劉佳 楊道坤 王燕平 陳寶鑫 王新偉 綜述 申嬌 審校

原發(fā)性肝癌包括三種病理組織學(xué)類型，其中肝細(xì)胞癌(Hpatocellular carcinoma，HCC)占比最大。在中國，HCC是導(dǎo)致癌癥死亡的一個重要原因[1]。HCC的治療方法包括手術(shù)、射頻消融、經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞術(shù)(Transcatheter arterial chemoembolization，TACE)、放化療和分子靶向治療等，但臨床研究證實這些方法效果欠佳。近年，程序性死亡受體1(Programmed cell death-1，PD-1)抑制劑已顯示出對晚期肝細(xì)胞癌的優(yōu)越治療效果[2]。PD-1是T細(xì)胞調(diào)節(jié)器的成員，可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)對自身細(xì)胞的反應(yīng)[3]。在正常情況下，人體T淋巴細(xì)胞表達(dá)PD-1，正常細(xì)胞會表達(dá)適量程序性死亡受體-配體1(Programmed cell death-Ligand 1，PD-L1)維持免疫耐受；而HCC患者的腫瘤細(xì)胞會表達(dá)過量PD-L1，兩者結(jié)合會導(dǎo)致免疫逃逸。PD-1抑制劑可阻斷PD-1和PD-L1間的相互作用，恢復(fù)T細(xì)胞的活性和個體免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞的能力[4](圖1)。本文闡述了PD-1抑制劑在HCC治療中生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展。

1 腫瘤組織內(nèi)生物標(biāo)志物

1.1 PD-L1的表達(dá)

國外Feun等[5]研究發(fā)現(xiàn)PD-L1陽性組和陰性組在免疫治療后部分緩解(PR)的數(shù)量沒有顯著差異。然而，Keynote-224研究表明，PD-L1表達(dá)率越高，相應(yīng)患者的客觀應(yīng)答率(Objective response rate，ORR)越高，Checkmate 040等其他研究的結(jié)果表明，基線PD-L1表達(dá)水平與患者的治療效益無關(guān)[6]。Liu等[7]研究了HCC患者中PD-L1的不同表達(dá)模式，結(jié)果證實，腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)與患者的總生存期(Overall survival，OS)和無復(fù)發(fā)生存期(Recurrence-free survival，RFS)之間呈負(fù)相關(guān)(P=0.001；P=0.006)。CD68+巨噬細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)與患者的OS呈正相關(guān)(P=0.017)，這是由于表達(dá)PD-L1的巨噬細(xì)胞會招募大量CD8+T淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生更多免疫因子。PD-L1表達(dá)的異質(zhì)性是影響研究結(jié)果的重要因素。國外一項研究從存儲庫中選取HCC樣本，結(jié)果提示從目標(biāo)表位多樣性、差分檢測特異性、抗體親和力分析，PD-L1的表達(dá)存在較大差別[8]。統(tǒng)一PD-L1高表達(dá)的臨界值以及運(yùn)用統(tǒng)一抗體進(jìn)行檢測至關(guān)重要。因此，目前PD-L1表達(dá)的預(yù)測意義有待商榷。

1.2 腫瘤突變負(fù)荷及微衛(wèi)星不穩(wěn)定

腫瘤突變負(fù)荷(Tumor mutational burden，TMB)是外源編碼區(qū)域中堿基的替換和插入/刪除突變數(shù)量，與腫瘤樣本的評估基因有關(guān)[9]。高TMB提示更多的免疫新抗原存在[10]。Xu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，高TMB組比低TMB組的無進(jìn)展生存期(Progression-free survival，PFS)長(3個月vs.2.1個月，P=0.063)，但Huo等[12]研究發(fā)現(xiàn)高TMB組患者OS反而較短(P<0.001)，且高TMB組的CD8+T淋巴細(xì)胞和M0巨噬細(xì)胞浸潤水平較低。究其原因，可能由于臨界值不同或樣本量較小所致。微衛(wèi)星不穩(wěn)定(Microsatellite instability，MSI)是由于DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)(Mis-match repair，MMR)故障所致[13]。Ang等[14]評估了數(shù)百份HCC樣本的MSI，發(fā)現(xiàn)只有一份樣本具有高M(jìn)SI表達(dá)，提示MSI可能不能精準(zhǔn)預(yù)測HCC免疫治療的療效。

1.3 腫瘤浸潤免疫細(xì)胞

了解腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment，TME)是免疫治療成功的關(guān)鍵[15]。HCC的TME是一個富集多種免疫細(xì)胞的動態(tài)系統(tǒng)[16]。HCC中各種腫瘤浸潤免疫細(xì)胞(Tumor infiltrating immune cells，TIICs)相互作用形成復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)。抑制腫瘤作用：一項研究發(fā)現(xiàn)免疫治療后的HCC患者應(yīng)答組中CD8+腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(Tumor infiltrating lymphocyte，TILs)比例較高[17]。CD8+TILs可釋放穿孔素、絲氨酸蛋白酶、表達(dá)FasL分子等導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。一項研究表明[18]，耗竭CD8+TILs表達(dá)高的患者PFS和OS明顯更長(P=0.007；P=0.058)，并且發(fā)現(xiàn)與耗竭CD8+TILs特征相關(guān)的基因具有調(diào)節(jié)趨化因子表達(dá)(CCL5、CXCL9、CXCL13)和激活T細(xì)胞和NK細(xì)胞的功能。相關(guān)研究證實，耗竭TILs雖喪失部分功能，但可通過阻斷PD-1/PD-L1通路，實現(xiàn)TILs亞群的增殖[19]。另有一項研究證實了腫瘤組織中CD38+TIICs的免疫組化評分可以預(yù)測免疫治療療效，高表達(dá)組的中位PFS及中位OS均較高(8.21個月vs.1.64個月，P=0.007；19.06個月vs.5.59個月，P=0.030)[20]。這一現(xiàn)象是由于CD38+腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)會誘導(dǎo)IL-6和TNF-α的表達(dá)，并導(dǎo)致更多的IFN-γ和細(xì)胞因子(CXCL9、CXCL10和CXCL11)的表達(dá)[21]。也有研究表明CD4+TILs可上調(diào)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞(Effector T lymphocytes，TEFFs)并刺激CD8+TILs分泌細(xì)胞因子，直接殺傷腫瘤細(xì)胞[22]。促腫瘤作用：研究發(fā)現(xiàn)[23]FOXP3+TILs/CD4+TILs與DFS(HR=2.50，P=0.009)和OS(HR=4.04，P=0.001)獨(dú)立相關(guān)；對其相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子基因進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明高表達(dá)組會促使更多的IL-2、IL-10、IL-35及趨化因子CCL20和CXCL16的產(chǎn)生，招募調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory cells，Tregs)遷移到腫瘤微環(huán)境中，利于腫瘤新生血管的形成[23]。一項薈萃分析顯示[24]CD3+TILs的高密度預(yù)示較差的OS(HR=1.008；95%CI：1.000～1.015；P=0.037)。另有研究發(fā)現(xiàn)HCC組織中CD68+TAMs可誘導(dǎo)Th17的擴(kuò)增，誘發(fā)免疫耐受、分泌TGF-β、IL-6、IL-10等免疫抑制因子導(dǎo)致免疫逃逸[25]。綜上，HCC組織中不同表型的TIICs作用各不相同(圖2)，未來還需詳細(xì)探索并建立相關(guān)免疫評分。

圖2 腫瘤浸潤免疫細(xì)胞在TME中的作用

1.4 外泌體

外泌體是脂質(zhì)雙層包裹的納米級囊泡[26]。外泌體運(yùn)輸各種生物分子，如蛋白質(zhì)、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA(lncRNA)[27]。研究發(fā)現(xiàn)[28]，HCC衍生的外泌體中含有較多的lncRNA TUC339，TUC339可以參與細(xì)胞因子受體信號通路和CXCR 趨化因子受體結(jié)合通路，刺激巨噬細(xì)胞向M2表型極化以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。HCC外泌體miR-23a-3p通過STAT3信號通路上調(diào)巨噬細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)。HCC來源的其他外泌體還可以通過IL-6-STAT3信號通路抑制樹突狀細(xì)胞的成熟[29]。總之，腫瘤來源的多種類型的外泌體可以通過不同的信號傳導(dǎo)通路抑制免疫細(xì)胞的增殖，從而介導(dǎo)免疫逃逸。

1.5 特征性基因和通路

1.5.1 m6A修飾相關(guān)基因 Khemlina等[30]使用基因組測序的方法，在HCC中發(fā)現(xiàn)了一系列基因改變。探討HCC特征基因改變的研究相繼出現(xiàn)。Jiang等[31]研究發(fā)現(xiàn)m6A修飾相關(guān)基因或許可預(yù)測HCC免疫治療療效。m6A又叫N6-甲基腺苷，是真核生物中含量最多的修飾型RNA。使用LASSO分析將YTHDF2、YTHDF1、METTL3等m6A相關(guān)基因構(gòu)建風(fēng)險模型。結(jié)果表明，風(fēng)險評分較低的患者具有更長的OS(HR=3.81，95%CI：1.13～11.08，P=0.03)，并且具有較高水平的CD4+TILs及B淋巴細(xì)胞；相反風(fēng)險評分高的患者有較高的M0巨噬細(xì)胞及Tregs，導(dǎo)致腫瘤血管生成。結(jié)果提示m6A相關(guān)修飾基因可能作為生物標(biāo)志物預(yù)測抗PD-1免疫治療。

1.5.2 CMTM4趨化因子 Chui等[32]發(fā)現(xiàn)CMTM4(趨化因子跨膜結(jié)構(gòu)域的家族成員)有望成為標(biāo)志物之一。研究發(fā)現(xiàn)CMTM4在人類HCC中過表達(dá)。在構(gòu)建HCC小鼠模型中，CMTM4低表達(dá)的生長速度較慢，它通過網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞和蛋白酶體途徑防止PD-L1降解。通過下調(diào)CMTM4可以抑制由IFN-γ驅(qū)動的PD-L1表達(dá)或其他致癌信號通路，重新激活CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫。

1.5.3 Wnt/β-catenin通路 近來Wnt/β-catenin通路已被確定為免疫逃逸的重要致癌因素。一項研究發(fā)現(xiàn)該通路的激活與較低的疾病控制率(Disease control rate，DCR)(0%vs.53%)、較短的中位PFS(2.0個月vs.7.4個月)和較短的中位OS(9.1個月vs.15.2個月)相關(guān)。該通路導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞和抗原特異性T細(xì)胞的缺陷，建立“免疫冷腫瘤”，導(dǎo)致對免疫治療的耐藥，可以作為HCC患者免疫治療排除的新生物標(biāo)志物[33]。

2 腫瘤組織外標(biāo)志物

2.1 外周血標(biāo)志物

2.1.1 甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP)和異常凝血酶原 甲胎蛋白是HCC診治中常用的生物標(biāo)志物。國內(nèi)一項研究證實了早期AFP水平可以作為免疫治療的標(biāo)志物，將HCC患者分為早期反應(yīng)組和無反應(yīng)組兩組(反應(yīng)組：治療開始的4周內(nèi)血清AFP水平較治療前下降>20%)。結(jié)果證實早期AFP反應(yīng)組的中位OS(28.0個月vs.11.2個月，P=0.048)和中位PFS(15.2個月vs.2.7個月，P=0.002)均較長[34]。異常凝血酶原Ⅱ(Protein induced by vitamin k Absence or Antagonist-II，PIVKA-II)是一種異常的凝血酶原蛋白[35]。有研究發(fā)現(xiàn)，血清PIVKA-II水平與患者TNM分期和腫瘤大小呈正相關(guān)[36]。研究證實[37]，AFP下降>50%和PIVKA-Ⅱ下降>50%分別與更長的OS和PFS相關(guān)，兩者的綜合預(yù)測模型評分較低的患者有更長的OS及PFS。

2.1.2 TGF-β 大量研究證實TGF-β在HCC TME中起重要作用[38]。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(Liver sinusoidal endothelial cells，LSECs)和肝星狀細(xì)胞(Hepatic Stellate Cells，HSCs)產(chǎn)生的TGF-β通過激活SMAD2/3上調(diào)Tregs和促炎因子，阻斷T細(xì)胞抗原受體的信號傳導(dǎo)并抑制T細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性介質(zhì)的分泌，從而導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭。有研究顯示[5]，免疫治療應(yīng)答組的TGF-β水平低于無應(yīng)答組(P=0.003)。另外一項基礎(chǔ)實驗也論證了TGF-β可以上調(diào)T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)，減弱淋巴細(xì)胞殺傷力，但需進(jìn)一步在人體中驗證[39]。

2.1.3 炎癥評分 國內(nèi)一項研究證實了粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞比值(Neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR)和血小板淋巴細(xì)胞比值(Platelet-lymphocyte ratio，PLR)較低的患者OS及完全緩解率均較高[40]。還有相關(guān)研究指出CAR(CRP與白蛋白比率)、SII(SII=P×N/L)等炎癥評分較低的患者具有更長的OS和PFS，同時該研究建立了包括格拉斯哥預(yù)后評分(GPS)等在內(nèi)的炎癥評分預(yù)測模型，需要進(jìn)一步探索模型的適用性[41]。有研究表明炎癥評分較高提示大量中性粒細(xì)胞衍生的IL-18和血管內(nèi)皮生長因子生成，減弱淋巴細(xì)胞殺傷力，增加腫瘤血供，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活[42]。

2.2 腸道菌群

Zheng等[43]選取給予帕博利珠單抗治療的肝細(xì)胞癌患者，通過宏基因組測序評估腸道細(xì)菌特征的動態(tài)變化，結(jié)果提示應(yīng)答組(R組)顯示出比無應(yīng)答組(NR組)更高的分類群豐富度。R組主要富含乳酸桿菌屬，可抑制腐敗劑的生長，提高宿主免疫能力。NR組中變形桿菌則占據(jù)主導(dǎo)地位。另外一項研究表明糞便桿菌屬的豐度越高，PFS越高[44]?？傊?，腸道-微生物種類及豐度的變化可能成為預(yù)測HCC免疫治療的因素，但具體機(jī)制及其與免疫環(huán)境的關(guān)系還需進(jìn)一步驗證。

3 宿主特征

3.1 甲狀腺功能減退

Xu等[45]納入接受免疫治療的HCC患者，結(jié)果證實甲減組的中位PFS(6.27個月)高于非甲減組(5.68個月)，且甲狀腺功能減退和患者預(yù)后相關(guān)(P=0.012)。相關(guān)研究表明[46]，S2域(甲狀腺激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域)可以結(jié)合T4和T3，通過磷脂酶C(PLC)和蛋白激酶C(PKCα)激活絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(MAPK/ERK1/2)通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。

3.2 營養(yǎng)狀況

有研究證實患者的體重指數(shù)(BMI)或許可以作為預(yù)測因素之一[47]。研究發(fā)現(xiàn)BMI>25的患者中位生存期較長(5個月vs.17.5個月，P=0.034)。BMI增加對一些癌癥患者有保護(hù)作用[48]。與BMI有關(guān)的白色脂肪，是一部分趨化因子的來源，會刺激記憶性T淋巴細(xì)胞的儲存。Mei等[41]研究發(fā)現(xiàn)PNI指數(shù)(PNI=白蛋白+5×淋巴細(xì)胞計數(shù))高的患者生存率較高(24個月總生存率：51.5%vs.25.7%，P<0.001)。PNI指數(shù)低提示淋巴細(xì)胞減少及白蛋白降低[49]，即免疫能力減弱，而營養(yǎng)不良狀態(tài)會削弱吞噬功能和其他防御機(jī)制。

3.3 磁共振HCC結(jié)節(jié)信號

Aoki等[50]使用釓-乙氧基芐基-二乙烯三胺(Gd-EOB-DTPA)的肝膽期增強(qiáng)磁共振成像(MRI)評估HCC患者對PD-1抑制劑的反應(yīng)。研究結(jié)果證實肝膽期圖像上信號較高患者的中位PFS明顯較短(2.7個月vs.5.8個月，P=0.007)。Gd-EOB-DTPA是肝細(xì)胞通過有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1B3(OATP1B3)攝取MRI的肝臟特異性造影劑。有研究發(fā)現(xiàn)具有Wnt/β-catenin改變的HCC患者的OATP1B3表達(dá)明顯更高。這種高信號的HCC結(jié)節(jié)可能是一種預(yù)測抗PD-1治療反應(yīng)不佳的成像生物標(biāo)志物[51]。

4 其他

一項研究揭示了細(xì)胞周期蛋白和HCC患者免疫浸潤相關(guān)[52]。細(xì)胞周期蛋白可以和相關(guān)激酶結(jié)合調(diào)節(jié)G2/M期。該研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白B1(Cyclin B1，CCNB1)、細(xì)胞周期蛋白B2(Cyclin B2，CCNB2)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(Cyclin-dependentkinase1，CDK1)在HCC組織中高表達(dá)，并且可調(diào)節(jié)多種免疫浸潤細(xì)胞的表達(dá)，將其抑制劑與免疫療法相結(jié)合可能會改善HCC患者的生存時間。賴氨酸特異性脫氧酶可以促進(jìn)PD-L1的表達(dá)，給予該酶的抑制劑后，會增強(qiáng)PD-1抑制劑治療HCC療效，諸如此類，還有很多不同層面的標(biāo)志物都在研究中[53]。

5 小結(jié)與展望

以PD-1抑制劑為代表的免疫治療給晚期不可手術(shù)的肝細(xì)胞癌患者帶來了新希望，但是目前總反應(yīng)率仍不盡如人意，因此急需探索生物標(biāo)志物以篩選優(yōu)勢人群。大量查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合臨床應(yīng)用實際情況，發(fā)現(xiàn)很多不同種類的生物標(biāo)志物都在研究中，但目前尚沒有得到國際公認(rèn)且臨床廣泛應(yīng)用的標(biāo)志物，仍面臨取材困難、異質(zhì)性大和靈敏度差等挑戰(zhàn)。但是根據(jù)目前的研究熱點(diǎn)及發(fā)展趨勢，腫瘤免疫微環(huán)境的特征綜合評分及特征基因及通路極有可能會成為未來潛力最大的生物標(biāo)志物。未來需要建立多種不同層面的綜合因素模型，為肝細(xì)胞癌的免疫治療添磚加瓦。