牛宇輝 李向茸 吳貝 李洪珊 李殿玉 陳磊 魏鎖成馮若飛

（1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030）

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是一種在人體內(nèi)帶負(fù)電荷的由585個(gè)氨基酸組成的單鏈非糖基化的可溶性蛋白單體，分子量為66.5 kD［1］，為人血漿中含量最多、分子較小、溶解度大、功能較多的一種蛋白質(zhì)。HSA的三級(jí)結(jié)構(gòu)由Domain-I、Domain-II和Domain-III三個(gè)結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域均由2個(gè)含有4-6個(gè)α-螺旋的亞結(jié)構(gòu)域組成，6個(gè)亞結(jié)構(gòu)域聚合形成一個(gè)不中心對(duì)稱的心型分子結(jié)構(gòu)［2-3］。HSA在人體內(nèi)的主要作用是維持血漿膠體滲透壓及總蛋白水平，人血白蛋白制劑當(dāng)前廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)和生物制藥等領(lǐng)域，其中臨床上主要用于治療休克、水腫和作為血漿容量擴(kuò)充劑等；生物制劑領(lǐng)域常常被用作疫苗保護(hù)劑和無(wú)血清培養(yǎng)基添加劑等［4-6］。目前我國(guó)商品化的HSA主要是從人血漿或胎盤血中通過(guò)低溫乙醇法或柱層析法進(jìn)行提取制備的。其不足之處主要有兩點(diǎn)：（1）血漿來(lái)源有限，市場(chǎng)供應(yīng)緊張；（2）可能增加血源性傳染疾病的擴(kuò)散，如艾滋病、肝炎［7-8］。與之相比，采用基因工程生產(chǎn)的重組人血清白蛋白（recombinant human serum albumin，rHSA）其優(yōu)點(diǎn)主要有生物活性與天然的HSA相同，還兼具可大規(guī)模生產(chǎn)，來(lái)源不易受病原體污染等多種優(yōu)點(diǎn)［9-11］，因此，rHSA市場(chǎng)蘊(yùn)含著巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

葡萄糖作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中的重要的碳源物質(zhì)，在CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)添加葡萄糖可以顯著提高活細(xì)胞密度和外源蛋白表達(dá)量［12］。但葡萄糖會(huì)通過(guò)糖酵解代謝產(chǎn)生乳酸，乳酸又會(huì)通過(guò)影響pH進(jìn)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)，故常見(jiàn)的CHO細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度一般控制在5.0-7.0 g/L左右。丁酸鹽作為一種小分子短鏈脂肪酸可以提高細(xì)胞中多種外源蛋白的表達(dá)量，如人促紅細(xì)胞生成素［13］、嵌合抗體等［14］，依據(jù)其脂肪酸特性還可誘導(dǎo)腸道抗菌肽的產(chǎn)生［15］。有研究表明，丁酸鈉可通過(guò)延緩細(xì)胞周期來(lái)提高外源蛋白表達(dá)量，但同時(shí)也抑制細(xì)胞生長(zhǎng)［16-17］。本實(shí)驗(yàn)以表達(dá)重組人血清白蛋白的CHO-rHSA工程細(xì)胞株為研究對(duì)象，考察培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖及丁酸鈉對(duì)rHSA產(chǎn)量的影響，并優(yōu)選出利于rHSA表達(dá)的最佳葡萄糖及丁酸鈉組合方案，為藥用輔料級(jí)及獸用生物制品中重組人血清白蛋白的工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用表達(dá)重組人血清白蛋白的全懸浮單克隆CHO工程細(xì)胞株CHO-rHSA由西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心提供。SFM4CHO培養(yǎng)基購(gòu)自Cytiva（原Hyclone公司）；HRP標(biāo)記的抗人血清白蛋白抗體（ab24438）及Human Albumin ELISA Ki（tab108788）購(gòu)自Abcam公司；無(wú)水葡萄糖購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丁酸鈉（NaBu）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖對(duì)CHO-rHSA細(xì)胞生長(zhǎng)及rHSA表達(dá)量的影響 復(fù)蘇1支CHO工程細(xì)胞株CHO-rHSA，迅速離心后棄去上清，將細(xì)胞加入至SFM4CHO培養(yǎng)基中，隨后置于37℃、5% CO2搖床中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120 r/min。待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，以0.5×106cells/mL的密度接種至125 mL搖瓶中，培養(yǎng)體積為50 mL，培養(yǎng)條件同上。之后從第4天開(kāi)始每天測(cè)定其活細(xì)胞密度、細(xì)胞活力及培養(yǎng)基中的葡萄糖含量。待培養(yǎng)基中葡萄糖含量降低至2.0或3.0 g/L時(shí)，添加葡萄糖至終濃度為5.0或7.0 g/L，以不添加葡萄糖組作為對(duì)照，具體補(bǔ)糖策略見(jiàn)表1。直到培養(yǎng)第14天或細(xì)胞活力降至60%以下時(shí)收獲細(xì)胞懸浮液，離心后收集上清，采用Western Blot或ELISA檢測(cè)上清中rHSA的含量。

表1 不同的補(bǔ)糖策略Table 1 Different strategies for supplementing glucose

1.2.2 丁酸鈉對(duì)CHO-rHSA細(xì)胞生長(zhǎng)及rHSA表達(dá)量的影響 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CHO-rHSA細(xì)胞以1.0×106cells/mL的密度傳代，培養(yǎng)體積為50 mL，置37℃、5% CO2搖床中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120 r/min。傳代時(shí)SFM4CHO培養(yǎng)基中加入不同濃度的丁酸鈉（1.0、2.0及3.0 mmol/L），以不添加丁酸鈉組作為對(duì)照。從第4天開(kāi)始每天測(cè)定其活細(xì)胞密度、細(xì)胞活力及培養(yǎng)基中的葡萄糖含量，待培養(yǎng)至第14天或活力降至60%以下收獲細(xì)胞懸浮液，離心后收集上清，采用Western Blot及ELISA檢測(cè)上清中rHSA的含量。

1.2.3 葡萄糖及丁酸鈉組合使用對(duì)CHO-rHSA細(xì)胞生長(zhǎng)及rHSA表達(dá)量的影響 為進(jìn)一步驗(yàn)證葡萄糖和丁酸鈉同時(shí)加入對(duì)rHSA表達(dá)量的影響，最大限度地提高工程細(xì)胞株CHO-rHSA生長(zhǎng)密度及rHSA表達(dá)量。我們選擇1.2.1和1.2.2單因素實(shí)驗(yàn)篩選出的葡萄糖添加策略同丁酸鈉濃度進(jìn)行兩因素組合作用分析。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CHO-rHSA細(xì)胞以1.0×106cells/mL的密度傳代，培養(yǎng)體積為50 mL，置37℃、5% CO2搖床中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120 r/min。傳代時(shí)SFM4CHO培養(yǎng)基中分別加入兩種濃度的丁酸鈉，同時(shí)以篩選出兩種補(bǔ)糖策略進(jìn)行補(bǔ)糖，以不添加丁酸鈉和葡萄糖組作為對(duì)照。從第4天開(kāi)始每天測(cè)定其活細(xì)胞密度、細(xì)胞活力及培養(yǎng)基中的葡萄糖含量，待培養(yǎng)至第14天或活力降至60%以下時(shí)收獲細(xì)胞懸液，離心后收集上清，采用Western Blot及ELISA檢測(cè)上清中rHSA的含量。

1.2.4 不同時(shí)間段添加丁酸鈉對(duì)CHO-rHSA細(xì)胞生長(zhǎng)及rHSA表達(dá)量的影響 為了進(jìn)一步考察丁酸鈉加入時(shí)間對(duì)CHO-rHSA生長(zhǎng)及rHSA表達(dá)量的影響，在細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h和72 h分別加入1.2.3篩選出的最佳的丁酸鈉濃度和葡萄糖添加策略進(jìn)行組合培養(yǎng)。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CHO-rHSA細(xì)胞以1.0×106cells/mL的密度傳代，培養(yǎng)體積為50 mL，置37℃、5% CO2搖床中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120 r/min。分別在24 h、48 h和72 h向培養(yǎng)基中加入1.2.3篩選出丁酸鈉濃度以及相應(yīng)補(bǔ)糖策略進(jìn)行培養(yǎng)。從第4天開(kāi)始每天測(cè)定其活細(xì)胞密度、細(xì)胞活力及培養(yǎng)基中的葡萄糖含量，待培養(yǎng)至第14天或活力降至60%以下時(shí)收獲細(xì)胞懸液，離心后收集上清，采用Western Blot及ELISA檢測(cè)上清中rHSA的含量。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.0軟件作圖，利用單因素分析ANOVA或t檢驗(yàn)法計(jì)算各組數(shù)據(jù)間顯著性差異。數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，P 值用星號(hào)表示，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001。

2 結(jié)果

2.1 不同補(bǔ)糖策略對(duì)CHO-rHSA細(xì)胞生長(zhǎng)及rHSA表達(dá)量的影響

單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加葡萄糖組工程細(xì)胞株CHO-rHSA的最高活細(xì)胞密度和rHSA表達(dá)量均高于對(duì)照組，且各補(bǔ)糖組細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間與對(duì)照組相比明顯延長(zhǎng)（圖1-A和D），表明補(bǔ)糖對(duì)CHO-rHSA細(xì)胞生長(zhǎng)和rHSA表達(dá)均具有一定的促進(jìn)作用。而對(duì)照組細(xì)胞中的葡萄糖濃度從第4天開(kāi)始持續(xù)降低，活細(xì)胞密度和活力在培養(yǎng)至第8天后急劇下降（圖1-A-C），這可能是由于培養(yǎng)基中的葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡及代謝產(chǎn)物累積太多所致。不同補(bǔ)糖策略下CHO-rHSA細(xì)胞的活細(xì)胞密度與細(xì)胞活力相差不大（圖1-A和B），其中補(bǔ)糖方案為3.0→7.0 g/L時(shí)，rHSA表達(dá)量為36.467 mg/L，與對(duì)照組（rHSA表達(dá)量為16.432 mg/L）相比平均提高了121.93%（圖1-D）。綜合考慮，選擇補(bǔ)糖方案為3.0→5.0 g/L和3.0→7.0 g/L進(jìn)行后續(xù)葡萄糖同丁酸鈉兩因素組合作用分析。

圖1 不同的補(bǔ)糖策略對(duì)CHO-rHSA細(xì)胞生長(zhǎng)及rHSA產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of different glucose supplementation strategies on the growth of CHO-rHSA cells and the yield of rHSA

2.2 不同濃度丁酸鈉對(duì)CHO-rHSA細(xì)胞生長(zhǎng)及rHSA表達(dá)量的影響

結(jié)合已有研究，本文選擇了1.0 mmol/L、2.0 mmol/L和3.0 mmol/L NaBu濃度來(lái)進(jìn)行初篩，以選擇一個(gè)適宜的濃度來(lái)最大限度地提高rHSA的產(chǎn)量。結(jié)果顯示，加入不同濃度NaBu后工程細(xì)胞株CHO-rHSA的活細(xì)胞密度和細(xì)胞活力均低于對(duì)照組，且隨著NaBu濃度的增加，最大活細(xì)胞密度逐漸下降，說(shuō)明高濃度的NaBu對(duì)CHO-rHSA細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定的抑制作用（圖2-A-C）。但3種濃度的NaBu均能顯著提高rHSA的表達(dá)（圖2-D-F），但因考慮到NaBu濃度為3.0 mmol/L時(shí)活細(xì)胞密度的下降尤為顯著，綜合考慮后選擇NaBu濃度為1.0 mmol/L和2.0 mmol/L進(jìn)行接下來(lái)的兩因素組合試驗(yàn)。

圖2 不同濃度丁酸鈉對(duì)CHO-rHSA細(xì)胞生長(zhǎng)及rHSA產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of sodium butyrate on the growth of CHO-rHSA cells and the yield of rHSA

2.3 葡萄糖及丁酸鈉組合培養(yǎng)對(duì)CHO-rHSA細(xì)胞生長(zhǎng)及rHSA表達(dá)量的影響

利用2.1和2.2單因素試驗(yàn)篩選出的補(bǔ)糖方案（3.0→5.0 g/L和3.0→7.0 g/L）和NaBu濃度（1.0 mmol/L NaBu和2.0 mmol/L NaBu）進(jìn)行兩因素組合分析，以驗(yàn)證不同濃度的葡萄糖和丁酸鈉組合培養(yǎng)對(duì)CHO-rHSA細(xì)胞生長(zhǎng)及rHSA表達(dá)的影響，確定最佳的培養(yǎng)方案，為后期補(bǔ)料及生物反應(yīng)器培養(yǎng)優(yōu)化夯實(shí)基礎(chǔ)。兩因素組合作用結(jié)果顯示，丁酸鈉和葡萄糖組合使用可使CHO-rHSA工程細(xì)胞株培養(yǎng)時(shí)間從7 d左右延長(zhǎng)到14 d左右（圖3-A-C），并且顯著地提高rHSA表達(dá)（圖3-D-F）。說(shuō)明不同的葡萄糖和丁酸鈉組合方案均能明顯延長(zhǎng)CHO-rHSA細(xì)胞培養(yǎng)周期及提高rHSA表達(dá)量。綜合考慮活細(xì)胞密度和rHSA表達(dá)水平，選擇3.0→7.0 g/L的補(bǔ)糖方案與1.0 mmol/L NaBu濃度進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)，但由于該組合培養(yǎng)中的最高活細(xì)胞密度僅達(dá)8.154×106cells/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組的最高活細(xì)胞密度10.783×106cells/mL（圖3-A），推測(cè)可能是由于添加丁酸鈉的時(shí)間不同所引起的，故接下來(lái)進(jìn)行了不同時(shí)間段添加丁酸鈉及補(bǔ)糖實(shí)驗(yàn)。

圖3 葡萄糖及丁酸鈉組合培養(yǎng)對(duì)CHO-rHSA細(xì)胞生長(zhǎng)及rHSA產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of combined culture of glucose and sodium butyrate on the growth of CHO-rHSA cells and the yield of rHSA

2.4 不同時(shí)間段添加丁酸鈉對(duì)CHO-rHSA細(xì)胞生長(zhǎng)及rHSA表達(dá)量的影響

為了進(jìn)一步考察丁酸鈉加入時(shí)間對(duì)CHO-rHSA細(xì)胞生長(zhǎng)及rHSA表達(dá)量的影響，在細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h和72 h分別加入1.0 mmol/L丁酸鈉，同時(shí)選擇上述優(yōu)化得到的葡萄糖添加策略3.0→7.0 g/L進(jìn)行組合培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)第24小時(shí)加入丁酸鈉細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最佳（圖4-A-C），最大活細(xì)胞密度與同期對(duì)照組相差無(wú)幾，可達(dá)10.213×106cells/mL，rHSA表達(dá)量為74.616 mg/L（圖4-F），比對(duì)照組平均提高了172.26%；但第48小時(shí)加入丁酸鈉CHO-rHSA細(xì)胞的最大活細(xì)胞密度僅為8.025×106cells/mL（圖4-A），但rHSA表達(dá)量是目前本工程細(xì)胞株能達(dá)到的最高表達(dá)量，為85.642 mg/L（圖4-D），比同期對(duì)照組平均提高了212.49%，比單獨(dú)添加葡萄糖平均提高了134.85%，比單獨(dú)添加丁酸鈉平均提高了88.35%。以上結(jié)果表明，丁酸鈉添加時(shí)間對(duì)提高rHSA表達(dá)量也顯得尤為重要。綜上，確定待細(xì)胞培養(yǎng)48 h 時(shí)添加1.0 mmol/L NaBu和補(bǔ)糖方案為3.0→7.0 g/L是利于CHO-rHSA工程細(xì)胞生長(zhǎng)和rHSA表達(dá)的最佳條件，這為后期進(jìn)一步優(yōu)化及生物反應(yīng)器培養(yǎng)提供數(shù)據(jù)支持。

圖4 不同時(shí)間段添加丁酸鈉對(duì)CHO-rHSA細(xì)胞生長(zhǎng)及rHSA產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of adding time of sodium butyrate on the growth of CHO-rHSA cells and the yield of rHSA

3 討論

目前我國(guó)臨床使用的HSA 來(lái)源十分有限，HSA作為臨床醫(yī)學(xué)及生物制藥領(lǐng)域重要的藥物和原輔料，需求量逐年上升［7，18］。因此利用基因工程方法大規(guī)模生產(chǎn)rHSA即可解燃眉之急。由于研發(fā)成本過(guò)高，國(guó)內(nèi)大多數(shù)研究只限于實(shí)驗(yàn)室水平，試制產(chǎn)品純度不高，華北制藥集團(tuán)采用酵母表達(dá)人血清白蛋白取得了一定的進(jìn)展，并開(kāi)發(fā)了高鹽陽(yáng)離子捕獲為特征的純化工藝，但酵母表達(dá)重組白蛋白在天然修飾方面始終劣于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)［19-20］。而CHO細(xì)胞相對(duì)于酵母和大腸桿菌而言是很好的表達(dá)細(xì)胞系，其表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)功能等方面與天然蛋白更接近，重組乙肝疫苗、注射用重組人促紅細(xì)胞生成素等產(chǎn)品均利用CHO細(xì)胞表達(dá)平臺(tái)［21］。因此，用無(wú)血清懸浮的CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)HSA相對(duì)于酵母菌和大腸桿菌等而言是更好的表達(dá)細(xì)胞系統(tǒng)，能夠準(zhǔn)確的進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾，天然修飾方面更具優(yōu)勢(shì)，同時(shí)還具有培養(yǎng)基化學(xué)組分明確、無(wú)血清成分、易于工業(yè)化放大等優(yōu)點(diǎn)，并且自身分泌的內(nèi)源性蛋白較少，更加有利于外源蛋白的分離純化，從而使CHO表達(dá)的rHSA更具市場(chǎng)潛力。

本文研究了在CHO-rHSA細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加丁酸鈉及葡萄糖對(duì)rHSA產(chǎn)量的影響。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄糖可明顯促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)第3天開(kāi)始，每48 h添加終濃度為7 g/L的葡萄糖，可使rHSA產(chǎn)量顯著增加；同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)第48小時(shí)時(shí)加入終濃度為1.0 mmol/L的丁酸鈉對(duì)rHSA的表達(dá)量提高最為明顯。已有文獻(xiàn)表明，丁酸鈉對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的抑制作用，會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但同時(shí)它也可促進(jìn)與DNA結(jié)合的組蛋白的乙?；δ軓亩哂酗@著提高重組蛋白表達(dá)的能力［22-24］。本試驗(yàn)通過(guò)添加葡萄糖來(lái)彌補(bǔ)丁酸鈉對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的毒副作用，葡萄糖又對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，最終提高重組蛋白產(chǎn)量。因此，探究丁酸鈉與葡萄糖之間平衡的點(diǎn)顯得尤為重要，同時(shí)丁酸鈉及葡萄糖在本試驗(yàn)中對(duì)細(xì)胞作用的具體機(jī)制及作用比重仍有待研究。本研究采用葡萄糖和丁酸鈉聯(lián)合應(yīng)用可把CHO-rHSA工程細(xì)胞株培養(yǎng)時(shí)間從7 d左右延長(zhǎng)到14 d左右。葡萄糖的加入明顯減弱了丁酸鈉對(duì)CHO-rHSA細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，葡萄糖和丁酸鈉組合使用可更高效表達(dá)外源蛋白，與對(duì)照組相比表達(dá)量平均提高了212.49%。當(dāng)然接下來(lái)的生物反應(yīng)器還有一系列培養(yǎng)條件如pH、溶氧以及攪拌轉(zhuǎn)速等參數(shù)需要進(jìn)一步優(yōu)化，因此對(duì)于工藝條件的不斷優(yōu)化是我們下一步探索的方向。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)考察不同補(bǔ)糖策略、不同濃度丁酸鈉、葡萄糖及丁酸鈉組合培養(yǎng)與丁酸鈉的添加時(shí)間對(duì)CHO-rHSA細(xì)胞生長(zhǎng)及rHSA產(chǎn)量的影響，確定待細(xì)胞培養(yǎng)48 h 時(shí)添加1.0 mmol/L NaBu和補(bǔ)糖方案為3.0→7.0 g/L是利于CHO-rHSA細(xì)胞生長(zhǎng)及rHSA表達(dá)的最優(yōu)條件，為接下來(lái)的補(bǔ)料培養(yǎng)及生物反應(yīng)器培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。