迫可以誘導(dǎo)細(xì)胞合成大量的蛋白質(zhì)來抵抗砷脅迫，隨著砷濃度的增加，對(duì)細(xì)胞合成蛋白質(zhì)產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的含量下降（圖9-B）。

圖9 As3+脅迫下菌株Bacillus sp.ZJS3 EPS中多糖和蛋白質(zhì)的含量Fig.9 Contents of polysaccharides and proteins in EPS of Bacillus sp.ZJS3 under As3+ stress

2.8 菌株的吸附特性

在pH=7.0時(shí)，吸附率達(dá)到最高25.00%，吸附量為3.23 mg/g（圖10-A）；在砷濃度為100 mg/L、pH=6.0、接菌量為1%時(shí)，菌株的吸附率為23.63%，吸附量為3.06 mg/g；pH=6.0，接菌量為5%時(shí)，隨著砷離子濃度的增加，菌株的吸附率先升高后降低（圖10-B）；在砷濃度為100 mg/L、接菌量為5%時(shí)，Bacillus sp.ZJS3對(duì)As3+的吸附率隨著pH的升高先上升后降低（圖10-C）。因此，影響ZJS3吸附率的最適pH值為7。

圖10 不同條件下ZJS3對(duì)As3+的吸附率Fig.10 Adsorption rates of As3+ by ZJS3 under different conditions

3 討論

谷氨酸棒桿菌MTCC 2745［22］能夠在砷濃度為1 000 mg/L的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，菌株Bacillus sp.ZJS3對(duì)As3+的最高耐受濃度與的谷氨酸棒桿菌MTCC 2745耐受濃度相比，菌株Bacillus sp.ZJS3的耐受濃度較低。芽孢桿菌具有較厚的細(xì)胞壁，可以通過自身的耐鹽基因的調(diào)節(jié)增強(qiáng)耐鹽性，不會(huì)因脫水而死亡［23］。有關(guān)研究表明，與單獨(dú)砷相比，砷和鹽共同處理下植物的葉、莖和根中砷的積累減少，在高砷脅迫條件下，鹽提高了As的耐性指數(shù)［24］。結(jié)果表明，在低濃度的As3+和Na+共同處理的條件下，與對(duì)照組相比，菌株生長(zhǎng)的更好，可能是由于低濃度的鹽，減少了砷離子在菌株體內(nèi)的積累，提高了砷離子的耐性，所以低濃度的鹽脅迫可以緩解As3+對(duì)Bacillus sp.ZJS3菌體的毒害。細(xì)菌在長(zhǎng)期的砷環(huán)境下生存，逐漸進(jìn)化形成某種機(jī)制來減少砷離子對(duì)菌株的毒害，以便修復(fù)環(huán)境中的砷污染，砷污染的修復(fù)一般有As3+氧化、As5+還原、砷的甲基化、吸附和沉淀等方式［25］。本研究中篩選到的Bacillus sp.ZJS3是一種As3+氧化細(xì)菌，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，比較適宜的培養(yǎng)條件pH為7.0、轉(zhuǎn)速為200 r/min、溫度為30℃。在24 h內(nèi)低濃度砷脅迫下，生長(zhǎng)濃度是先升高后降低再升高。剛開始升高是由于多糖螯合As3+，菌體產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)來抵抗砷脅迫，減少了As3+對(duì)菌體的毒害作用［26］，但多糖只能螯合部分As3+，隨著濃度的增大，As3+對(duì)菌株產(chǎn)生毒害作用加劇，Bacillus sp.ZJS3可以將As3+氧化為As5+，降低了砷離子的毒性，菌株生長(zhǎng)濃度再次升高。

為探究該菌體是否對(duì)砷離子具有吸附特性，本研究對(duì)含有As3+和含有不同濃度的As3+的菌液拍攝了生物掃描電鏡（SEM），與對(duì)照組相比，As3+處理過得菌體變長(zhǎng)，且隨著As3+濃度越高菌體表面出現(xiàn)顆粒狀的物質(zhì)逐漸增多。通過吸附率的測(cè)定，該菌株具有一定的吸附特性，但對(duì)砷離子的吸附率較低。相對(duì)于吸附率較高的菌株A4［17］，其菌體表面褶皺明顯增多，且團(tuán)粒結(jié)構(gòu)變大，與該菌株形態(tài)有所差別，可能是由于菌株的將As3+氧化成As5+毒性變低且吸附率較低的原因。由于細(xì)胞吸附金屬離子主要靠靜電吸引、離子交換和表面絡(luò)合的方式進(jìn)行吸附，當(dāng)濃度達(dá)到一定值時(shí)，吸附位點(diǎn)飽和，吸附率會(huì)逐漸降低［27］。本研究中pH影響吸附率實(shí)驗(yàn)表明，較低的pH值，會(huì)促進(jìn)細(xì)胞壁與水合氫離子結(jié)合，占據(jù)吸附活性位點(diǎn)，增加細(xì)胞表面的靜電斥力，阻止金屬離子與細(xì)胞壁結(jié)合［28］；較高的pH，會(huì)使細(xì)胞的生長(zhǎng)和活性都受到影響，pH越高，溶液中會(huì)產(chǎn)生沉淀覆蓋在細(xì)胞表面，吸附作用受到抑制。

微生物在重金屬或其他極端條件的脅迫下，會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS（單線態(tài)氧、超氧陰離子、過氧化氫和羥基自由基），但過量的ROS會(huì)對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生危害作用，可以通過SOD、CAT、POD共同作用來改變酶的活性來調(diào)節(jié)體內(nèi)活性氧自由基的平衡，促進(jìn)抗氧化酶的活性升高［29］。MDA含量是反映機(jī)體抗氧化潛在能力的重要參數(shù)。本研究中ROS含量隨著As3+濃度升高而降低，與大腸桿菌MG1655所測(cè)得的結(jié)果一致［30］，但大腸桿菌MG1655是由于Mn-SOD酶在抗重金屬脅迫中起重要作用，本研究中可能是由于SOD、CAT、POD對(duì)活性氧的有效去除或者自由基通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)形成了MDA，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)MDA含量升高，有關(guān)代謝通路的分析，還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究篩選到的菌株對(duì)As3+具有一定的耐受性且有較低的吸附性，能把As3+氧化成As5+，可以減少對(duì)土壤的危害，為低濃度As3+土壤污染微生物治理提供理論基礎(chǔ)。