劉翼，吳強(qiáng)，張曉明，曾薇

1深圳大學(xué)總醫(yī)院胸心外科，廣東 深圳 518055

2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外二科，烏魯木齊 830011

3南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院腫瘤科，廣州 510515

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率均居所有惡性腫瘤首位[1]。早期非小細(xì)胞肺癌患者由于診斷方法的局限且缺乏特異性癥狀，診斷較為困難，當(dāng)患者出現(xiàn)臨床癥狀就診時(shí)多數(shù)已處于腫瘤晚期，不適合進(jìn)行手術(shù)切除，5年生存率不足20%[2]。因此，確定與肺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子靶點(diǎn)具有重要意義。GTP酶免疫相關(guān)蛋白（GTPase of immunity-associated protein，GIMAP）廣泛存在于各種動(dòng)植物細(xì)胞以及某些細(xì)菌中，與免疫系統(tǒng)緊密聯(lián)系。目前發(fā)現(xiàn)的7種人源GIMAP家族基因均分布于染色體7q36.1，其編碼相對(duì)分子量為33 000～75 000的蛋白質(zhì)[3]。GIMAP蛋白家族在淋巴細(xì)胞相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用，其機(jī)制是GIMAP蛋白家族對(duì)淋巴細(xì)胞成熟、凋亡等生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控[4]。GIMAP8是GIMAP家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)GIMAP8mRNA在子宮內(nèi)膜癌[5]、乳腺癌[6]等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，并且與患者預(yù)后密切相關(guān)，提示GIMAP8可作為潛在的預(yù)后預(yù)測(cè)因子。然而，GIMAP8在肺腺癌中的表達(dá)及意義未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中2021年5月30日之前納入的肺腺癌表達(dá)譜數(shù)據(jù)及患者臨床資料進(jìn)行分析，探討GIMAP8在肺腺癌中的表達(dá)情況及其與肺腺癌患者臨床特征、預(yù)后的關(guān)系，并分析GIMAP8在肺腺癌中可能參與的信號(hào)通路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 資料收集

從 TCGA 官方網(wǎng)站（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載肺腺癌的表達(dá)譜數(shù)據(jù)及患者臨床資料。其中，基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)包括肺腺癌組織樣本497例，正常肺組織樣本59例，具有相關(guān)臨床特征資料的樣本385例。整理RNASeq樣本，刪除臨床資料中失訪及信息不完整的病例。提取GIMAP8單基因樣本及相對(duì)應(yīng)的臨床資料樣本，分析GIMAP8在肺腺癌和正常肺組織中的表達(dá)差異。

1.2 研究方法

1.2.1 GIMAP8表達(dá)與肺腺癌患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系及驗(yàn)證 從385例臨床樣本中選取性別、年齡、T分期、N分期、M分期、美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）分期作為肺腺癌臨床特征指標(biāo)，去除臨床特征缺失或者不完全的病例69例，以GIMAP8在肺腺癌組織中表達(dá)水平的中位數(shù)（3.217）為界限，將肺腺癌患者分為GIMAP8高表達(dá)組（142例）和GIMAP8低表達(dá)組（174例），比較兩組患者臨床特征的差異。利用單因素及多因素Cox模型分析各臨床特征與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。分析GIMAP8高表達(dá)組、低表達(dá)組患者總生存期（overall survival，OS）的差異；利用Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)肺腺癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行生存分析，進(jìn)一步驗(yàn)證GIMAP8的預(yù)后價(jià)值。

1.2.2 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA） 采用GSEA 4.1.0軟件分析影響GIMAP8表達(dá)的通路。選用GSEA中C2.cp.kegg.V7.4.symbols.gmt規(guī)范化基因集，運(yùn)用缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)方法，每次分析對(duì)基因組進(jìn)行1000次排列。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；影響因素分析采用單因素及多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存情況比較采用Log-rank檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組織、正常肺組織中GIMAP8表達(dá)水平的比較

GIMAP8在497例肺腺癌組織中的表達(dá)水平為（4.145±3.174），明顯低于59例正常肺組織的（20.916±9.429），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在52對(duì)配對(duì)樣本中，肺腺癌組織中GIMAP8表達(dá)水平為（4.792±3.563），明顯低于正常肺組織的（21.048±9.546），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 肺腺癌組織中GIMAP8表達(dá)情況與患者臨床特征的關(guān)系

不同年齡、性別、臨床分期、T分期、M分期、N分期肺腺癌患者的肺腺癌組織中GIMAP8表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征肺腺癌患者的肺腺癌組織中GIMAP8表達(dá)情況的比較

2.3 肺腺癌患者預(yù)后影響因素的單因素及多因素分析

對(duì)預(yù)后的影響因素進(jìn)行Cox回歸分析，單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，臨床分期、T分期、N分期均可以作為肺腺癌潛在的預(yù)后因素（P＜0.01）；多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，臨床分期（HR=1.923，95%CI：1.209～3.057，P＜0.01）為肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。（表2）

表2 肺腺癌患者預(yù)后影響因素的單因素和多因素Cox回歸分析

2.4 GIMAP8表達(dá)與肺腺癌患者生存情況的關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中GIMAP8低表達(dá)肺腺癌患者中位OS明顯短于GIMAP8高表達(dá)患者（P＜0.01）（圖1）。Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果表明，GIMAP8低表達(dá)肺腺癌患者中位OS明顯短于GIMAP8高表達(dá)患者（HR=1.923，95%CI：1.209～3.057，P＜0.01）（圖2）。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中GIMAP8高表達(dá)（n=142）與低表達(dá)（n=174）肺腺癌患者的生存曲線

圖2 Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫(kù)中GIMAP8高表達(dá)（n=932）與低表達(dá)（n=948）肺腺癌患者的生存曲線

2.5 GIMAP8基因相關(guān)信號(hào)通路

GIMAP8基因低表達(dá)樣本主要富集在氧化磷酸化、嘧啶代謝、RNA聚合酶、基底切除修復(fù)、蛋白酶體以及乙醛酸和二羧酸代謝等信號(hào)通路中。（表3）

表3 GIMAP8的功能富集分析

3 討論

肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌中發(fā)生率最高的一類，占40%以上，并有升高的趨勢(shì)[6]。由于缺乏早期臨床癥狀，部分肺腺癌患者確診時(shí)已處于晚期，治療效果及預(yù)后均較差。發(fā)現(xiàn)新的分子標(biāo)志物能夠?qū)Ψ伟┑脑\斷及治療提供理論依據(jù)，意義重大。

GIMAP基因位于染色體7q35-7q36.1區(qū)域，編碼一個(gè)主要在免疫系統(tǒng)中表達(dá)的蛋白質(zhì)家族。GIMAP基因能夠促進(jìn)免疫功能，如胸腺細(xì)胞發(fā)育、外周血淋巴細(xì)胞凋亡和T細(xì)胞分化。當(dāng)這些基因改變時(shí)可導(dǎo)致與免疫相關(guān)的疾病發(fā)生，如T淋巴細(xì)胞減少、急性髓系白血病和自身免疫性疾病[7-9]。研究表明，GIMAP在不同腫瘤組織和細(xì)胞系中低表達(dá)，因此，GIMAP除了參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)外，還可能作為抑癌基因發(fā)揮作用[10-12]。有文獻(xiàn)報(bào)道，GIMAP4可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]，而GIMAP6在自噬過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14]。一項(xiàng)關(guān)于肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的研究中，Huang等[15]發(fā)現(xiàn)，與配對(duì)的非腫瘤組織樣本和健康受試者血液樣本相比，HCC腫瘤樣本和HCC患者血液樣本中GIMAP5、GIMAP6mRNA表達(dá)顯著下調(diào)。Mégarbané等[16]對(duì)18例健康女性、16例導(dǎo)管原位癌女性患者、13例三陰性乳腺癌女性患者和15例人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽(yáng)性乳腺癌女性患者的GIMAPmRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，乳腺癌患者GIMAP4、GIMAP6、GIMAP7、GIMAP8mRNA 水平均較健康女性顯著降低，并提示這些基因可能通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡或控制細(xì)胞周期發(fā)揮乳腺癌抑制基因的作用。Krücken等[17]研究表明，GIMAP8定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體，GIMAP8mRNA在胸腺組織中高表達(dá)，在心臟、皮膚和肺組織中低表達(dá)[17-19]。GIMAP8具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)，因其具有3個(gè)GTP結(jié)合域，表明它可能發(fā)揮不同于其他GIMAP家族成員的作用。GIMAP8不同GTP結(jié)合域之間保守序列的差異可能對(duì)GIMAP8的整體功能也很重要。本研究采用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析正常肺組織與肺腺癌組織中GIMAP8表達(dá)差異，并分析其與臨床特征和預(yù)后的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織中GIMAP8表達(dá)水平明顯低于正常肺組織（P＜0.01）；不同年齡、性別、臨床分期、T分期、M分期、N分期肺腺癌患者的肺腺癌組織中GIMAP8表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；GIMAP8低表達(dá)肺腺癌患者中位OS明顯短于GIMAP8高表達(dá)患者（P＜0.01）；多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，臨床分期（HR=1.923，95%CI：1.209～3.057，P＜0.01）為肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。本研究利用GSEA方法預(yù)測(cè)GIMAP8可能的調(diào)控信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)GIMAP8基因低表達(dá)樣本主要富集在氧化磷酸化、嘧啶代謝、RNA聚合酶、基底切除修復(fù)、蛋白酶體以及乙醛酸和二羧酸代謝等信號(hào)通路中。

綜上所述，肺腺癌組織中GIMAP8低表達(dá)，且與預(yù)后有關(guān)，可能是肺腺癌診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物。本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中肺腺癌的測(cè)序數(shù)據(jù)，納入大量樣本，臨床資料相對(duì)完整，為研究GIMAP8在肺腺癌中的作用機(jī)制提供依據(jù)。在后續(xù)的研究中，課題組將采用聚合酶鏈反應(yīng)、蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）和免疫組化法驗(yàn)證GIMAP8的表達(dá)情況，并進(jìn)一步檢測(cè)肺腺癌患者GIMAP8在免疫治療、靶向治療等中是否會(huì)發(fā)生變化，研究其作用機(jī)制，為肺腺癌的靶向治療提供新思路。