焦垚瑄，李凱，張新楠，楊凱，王尚龍，馮昕煒

（塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

肉雞腹水綜合征（ascites syndrome, AS）是缺氧引起的以腹水、肺臟動(dòng)脈高壓和右心衰竭為主要特征的臨床綜合征。AS肉雞剖檢顯示肝臟充血腫大或皺縮，表面凹凸不平，顏色多呈暗紅色，常有棕黃色沉積物，肝臟周圍有淡黃色或灰白色膠凍狀凝塊附著，肝靜脈和門靜脈怒張充血。AS肉雞心臟功能不全導(dǎo)致肝臟缺乏有效的循環(huán)血量和供氧，加重肝損傷最終發(fā)生纖維化，引起腹水。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)作為在缺氧條件下主要的調(diào)節(jié)因子起著關(guān)鍵作用，缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是HIF-1主要的氧調(diào)節(jié)亞基，決定其水平及活性。肝纖維化是多種原因引起的反復(fù)和慢性肝損傷造成細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM) 積累的病理現(xiàn)象。目前研究認(rèn)為，肝纖維化的ECM主要由肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)合成， HSC在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展和逆轉(zhuǎn)過程中起至關(guān)重要的作用。當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，HSC表型會(huì)發(fā)生變化，通過激活α-平滑肌肌動(dòng)蛋白( α-smooth muscle actin，α-SMA) 轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞（MFB），生成大量ECM。試驗(yàn)通過對(duì)AS肉雞肝組織中α-SMA蛋白的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)而觀察出MFB細(xì)胞分布的數(shù)量，同時(shí)對(duì)HIF-1α基因表達(dá)含量進(jìn)行測(cè)定，初步探索AS肉雞肝臟HIF-1α基因的表達(dá)與MFB細(xì)胞數(shù)量的變化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用雞采集于新疆阿克蘇市郊某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)，為10周齡健康肉雞和AS肉雞。

主要試劑：平滑肌肌動(dòng)蛋白多克隆抗體兔抗雞一抗、免疫顯色試劑Poly-HRP羊抗小鼠/兔二抗試劑購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，蘇木素、伊紅、0.01M檸檬酸鈉緩沖試劑（pH6.0）購自北京索萊寶科技有限公司，HIF-1α抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，HRP-DAB底物顯色試劑盒購自天根生化科技有限公司，（Trans Zol Up Plus RNA Kit）RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Green qPCR Super Mix 試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

主要儀器：石蠟包埋機(jī)（EG1150）、手動(dòng)切片機(jī)（RM2125）購自Leica 德國，生物顯微鏡（尼康E200）購自尼康江南光學(xué)儀器有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀QuantStudio 5購自美國默飛世爾科技公司，梯度PCR儀TC-5000購自法國TECHNE。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣本的采集和保存 取5只10周齡肝臟腹水肉雞和5只10周齡健康肉雞的肝臟組織樣本，一部分以10%的福爾馬林固定；另一半置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 肝臟的顯微結(jié)構(gòu)特征觀察 10%福爾馬林固定的樣品，經(jīng)石蠟包埋，切取5 μm厚度切片放置60 ℃恒溫箱烘烤1 h，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精復(fù)水、蘇木精-伊紅染色后，再經(jīng)梯度酒精脫水后用中性樹膠封片，通過光學(xué)顯微鏡觀察肝臟結(jié)構(gòu)的微細(xì)結(jié)構(gòu)變化。

1.2.3 利用免疫組化研究肌成纖維細(xì)胞的分布 烤片：將已完成的切片在60 ℃條件下烘烤1 h。

脫蠟：將烘干后的切片在二甲苯溶液中脫蠟兩次，每次約10 min。

梯度水化：將浸泡后的切片依次置于無水酒精、95%、85%、75%酒精溶液中浸泡，每一次均約5 min，最后將切片置于蒸餾水中漂洗約5 min。

熱修復(fù)抗原：取枸櫞酸鹽緩沖液0.01M，將漂洗后的切片浸入，并置于微波爐中加熱，沸騰后斷電，10 min后再次低火煮15 min，靜置待其冷卻后用 pH 為7.2～7.6 的PBS沖洗3次，每次約3 min。

阻斷：每張切片加50 μL 3%過氧化氫溶液，放置約15 min以使內(nèi)源性酶失去活性，PBS洗滌3次，每次約5 min。

孵育一抗：向切片上滴加一抗（smooth muscle actin Polyclonal antibody），并置于4 ℃冰箱中，12 h后取出切片，經(jīng)PBS洗滌3次，每次5 min。

孵育二抗：滴加50～100 μL免疫顯色試劑Poly-HRP羊抗小鼠/兔二抗試劑，37 ℃烤箱中放置30 min，PBS液洗滌3次，每次5 min。

DAB顯色：滴加預(yù)制好的DAB工作液50～100 μL，5 min后鏡下觀察染色情況并控制反應(yīng)時(shí)間，染色后用蒸餾水洗滌。

蘇木素染液浸染5 min，用蒸餾水洗滌后，經(jīng)PBS返藍(lán)。

梯度溶液(60%～100%)脫水，每級(jí)約5 min。取出后將切片置于二甲苯溶液中處理兩次，每次約10 min，最后滴加中性樹膠封片。通過光學(xué)顯微鏡觀察a-SMA蛋白在腹水肉雞肝臟中不同部位的分布和比例。注：以PBS代為一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.4 HIF-1α的表達(dá)及蛋白含量檢測(cè) 引物設(shè)計(jì)：HIF-1α引物參照韓燁晨等的報(bào)道，GAPDH通過Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由上海生工合成。

肝組織RNA的提取：使用RNA提取試劑盒(TransZol法)進(jìn)行提取，并用Nanodrop測(cè)定RNA濃度。

肝組織RNA的反轉(zhuǎn)錄：用Two-Step反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA；依次加入Total RNA 1μL、Anchored Oligo(dT)18 Primer（0.5 μg/μL） 1μL、2xES Reaction Mix 10 μL、EasyScript? RT/RI Enzyme Mix 1 μL，gDNA Remover 1 μL、RNasefree Water 6 μL，總體積 20 μL。將20 μL 體系放于PCR儀中反應(yīng)15 min（42 ℃），85 ℃加熱5 s，產(chǎn)物于-20 ℃保存。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA濃度稀釋10倍，取稀釋后cDNA，Green qPCR SuperMix 試劑盒說明書進(jìn)行操作。依次加入cDNA 1μL、Forward Primer 0.4 μL、Reverse Primer 0.4 μL、2xPerfectStart? Green qPCR SuperMix 10 μL、RNase-free Water 8.2 μL，總體積 20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30s；95 ℃ 15 s；60 ℃ 30 s；溶解曲線為95 ℃ 15 s；60 ℃1 min；95 ℃ 1 s；40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品做三個(gè)生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)，根據(jù)每個(gè)樣品的Ct 值用2-ΔΔCt 公式計(jì)算HIF-1α的mRNA在腹水肉雞肝臟中的相對(duì)表達(dá)量。HIF-1α基因引物序列見表1。

表1 HlF-1α 基因引物序列

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 qRT-PCR用GraphPad Prism8.0作圖，免疫組化用Image J 1.8.0進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用SPSS22.0 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以“X±S”表示，以P＞0.05表示差異不顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟的HE染色

結(jié)果顯示如圖1。與健康肉雞肝組織（圖1A）相比，腹水肉雞肝組織（圖1B）完全失去正常結(jié)構(gòu)，肝索排列松散，部分正常肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞；肝血竇變大并淤血。出現(xiàn)部分炎性細(xì)胞及成纖維細(xì)胞。

圖1 肉雞肝臟HE染色(400×)

圖1 肉雞α-SMA染色(400×)

2.2 肝臟α-SMA的表達(dá)量

結(jié)果顯示如圖2。與對(duì)照組相比，腹水組α-SMA表達(dá)更明顯。對(duì)肝臟組織進(jìn)行陽性面積測(cè)定，結(jié)果顯示腹水組（圖2B）陽性面積比值是（12.70±1.65）%，健康組（圖2A）為（0.54±0.36）%，差異顯著（P＜0.05）。

2.3 HIF-1α的表達(dá)量

結(jié)果如圖3。qRT-PCR結(jié)果顯示，HIF-1α在腹水肉雞肝臟差異表達(dá)極顯著(P＜0.01)。

圖3 HIF-1α在肝臟中的mRNA表達(dá)量

3 討論

研究表明，患有腹水綜合征的肉雞肝臟損傷嚴(yán)重。HIF-1α是在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，也是引發(fā)AS 肉雞的關(guān)鍵因子，在低氧環(huán)境中，HIF-1α在細(xì)胞內(nèi)積聚并與HIF-1β結(jié)合形成HIF-1，HIF-1與缺氧反應(yīng)原件（HRE)結(jié)合，參與多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)。在本試驗(yàn)中，腹水肉雞肝臟HE染色顯示肝組織完全失去正常結(jié)構(gòu)，肝索排列松散，部分正常肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞；肝血竇變大并淤血，與健康肉雞肝臟顯微結(jié)構(gòu)差異明顯，與李凱的研究結(jié)果一致。肉雞腹水綜合征是一種由遺傳、營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境等多因素導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)代謝病，但是缺氧是腹水肉雞發(fā)病的重要因素。前期研究表明，AS肉雞剖檢顯示肝臟充血腫大或皺縮，表面凹凸不平，顏色多呈暗紅色，常有棕黃色沉積物，肝臟周圍有淡黃色或灰白色膠凍狀凝塊附著，肝靜脈和門靜脈怒張充血。這是因?yàn)锳S肉雞心臟功能不全，繼而導(dǎo)致肝臟缺乏有效的循環(huán)血量和供氧，加重肝損傷，最終發(fā)生纖維化，引起腹水。qRT-PCR結(jié)果顯示腹水肉雞的肝臟中HIF-α基因表達(dá)極顯著(P＜0.01)高于健康肉雞，說明在低氧環(huán)境中，肉雞體內(nèi)HIF-1α被激活。肝星狀細(xì)胞（HSC）在肝纖維化過程中起著重要作用，正常為靜息狀態(tài)，當(dāng)受到外界因子刺激時(shí)，合成分泌平滑肌動(dòng)蛋白（α-SMA）進(jìn)而轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞（MFB），因此，MFB水平的變化與肝臟纖維化水平呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，腹水肉雞肝臟α-SMA蛋白含量表達(dá)顯著（P＜0.05）高于健康肉雞，與韓爍晨的研究結(jié)果一致，這表明在AS發(fā)病過程中，MFB參與肝臟的纖維化形成。

4 結(jié)論

在AS肉雞形成的過程中，HIF-α表達(dá)均持續(xù)升高，肝星狀細(xì)胞被HIF-1α基因刺激激活，合成分泌α-SMA蛋白，進(jìn)而成為具有增生性和纖維原性的MFB，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，器官纖維化形成。腹水肉雞肝臟HIF-α含量及α-SMA含量表達(dá)均顯著高于健康肉雞(P ＜0.01, P ＜0.05)，且HIF-1α基因的表達(dá)量與MFB細(xì)胞的增多成正比。