王光麗 范嬋 王輝 盧惠芳 夏靈尹 黃健 閔迅

（1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，遵義 563003；2.遵義醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院，遵義 563003）

非O1/非O139群霍亂弧菌是指除O1群和O139群霍亂弧菌以外的其他霍亂弧菌的總稱，可引起局部范圍內(nèi)的或零星的霍亂樣腹瀉疾病，常表現(xiàn)為輕度和短暫的胃腸道感染［1］。此外，非O1/非O139群霍亂弧菌還可引起腸道外感染，表現(xiàn)為敗血癥［2-4］、皮膚和軟組織感染［5］、腦膜炎［6］、細菌性肺氣腫［7］、甚至致人死亡［8-9］。本課題組前期也從兩例膿毒血癥患者中分離到兩株非O1/非O139群霍亂弧菌，其中一例導(dǎo)致患者死亡［10］。近年來關(guān)于非O1/非O139群霍亂弧菌感染的病例報道越來越多［11］，但人們對其致病機制知之甚少。因此，對非O1/非O139群霍亂弧菌生物學(xué)特性及致病性的研究具有重要價值。

霍亂弧菌溶血素（hemolysin，HlyA）是一種細胞外成孔毒素［12-13］，主要由霍亂弧菌El Tor生物型和大多數(shù)非O1/非O139群菌株分泌［14-16］。HlyA可在靶細胞膜上形成跨膜寡聚β-桶狀孔導(dǎo)致細胞膜通透性增加［12-13］?；魜y弧菌HlyA對包括Caco-2細胞（人結(jié)直腸腺癌細胞）在內(nèi)的多種細胞系具有空泡化［17］和殺細胞活性［17-18］。HlyA還能誘導(dǎo)Caco-2細胞凋亡［1，19］。純化的HlyA能夠在兔結(jié)扎腸環(huán)模型、幼兔模型和乳鼠模型中誘導(dǎo)大量的腸液積聚［20-22］。與CT毒素誘導(dǎo)的水樣腹瀉不同，HlyA誘導(dǎo)的腹瀉呈血性黏液樣［23］。此外，在自然水生棲息環(huán)境中，非O1/非O139群霍亂弧菌通過分泌HlyA抑制或殺死異源細菌，獲得局部生態(tài)環(huán)境的競爭優(yōu)勢［2］。因其強大的細胞殺傷活性，HlyA被認為在霍亂弧菌致病過程中起著關(guān)鍵作用，特別是在缺乏霍亂CT毒素的菌株中。在非O1/非O139群霍亂弧菌中HlyA的調(diào)控和致病機制目前還知之甚少。本研究擬通過原核表達系統(tǒng)表達純化HlyA蛋白，并制備其多克隆抗體，為后續(xù)研究HlyA致病與調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 非O1/非O139群霍亂弧菌HN375（中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCCAB2010-414）、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5a 和 BL21（DE3）菌株及pET28a、pET32a、pCold TF質(zhì)粒為本課題組保存。

1.1.2 實驗動物 BALB /c小鼠（SPF級，6-8周，雌性）購自國家齲齒類動物實驗中心。

1.1.3 主要試劑 蛋白質(zhì)Maker、DL2000 DNA Maker、DL5000 DNA Maker、T4 DNA 連 接 酶、Primer Star高保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA純化試劑盒購自TaKaRa公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京天根公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗鼠抗體購自Proteintech公司；Ni-NTA親和層析柱購自美國GE Healthcare 公司；Omni-ECLTM基礎(chǔ)型化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自雅酶公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素、氨芐青霉素、LB培養(yǎng)基等其他生化試劑購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)標準菌株HN375中hlyA基因序列，為了構(gòu)建pET28a-hlyA、pET32a-hlyA和pCold TF-hlyA原核表達載體，分別設(shè)計了下列引物：pET28a-hlyA：上游引物F：5'-TTCCATATGTTAGTTC AAATCAAATTGAACCCCTTT-3'，下游引物R：5'-CG GGATCCATGCCAAAACTCAATCGTTGC-3'，下劃線部分分別為Nde I和BamH I酶切位點。pET32a-hlyA：上游引物F：5'-GCGGCCGCTTAGTTCAAATCAAAT TGAACCCCTTT-3'，下游引物R：5'-CGGGATCCAT GCCAAAACTCAATCGTTGC-3'，下劃線部分分別為Not I和BamH I酶切位點。pCold TF-hlyA上游引物F：5'-TTCCATATGTTAGTTCAAATCAAATTGAACCC CTTT-3'，下游引物R：5'-CGGAATTCATGCCAAAAC TCAATCGTTGC-3'，分別為Nde I和EcoR I酶切位點，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 PCR擴增及切膠回收目的基因 以霍亂弧菌標準菌株HN375 DNA為模板進行PCR擴增hlyA基因。PCR 反應(yīng)體系為 50 μL ：ddH2O 31.5 μL、5×PSBuffer 10 μL、dNTP Mixture 4 μL、DNA模板2 μL、上游、下游引物各1 μL、Prime Star酶0.5 μL。PCR擴增條件為：98℃變性20 s，55℃退火15 s，72℃延伸2 min 30 s，30個循環(huán)，72℃延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳鑒定，再用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行純化回收目的基因。

1.2.3 pET28a-hlyA、pET32a-hlyA和 pCold TF-hlyA重組質(zhì)粒的構(gòu)建 分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對hlyA基因及pET28a、pET32a、pCold TF質(zhì)粒進行雙酶切，酶切條件為37℃，4 h。酶切后用1%瓊脂糖凝膠對酶切產(chǎn)物進行電泳鑒定，然后純化回收酶切質(zhì)粒和目的基因，二者按摩爾比1∶10比例混合后加入T4 DNA連接酶在16℃條件下連接16 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli DH5a感受態(tài)細胞中，在含有相應(yīng)抗生素的LB平板上涂布接種，培養(yǎng)24 h后挑選陽性克隆菌進行菌液PCR鑒定，陽性克隆增菌后提取重組質(zhì)粒行雙酶切驗證，并送江蘇塞索飛生物科技有限公司進行測序。

1.2.4 pET28a-hlyA、pET32a-hlyA和 pCold TF-hlyA重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達 將構(gòu)建成功的pET28a-hlyA、pET32a-hlyA和 pCold TF-hlyA重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）表達菌中，分別涂布于含相應(yīng)抗生素的LB平板上，培養(yǎng)24 h后篩選陽性菌落行菌液PCR鑒定。吸取陽性克隆菌液按1∶50比例轉(zhuǎn)接于相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中，37℃，180 r/min恒溫搖床中培養(yǎng)至OD600吸光度值約為0.6時，在不同的誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)后離心收集菌體，用1×Binding Buffer（300 mmol/L NaCl、10 mmol/L PBS，pH 8.0）重懸然后超聲破菌，行SDS-PAGE電泳分析HlyA蛋白在上清和沉淀中的表達情況。

1.2.5 純化誘導(dǎo)表達在上清的HlyA蛋白 使用Ni-NTA親和層析柱純化破菌后的上清，將上清液與Ni-NTA瓊脂糖珠混合30 min以充分結(jié)合，再用含有10、20、30、40 mmol/L 咪唑的 1×Washing Buffer洗雜蛋白，最后使用含有300 mmol/L咪唑的1×Washing Buffer洗脫結(jié)合在Ni -NTA柱中的目的蛋白。行SDS-PAGE電泳分析蛋白純度，以超濾杯進行脫NaCl、脫咪唑并濃縮蛋白。行BCA法對濃縮蛋白定量后分裝保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 HlyA蛋白溶血活性分析 用生理鹽水將新鮮兔紅細胞配制成2%（V /V）的紅細胞懸液，用PBS溶液將純化的全長HlyA蛋白稀釋至不同濃度（0，4和8 μg/mL）。再將2%兔紅細胞懸液與稀釋的HlyA蛋白溶液等體積混合，以PBS為陰性對照，以1%Trion-X為陽性對照，37℃溫育3 h后低速離心取上清200 μL于96孔板，酶標儀測定541 nm處的光密度值。

1.2.7 多克隆抗體的制備及抗體效價的檢測 將純化HlyA蛋白與等體積Alum佐劑充分混合后，通過皮下多點注射免疫劑量為30 μg /只的BALB /c小鼠，同時設(shè)置注射Alum佐劑作陰性對照組。每次免疫間隔兩周，共免疫3次，末次免疫后一周采尾靜脈血分離血清測抗體效價。將HlyA蛋白用抗原包被液（pH 9.6的碳酸鹽緩沖液）稀釋為濃度10 μg/mL，100 μL/孔加至96孔酶標板，4℃過夜包被；以間接ELISA法測定抗體效價，顯色終止后于酶標儀上讀取450 nm下的吸光度值。結(jié)果判定標準：以稀釋的待測標本A450/Alum佐劑對照A450≥2.1的最大稀釋倍數(shù)判定為該抗體的滴度。

1.2.8 抗HlyA多克隆抗體抑制霍亂弧菌培養(yǎng)基上清溶血活性分析 收集OD600≈0.6時霍亂弧菌培養(yǎng)基上清預(yù)先與抗 HlyA抗血清按40∶1比例稀釋，室溫孵育1 h；再以上述抗體中和后的菌液上清：紅細胞懸液按9∶1的比例加入玻璃試管中，以未加抗體的霍亂弧菌培養(yǎng)基上清作為未處理對照，以1%Trion-X為陽性對照，將試管放置于37℃恒溫水浴箱中溫育3 h后，低速離心取上清用酶標儀測定其在波長541 nm的光密度值并計算其溶血率。實驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3次以上，使用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，選用未配對的雙尾t檢驗分析兩組之間的差異，以P ＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.9 Western blot檢測HlyA蛋白的表達 將霍亂弧菌HN375野生菌株（WT）及其hlyA基因敲除菌株（HN375△hlyA）分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，在37℃，180 r/min恒溫搖床中培養(yǎng)至OD600≈0.6時，通過離心分離培養(yǎng)物上清液。如前所述［24］，使用三氯乙酸-丙酮沉淀法從2 mL培養(yǎng)物上清液中沉淀出分泌的蛋白質(zhì)，加1 × SDS -PAGE蛋白上樣緩沖液于沉淀出分泌的蛋白質(zhì)充分混勻，煮沸15 min，取20 μL樣本行SDS -PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后，用1∶1 000稀釋的抗HlyA血清作為一抗，在4℃，80 r/min搖床上孵育過夜；用TBST洗滌3次后，用1∶5 000稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG作為二抗，室溫80 r/min搖床上孵育1 h，經(jīng)TBST洗滌3次后行ECL顯色。取Western blot印跡條帶對應(yīng)位置的膠條送華大基因進行質(zhì)譜鑒定分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增hlyA基因及構(gòu)建pET28a-hlyA、pET32a-hlyA和pCold TF-hlyA原核表達載體

以霍亂弧菌HN375菌株的DNA為模板行PCR擴增hlyA基因，行1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增產(chǎn)物，可見大小與預(yù)期分子量相符的目的條帶（圖1-A）。將hlyA基因克隆入pET28a、pET32a和pCold TF載體中，轉(zhuǎn)化E.coli DH5a后篩選陽性克隆菌落行菌液PCR驗證，結(jié)果分別如圖1-B、1-C和1-D所示，均能擴增出與預(yù)期大小相符的目的條帶。提取陽性菌落中的重組質(zhì)粒進行測序，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中hlyA基因序列相符，表明pET28a-hlyA、pET32a-hlyA和pCold TF-hlyA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 pET28a-hlyA、pET32a-hlyA和pCold TF-hlyA重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant plasmids pET28ahlyA，pET32 a-hlyA and pCold TF-hlyA.

2.2 pET28a-hlyA和pET32a-hlyA重組質(zhì)粒中HlyA蛋白的誘導(dǎo)表達

將含pET28a-hlyA和pET32a-hlyA重組質(zhì)粒的E.coli BL21（DE3）表達菌分別在不同溫度、轉(zhuǎn)速和IPTG濃度下進行蛋白誘導(dǎo)表達，用SDS-PAGE電泳分析超聲破菌后的沉淀與上清中HlyA蛋白的表達形式。結(jié)果如圖2-A和2-B所示，在10℃、15℃和23℃等條件下，pET28a-hlyA- E.coli BL21（DE3）菌株中的HlyA蛋白都以包涵體形式表達，未獲可溶表達形式。同樣，pET32a-hlyA- E.coli BL21（DE3）表達菌分別在15℃、20℃和25℃等條件下誘導(dǎo)，HlyA蛋白也以包涵體形式表達于沉淀中（圖3）。

圖2 pET28a-hlyA在E.coli BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of pET28a-hlyA expression pro-ducts in E.coli BL21（DE3）induced with IPTG

圖3 pET32a-hlyA在E.coli BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of pET32a-hlyA expression products in E.coli BL21（DE3）induced with IPTG

2.3 pCold TF-hlyA重組質(zhì)粒中HlyA蛋白的誘導(dǎo)表達及純化

pCold TF-hlyA-E.coli BL21菌株在15℃、90 r/min、0.05 mmol/L IPTG條件誘導(dǎo)16 h后，在SDS-PAGE電泳圖中可見分子量約為130 kD的目的蛋白表達，即82 kD的HlyA蛋白和48 kD的pCold TF標簽蛋白之和（圖4），超聲破菌后沉淀與上清均有目的蛋白表達，表明在該菌株中可獲得可溶形式的HlyA蛋白，經(jīng)Ni-NTA柱親和層析純化后，獲較純的HlyA蛋白。

圖4 pCold TF-hlyA在E.coliBL21中誘導(dǎo)表達和HlyA蛋白純化的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of pCold TF-hlyA expression products in E.coli BL21 induced with IPTG and the purified HlyA protein

2.4 重組表達的HlyA蛋白的溶血活性分析

將不同濃度的HlyA蛋白與2%的新鮮兔洗滌紅細胞懸液在37℃溫育3 h后，行溶血活性測定。結(jié)果顯示4和8 μg/mL的重組HlyA蛋白與兔紅細胞共孵育未見明顯的溶血現(xiàn)象（P＞0.05）（圖5），提示重組HlyA蛋白沒有溶血活性。

圖5 重組表達的HlyA蛋白溶血活性測定Fig.5 Hemolytic activity determination of recombinant expressive protein HlyA

2.5 間接ELISA法檢測抗HlyA蛋白多克隆抗血清效價

末次免疫一周后取小鼠尾靜脈血行間接ELISA法測抗體效價，結(jié)果顯示抗血清效價達到了1∶521 000（圖6）。

圖6 HlyA蛋白免疫前后小鼠血清抗體效價分析Fig.6 Analysis of serum antibody titer in mice before and after immunization with HlyA protein

2.6 抗HlyA多克隆抗體特異性的鑒定

收集霍亂弧菌HN375菌株和HN375△hlyA菌株培養(yǎng)基上清，行Western blot分析，以制備的抗HlyA多克隆抗體作為一抗。結(jié)果顯示在霍亂弧菌HN375野生株培養(yǎng)上清中出現(xiàn)了與預(yù)期分子量相符的特異性HlyA蛋白印跡條帶，而HN375△hlyA菌株培養(yǎng)上清未見反應(yīng)條帶（圖7）。為進一步鑒定該條帶為HlyA蛋白，取該位置條帶行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示該條帶為霍亂弧菌HN375菌株分泌HlyA蛋白（圖8）。以上結(jié)果提示，我們制備的抗HlyA多克隆抗體能特異識別霍亂弧菌中天然表達的HlyA蛋白。

圖7 Western blot分析抗HlyA多克隆抗體的特異性Fig.7 Analysis specificity of anti-HlyA polyclonal antibody by Western blot

圖8 HlyA蛋白的質(zhì)量圖譜Fig.8 Mass spectrometric profiles of HlyA protein

2.7 抗HlyA多克隆抗體能夠抑制霍亂弧菌培養(yǎng)上清的溶血能力

為了驗證抗HlyA多克隆抗體是否能夠抑制霍亂弧菌HlyA的溶血活性，本研究選擇非O1/非O139霍亂弧菌HN375菌株、HN375△tagH菌株（課題組前期構(gòu)建的高表達HlyA的菌株）和本課題組前期分離的兩株已鑒定為非O1/非O139霍亂弧菌的臨床菌株進行抗體中和實驗［10］。結(jié)果如圖9所示，與未處理血清組和HlyA免疫前血清處理組相比，HlyA免疫后血清處理組明顯抑制HlyA介導(dǎo)的溶血現(xiàn)象（P＜ 0.001）。

圖9 抗HlyA多克隆抗體中和活性檢測Fig.9 Detection of Anti-HlyA polyclonal antibody neutralization activity

3 討論

HlyA蛋白被認為霍亂弧菌的致病過程中的重要毒力因子，但目前關(guān)于HlyA的調(diào)控機制和致病作用，尤其是在非O1/非0139群霍亂弧菌中的致病作用尚不完全清楚［1］。為深入研究HlyA的功能，我們擬通過原核表達系統(tǒng)獲取HlyA蛋白并制備高效價的多克隆抗體，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。目前大多數(shù)研究者主要通過快速蛋白液相色譜（FPLC）［1，25］或陰離子交換層析法［26］等方法分離純化霍亂弧菌培養(yǎng)基上清的HlyA蛋白，但這些方法存在操作繁瑣，實驗和技術(shù)條件要求高，獲得HlyA蛋白純度不好等缺點。因此，本研究擬建立一種高效、方便的HlyA蛋白原核表達系統(tǒng)，以表達純化可溶形式的HlyA蛋白。

本研究首先嘗試以pET28a載體表達HlyA蛋白，雖經(jīng)過溫度、IPTG濃度和轉(zhuǎn)數(shù)等條件優(yōu)化，但是未獲得可溶性表達形式的HlyA蛋白。有文獻報道通過pET32a載體表達出HlyA蛋白，但并未說明其表達形式［22］。本研究也嘗試以pET32a載體表達HlyA蛋白，但是同樣未獲得可溶性表達形式的HlyA?？赡苁荋lyA蛋白在pET28a、pET32a中不能獲得蛋白正確折疊形式，導(dǎo)致了包涵體表達。因此，我們進一步選擇pCold TF載體表達HlyA蛋白，因為該載體帶有可溶性標簽Trigger Factor（TF），TF是原核核糖體相關(guān)的分子伴侶蛋白（48 kD），有利于新表達的多肽的共翻譯折疊，且該載體是一種低溫誘導(dǎo)的蛋白表達載體，低溫誘導(dǎo)能增強目的蛋白的穩(wěn)定性和能促使融合蛋白最大限度地以可溶形式存在，提高目的蛋白質(zhì)的可溶性［27］。于是本研究嘗試以pCold-TF載體表達HlyA蛋白，并獲得高純度和可溶性表達形式的HlyA蛋白。相比陰離子交換層析法等直接提取法，我們成功構(gòu)建的以pCold-TF載體HlyA原核表達系統(tǒng)，能高效獲取HlyA蛋白。純化的HlyA蛋白免疫小鼠獲得高效價的多克隆抗體，說明該蛋白具有較好的免疫原性。由于霍亂弧菌溶血素（hemolysin，HlyA）是由hlyA基因首先編碼合成分子量為 82 kD prepro-HlyA前體蛋白，需在胞外經(jīng)蛋白酶水解修飾后才形成成熟有活性的水溶性穿孔毒素［28-30］。然而在大腸桿菌系統(tǒng)可能缺少特定的蛋白酶水解修飾HlyA蛋白為成熟有活性的蛋白，因此，溶血活性實驗顯示原核表達的HlyA蛋白不能夠裂解兔紅細胞。由于本研究主要目的是制備HlyA多克隆抗體，無活性HlyA蛋白對免疫原性影響不大，抗體效價結(jié)果顯示，原核表達的HlyA免疫原性較好，能獲得高抗體效價的多克隆抗體。進一步的Western blot分析顯示，制備的HlyA多克隆抗體能特異識別霍亂弧菌中天然表達的HlyA蛋白，質(zhì)譜分析也驗證了印跡條帶的特異性，表明所制備的多克隆抗體具有識別天然HlyA蛋白的特異性。而抗體溶血抑制實驗表明制備的HlyA多克隆抗體具備抑制霍亂弧菌HlyA蛋白溶血能力的生物學(xué)活性，提示該抗體在以后對抗霍亂弧菌致病過程中有可能作為HlyA中和抗體的潛力。

4 結(jié)論

本研究成功表達并純化出可溶性的霍亂弧菌HlyA蛋白，免疫小鼠后獲得高效價的抗HlyA多克隆抗體。該抗體能特異性識別霍亂弧菌天然表達HlyA蛋白，并能有效抑制霍亂弧菌的溶血活性。

（責任編輯 張婷婷）