溫曉星 劉大海 吳學(xué)輝 王炳平 房濤

肺癌是世界上發(fā)病率第二高的腫瘤，其死亡率居所有腫瘤的首位[1]。晚期非小細胞肺癌的治療仍然是目前肺癌治療的難點[2]。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)是治療EGFR有義突變的主要靶向藥物。但是，大多數(shù)患者在接受EGFR-TKI類藥物治療后1年左右會出現(xiàn)藥物耐藥[3]。EGFR-TKI耐藥機制及靶向的研究是目前肺癌耐藥主要的研究方向。

骨橋蛋白又被稱作分泌型磷酸糖蛋白1(SPP1)，在肺癌中異常高表達。有研究發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白可以促進非小細胞肺癌對順鉑耐藥[4]。但骨橋蛋白在吉非替尼耐藥中的具體作用存在爭議，Wang等[5]發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白通過磷酸化EGFR，從而增加肺癌對吉非替尼的敏感性。Fu 等[6]發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白通過活化PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)非小細胞肺癌對吉非替尼耐藥。

本研究我們通過檢測骨橋蛋白在PC9R細胞中的表達，通過線粒體膜電位實驗進一步分析骨橋蛋白與吉非替尼耐藥細胞線粒體功能的關(guān)系。進一步證明骨橋蛋白在PC9R細胞生長過程的作用。為克服非小細胞肺癌吉非替尼耐藥提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人非小細胞肺癌PC9細胞株及吉非替尼耐藥的PC9R細胞株為復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院惠贈。吉非替尼購自Selleckchem公司。滅活胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、TRIzol試劑、線粒體膜電位檢測(MitoProbeTMJC-1 assay)試劑盒、EdU試劑盒購自賽默飛世爾科技公司。反轉(zhuǎn)錄酶購自TOYOBO公司。CCK-8試劑盒購自日本dojindo公司。SPP1抗體購自Abcam公司。Bax、Survivin、Cleaved caspase-3、Cleaved PARP抗體購自CST公司。流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

PC9和PC9R細胞在含有10%熱滅活胎牛血清和100 U/mL青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過在培養(yǎng)基中添加1 μM吉非替尼來維持PC9R細胞對吉非替尼耐藥性。腫瘤細胞在恒溫箱中以37℃、5% CO2的條件下孵育。

1.3 細胞增殖實驗

依據(jù)CCK-8試劑盒說明書，將敲除骨橋蛋白的PC9R細胞及對照組細胞按照1 000個/孔，接種在96孔板上，并加入培養(yǎng)基200 μL。培養(yǎng)24 h后，每孔加 CCK-8溶液 10 μL，37℃孵育1 h。最后，使用酶標儀測量450 nm處的吸光度值。每組實驗均重復(fù)三次。

1.4 線粒體膜電位檢測實驗

使用線粒體膜電位試劑盒檢測線粒體膜電位的變化。JC-1是一種熒光探針，用JC-1轉(zhuǎn)染PC9R細胞，JC-1在正常線粒體基質(zhì)中聚合發(fā)出紅色熒光。腫瘤細胞凋亡早期，因線粒體功能受損，線粒體膜電位降低，JC-1單體游離于細胞漿內(nèi)發(fā)出綠色熒光。收集敲減骨橋蛋白(shSPP1)的PC9R細胞及對照組(shNEG)細胞，重現(xiàn)懸浮于培養(yǎng)基中，濃度為5×106個/mL。取0.5 mL懸浮液加入0.5 mL JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。在孵育期間，按照每1 mL JC-1染色緩沖液(5X)加入4 mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液(1X)，并放置于冰浴。37℃孵育結(jié)束后，600 g 4℃離心3～4 min，沉淀細胞。用JC-1染色緩沖液(1X)洗滌2次：加入1 mL JC-1染色緩沖液(1X)重懸細胞，600 g 4℃離心3～4 min，沉淀細胞，棄上清。再加入1 mL JC-1染色緩沖液(1X)重懸細胞，600 g 4℃離心3～4 min，沉淀細胞，棄上清。再用適量JC-1染色緩沖液(1X)重懸后。實驗結(jié)果通過流式細胞儀檢測。正常的線粒體在590 nm處發(fā)出紅色熒光，而去極化受損的線粒體在490 nm處發(fā)出綠色熒光。

1.5 EdU細胞增殖實驗

用10 μM EdU對PC9和PC9R細胞孵育4 h，在室溫下用含有3.7%甲醛的PBS固定15 min。根據(jù)EdU細胞增殖試劑盒以及我們以前實驗方法[7]，配置5個反應(yīng)的Click反應(yīng)液，每孔加入500 μL反應(yīng)液，并加用DNA染料Hoechst33342混勻。使用共焦激光掃描顯微鏡進行共焦成像。通過使用Image J系統(tǒng)計算EdU陽性和Hoechst 33342染色陽性的PC9R細胞數(shù)。

1.6 細胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的PC9R細胞，胰酶消化離心后接種在6孔板中，第二天細胞密度約60%～80%時進行病毒感染，包裹腺病毒的骨橋蛋白敲減質(zhì)粒(shSPP1 組)和對照組質(zhì)粒(shNEG)購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，轉(zhuǎn)染操作和病毒使用滴度嚴格按照說明書進行。

1.7 免疫蛋白印跡法實驗(Western blot，WB)

使用蛋白裂解液消化細胞后，提取目標細胞的總蛋白。配制10%聚丙烯酰胺凝膠分離膠，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上。SPP1抗體(1∶200)、Bax抗體(1∶200)、Cleaved caspase-3(1∶200) ，Cleaved PARP(1∶200)、β-actin(1∶20 000)孵育NC膜4℃過夜。并使用辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)孵育。暗室中用Super Signal化學(xué)發(fā)光底物顯色并對條帶進行分析。實驗以β-actin為內(nèi)參蛋白。

1.8 實時定量PCR(Quantitative RT-PCR qPCR)

應(yīng)用TRIzol試劑提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒明書，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA按1∶50稀釋后進行定量PCR實驗。20 ng RNA量為反應(yīng)底物，一共設(shè)置40個循環(huán)，參數(shù)設(shè)置如下：95℃，15 s；60℃，15 s；72℃，45 s。根據(jù)每個樣本的CT值計算2-ΔΔCT，進行比較。β-actin為內(nèi)參。每組實驗均重復(fù)三次。引物序列祥見表1。

表1 PCR所用引物

1.9 統(tǒng)計分析

使用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5.0進行統(tǒng)計分析。計量資料以平均值±標準差表示，使用雙因素方差分析(Two—way ANOVA)分析分組與濃度對PC9R細胞增殖的影響，組間比較行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨橋蛋白在吉非替尼耐藥細胞中的表達水平

qPCR實驗結(jié)果顯示，在mRNA水平骨橋蛋白在吉非替尼耐藥PC9R細胞中表達量較PC9細胞明顯增加(P<0.001)(圖1A)。通過WB檢測骨橋蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白在PC9R細胞中的表達量較PC9細胞明顯增加(圖1B)。

圖1 骨橋蛋白在吉非替尼耐藥細胞中的表達水平

2.2 敲減骨橋蛋白對PC9R細胞線粒體膜電位的作用

qPCR實驗結(jié)果顯示，與shNEG組相比，shSPP1組骨橋蛋白mRNA表達明顯降低(P<0.05)(圖2A)。Western blot結(jié)果顯示，與shNEG組相比，shSPP1組骨橋蛋白的表達水平明顯降低(P<0.05)(圖2B)。流式細胞儀檢測兩組細胞的熒光強度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲減骨橋蛋白后，shSPP1組發(fā)生綠色熒光的細胞比例明顯增加，進一步證明敲減骨橋蛋白引起PC9R細胞線粒體功能障礙(P<0.05)(圖2C，D)。

圖2 敲減骨橋蛋白對PC9R細胞線粒體膜電位的作用

2.3 敲減骨橋蛋白對凋亡相關(guān)蛋白表達水平的作用

線粒體膜功能異常是誘導(dǎo)細胞凋亡的重要作用機制，在PC9R細胞中敲減骨橋蛋白后，本研究發(fā)現(xiàn)凋亡促進基因Cleaved caspase-3、Cleaved PARP及Bax升高，進一步證明敲減骨橋蛋白改變線粒體膜電位從而導(dǎo)致細胞凋亡(圖3)。

圖3 減骨橋蛋白對凋亡相關(guān)蛋白表達水平的作用

2.4 敲減骨橋蛋白對PC9R細胞增殖的抑制作用

敲減骨橋蛋白促進吉非替尼耐藥細胞發(fā)生凋亡，為進一步驗證骨橋蛋白對吉非替尼耐藥細胞增殖功能作用，通過CCK-8實驗，本研究發(fā)現(xiàn)敲減骨橋蛋白抑制吉非替尼耐藥細胞的增殖(P<0.05)(圖4A)。為進一步證實骨橋蛋白在吉非替尼耐藥過程中的作用，通過EdU增殖實驗發(fā)現(xiàn)敲減骨橋蛋白后，吉非替尼耐藥細胞的增殖活性被明顯抑制(P<0.05)(圖4B，C)，進一步證明敲減骨橋蛋白促進吉非替尼的抗腫瘤作用。

圖4 敲減骨橋蛋白對PC9R細胞增殖的抑制作用

3 討論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，晚期非小細胞肺癌的治療方法已經(jīng)從傳統(tǒng)的化學(xué)藥物治療轉(zhuǎn)向分子靶向藥物和免疫檢查點抑制劑。吉非替尼等酪氨酸激酶抑制劑通過阻斷EGFR信號通路抑制腫瘤生長[8]。以吉非替尼和奧西替尼等為代表的小分子酪氨酸激酶抑制劑已經(jīng)成為EGFR有義突變的晚期非小細胞肺癌的一線治療選擇。然而EGFR-TKI類藥物一線治療非小細胞肺癌的有效率在70%～80%。仍有一部分EGFR突變的患者不能從小分子酪氨酸激酶抑制劑中獲益[9]。并且對于大部分患者而言，常規(guī)口服吉非替尼等第一代酪氨酸激酶抑制劑1年左右時間后會發(fā)生疾病進展及藥物耐藥[10]。EGFR-TKI類藥物的耐藥是目前肺癌治療亟需解決的問題。

目前研究發(fā)現(xiàn)，多種機制均參與調(diào)節(jié)EGFR-TKI類藥物耐藥。其中EGFR第20外顯子T790M突變是吉非替尼獲得性耐藥最主要的機制之一[8]。其他的耐藥機制包括c-met[11]、肝細胞生長因子(HGF)擴增[12]以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[13]等。目前仍然有大約25%的EGFR-TKIs耐藥機制是不明確的[10]。

骨橋蛋白是一種分泌型磷酸糖蛋白，在肺癌、乳腺癌和肝癌等多種腫瘤中起到重要作用[14]。Donati等[15]研究發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白在肺癌組織中表達明顯升高，骨橋蛋白的高表達與肺癌復(fù)發(fā)相關(guān)。骨橋蛋白的高表達促進肺癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等[16]。在化療藥物耐藥機制研究中，骨橋蛋白通過AKT信號通路增加了對順鉑的耐藥性[5]。然而在EGFR-TKIs耐藥機制的研究中，卻存在明顯的爭議。Wang等[17]報道在肺癌中骨橋蛋白促進阿法替尼的獲得性耐藥。2020年Fu[6]在《J Hematol Oncol》發(fā)表的文章中提到，作者通過CCK-8實驗證明敲減骨橋蛋白抑制吉非替尼耐藥細胞的增殖，并激活了integrin αVβ3/ FAK信號通路，從而增加了肺癌細胞對吉非替尼及奧希替尼的耐藥性。然而2021年Wang等[5]卻發(fā)現(xiàn)在肺癌細胞中加入分泌性的骨橋蛋白，能增加吉非替尼對肺癌細胞的殺傷作用，進一步分析發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白通過促進EGFR的磷酸化，增加肺癌細胞對吉非替尼的敏感性。臨近的兩項研究得到截然相反的實驗結(jié)果，其中可能與不同細胞系及腫瘤微環(huán)境影響骨橋蛋白的功能有關(guān)。同樣說明骨橋蛋白在EGFR-TKIs耐藥作用機制的復(fù)雜性。

凋亡是酪氨酸激酶抑制劑抗腫瘤過程中的重要機制之一[18]。為了進一步明確骨橋蛋白在吉非替尼耐藥中的作用，我們進行了線粒體膜電位實驗。線粒體功能受損是細胞凋亡早期的主要表現(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)敲減骨橋蛋白后，吉非替尼耐藥細胞的線粒體膜電位出現(xiàn)異常，導(dǎo)致線粒體功能發(fā)生障礙，最終引起凋亡相關(guān)蛋白的表達，促進腫瘤細胞凋亡發(fā)生。Bax是細胞凋亡過程中的重要分子，凋亡發(fā)生的過程中，細胞漿中的Bax可插入線粒體外膜上，從而改變線粒體膜功能，增加線粒體膜鈣離子的滲透性。敲減骨橋蛋白的PC9R細胞中Bax表達量異常增加，進一步證明敲減骨橋蛋白改變線粒體膜電位從而導(dǎo)致細胞凋亡。

為了進一步驗證骨橋蛋白對耐藥細胞的增殖作用，我們常規(guī)進行CCK-8實驗，得到與之前實驗同樣的結(jié)果[6]。同時我們還進行了EdU細胞增殖實驗，通過共聚焦顯微鏡，我們直觀的發(fā)現(xiàn)敲減骨橋蛋白后，吉非替尼耐藥細胞的增殖活性被明顯抑制。通過不同的實驗方法，我們進一步證明敲減骨橋蛋白明顯抑制吉非替尼耐藥細胞的增殖。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白在吉非替尼耐藥的PC9R細胞中異常高表達，證實敲減骨橋蛋白導(dǎo)致PC9R細胞線粒體膜電位受損，并促進凋亡相關(guān)蛋白的表達。通過CCK-8和EdU細胞增殖實驗再次驗證敲減骨橋蛋白抑制吉非替尼耐藥細胞的增殖。敲減骨橋蛋白促進細胞凋亡。