夏偉，孟宇航，呂碩林，李華，劉思喜，王友娟，劉佳卉，張傳美*

（1.青島中仁動物藥品有限公司，山東 青島 266300；2.青島市農(nóng)業(yè)行政執(zhí)法支隊，山東 青島 266000；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109）

H9N2亞型禽流感病毒，屬于低致病性禽流感病毒，單獨感染雞會引起輕微的呼吸道癥狀，可以排毒，當(dāng)與其它病毒（如新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒等）發(fā)生混合感染，會導(dǎo)致呼吸道癥狀加重，死亡率上升[1]。H9N2亞型禽流感對養(yǎng)禽業(yè)的危害不容忽視，該病毒雖然毒性較H5N1弱，但同樣可以引起養(yǎng)禽業(yè)的損失。過去二十年來，H9N2禽流感病毒在全球家禽中廣泛傳播，對養(yǎng)禽業(yè)構(gòu)成威脅，需要密切監(jiān)視、加強(qiáng)防控。

禽流感的防治除了疫苗免疫接種外，臨床上大多采用抗病毒藥物進(jìn)行防治。目前用于臨床治療禽流感藥物主要有以下幾類：第一類是化學(xué)合成的抗病毒藥，如金剛烷胺、利巴韋林等，但大都被禁止用于獸藥；第二類為生物合成制劑，如干擾素、單克隆抗體、轉(zhuǎn)移因子等，干擾素作為一種新型抗病毒藥物，靜脈注射可隨血液循環(huán)至全身，激活細(xì)胞內(nèi)作用機(jī)制以抵抗病毒的侵?jǐn)_[2]；轉(zhuǎn)移因子在一定幅度內(nèi)能提高抗體水平并能延長抗體維持時間[3]；第三類為傳統(tǒng)的抗病毒中藥，如大青葉、板藍(lán)根、黃連、金銀花等清熱解毒類中藥。再就是近幾年較流行的多糖多肽類藥物，也陸續(xù)用于臨床，如有研究報道滸苔多糖在體外有抗禽流感病毒的活性[4]。總之，抗流感病毒藥物的種類繁多，為篩選臨床防治H9N2亞型禽流感的有效藥物，本試驗選取SPF雞評估了8種藥物治療禽流感的臨床效果，為生產(chǎn)實踐中禽流感的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及毒株

21日齡SPF雞、SPF雞胚均購自山東斯帕法斯生物技術(shù)有限公司。H9N2 禽流感病毒（尿囊液），為本實驗室保存，攻毒前經(jīng)SPF雞胚傳代一次。

1.2 試驗藥品及試劑

8種藥物編號為藥品1、2、3、4、5、6、7、8，由青島中仁藥品有限公司提供。1%雞紅細(xì)胞懸液自制；H9N2禽流感標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，購自哈爾濱維科生物公司；待檢雞血清。具體藥物見表1。

表1 本試驗所用藥物

1.3 主要儀器

超凈工作臺，購自力康精密科技（上海）有限公司；高速離心機(jī)，購自長沙東旺實驗儀器有限公司；孵化箱，購自佳農(nóng)電子設(shè)備有限公司；電子分析天平，購自奧豪斯儀器（常州）有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 攻毒試驗 取出-80 ℃保存的AIV種毒，過濾病毒后感染雞胚收獲尿囊液，用0.9%的無菌生理鹽水作10倍遞進(jìn)稀釋，接種于9日齡SPF雞胚，37 ℃培養(yǎng)5 d，觀察并記錄雞胚死亡感染情況。經(jīng)測定H9N2禽流感病毒含量為104.5EID50/mL。

選取9只體重相近21日齡SPF雞，隨機(jī)分為3組，每組3只，分別采用稀釋不同濃度的尿囊液0.1 mL滴鼻攻毒，觀察感染及死亡情況。然后分別采用上述結(jié)果中適當(dāng)濃度0.1、0.2 mL兩個劑量進(jìn)行攻毒，觀察感染及死亡狀況，確定正式攻毒的濃度與劑量。

1.4.2 試驗分組與處理 試驗選取80只21日齡SPF雞，隨機(jī)分成10組，設(shè)置空白組、攻毒對照組和8個藥品組，攻毒對照組和8個藥品組的SPF雞滴鼻攻毒100 μL（104.5EID50/mL）的H9N2禽流感病毒液，每組做好標(biāo)記（表2）。空白組和其它組隔離飼養(yǎng)，攻毒后第2 天開始全天飲水給藥，每天早中晚各三次，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4.3 臨床癥狀 每天詳細(xì)記錄各組SPF雞的臨床癥狀，發(fā)病和死亡情況等指標(biāo)。若發(fā)現(xiàn)雛雞死亡，立即將其解剖，記錄各組織器官的病理變化。各組SPF雞每天空腹稱重1次，計算日增重。

1.4.4 保護(hù)率的測定 根據(jù)發(fā)病率、死亡率計算出保護(hù)率。

1.4.5 抗體水平檢測 對照組及所有藥品組在攻毒前及攻毒第5、10、14 天，每組隨機(jī)抽取3只雞，采血離心取血清保存?zhèn)溆谩２捎醚把种圃囼灥姆椒╗5]檢測抗體，使用抗原為攻毒毒株。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

攻毒對照組的 SPF雞在第3～4天開始出現(xiàn)典型的AIV病變，羽毛臟亂堆擠在一起，精神萎靡不振，腳趾鱗片輕微出血，臥伏于籠中，不愛走動，飼料用量、飲水量減少，偶爾有咳嗽、噴嚏和支氣管啰音等現(xiàn)象，喘息時有鳴聲。排黃白色粥樣稀糞，并在攻毒后第2天出現(xiàn)體重下降?？瞻讓φ战M的 SPF雞未出現(xiàn)任何的臨床癥狀，精神正常，體重逐步增加。藥品組的 SPF雞在第3～4天也開始出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀，第2天出現(xiàn)體重下降，第3天有所回升，后期體重逐漸下降，如圖1。

圖1 SPF雞體重變化情況

2.2 攻毒試驗結(jié)果

攻毒劑量篩選確定攻毒濃度為103.5EID50濃度，劑量0.1 mL。攻毒對照組在3 d開始陸續(xù)出現(xiàn)死亡，各藥品組于6 d后陸續(xù)出現(xiàn)死亡。于第11 天統(tǒng)計各組的死亡率和保護(hù)率，攻毒試驗結(jié)果如表3。

表3 8種藥物的保護(hù)率

2.3 病理剖檢

攻毒對照組和藥品組的SPF雞死亡后，發(fā)現(xiàn)羽毛臟亂、消瘦，肛門周圍被排泄物污染。剖檢可見小腸粘膜出血，腸壁內(nèi)有出血點（圖2A），肺臟出血（圖2B），腎臟出血（圖2C），腺胃乳頭出血、肌胃角質(zhì)層潰瘍（圖2D），如圖2?？瞻讓φ战M，羽毛有光澤，肛門周圍無排泄物，剖檢時未發(fā)現(xiàn)組織有病變。

圖2 攻毒組病理剖檢情況

2.4 抗體水平變化

對照組及所有藥品組在攻毒前及攻毒第5、10、14天，每組隨機(jī)抽取3只SPF雞檢測抗體，結(jié)果見表4。

表4 禽流感抗體檢測結(jié)果（log2）

3 討論

本試驗結(jié)合生產(chǎn)實際，在考慮臨床用藥成本的基礎(chǔ)上，按生產(chǎn)廠家建議臨床使用濃度選定了8種不同的藥物，通過SPF雞攻毒感染，感染后用藥，觀察臨床癥狀、計算保護(hù)率、抗體水平等指標(biāo)，評估8種藥物的臨床效果。本試驗結(jié)果顯示，飼喂板藍(lán)根、大青葉的抗感染效果最好，保護(hù)率和抗體水平較其它組高；滸苔多糖、核酸糖肽類藥物的效果次之。

抗體效價的高低可以直接反映機(jī)體的免疫狀態(tài)，抗體檢測可以作為觀察藥物療效的指標(biāo)，也能夠監(jiān)測SPF雞攻毒后是否產(chǎn)生反應(yīng)，是臨床診斷的重要依據(jù)。從抗體水平可以看出，所有SPF雞在攻毒前均無H9N2禽流感抗體，攻毒第5天開始產(chǎn)生抗體；第10天各組的抗體水平均有升高，藥品2、3、8組抗體水平較其它組高，但此時仍有部分SPF雞未產(chǎn)生抗體，這一階段出現(xiàn)大量死亡，可能是攻毒毒株的毒力較強(qiáng)，產(chǎn)生的抗體被不斷消耗導(dǎo)致檢測的抗體水平較低；至第14天僅有藥品2組還有1只SPF雞存活，抗體效價為28，抗體較高。試驗結(jié)果顯示，板藍(lán)根和大青葉能夠顯著提高SPF雞的抗體效價，但因條件所限，本試驗檢測的SPF雞數(shù)量較少，這對藥物效果的研究尚待進(jìn)一步證實。

由于近幾年禽流感病毒對藥物的耐藥性逐漸增強(qiáng)，新型抗病毒藥物的研制越來越迫切。本試驗中干擾素、轉(zhuǎn)移因子等幾種新型藥物口服方式并不理想，可能是受口服給藥途徑的影響。板藍(lán)根和大青葉是清熱解毒的中草藥，對甲型流感病毒有明顯的拮抗作用，從而獲得較好的治療效果[6]，這與本試驗結(jié)果相符。金銀花和連翹具有一定的抗病毒作用，研究報道金銀花的乙醇提取物對流感病毒的復(fù)制有一定的抑制作用[7]。王文麗等[8]發(fā)現(xiàn)連翹提取物在銀翹散的主要藥物組成成分中抗甲型流感病毒的作用最強(qiáng)。孫信仁[9]使用中藥劑“病毒清”在不同藥物治療效果等方面進(jìn)行比較試驗，證實中藥劑在治療禽流感方面有著較為理想的效果。而在本試驗中金銀花、連翹的治療效果并不理想，可能是藥材價格較高、添加濃度較低的原因。本試驗通過對8種不同濃度的藥物進(jìn)行評估，得出8種抗病毒藥物中以板藍(lán)根和大青葉的效果最好，對禽流感的防治有一定的臨床參考價值。