莫丹梅 藍(lán)黃麗 李國(guó)力 楊文琪 徐開(kāi)遵

(廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 南寧 530004)

蠶沙是蠶業(yè)生產(chǎn)的大宗副產(chǎn)物之一，每生產(chǎn)100 kg蠶繭可得600 kg風(fēng)干蠶沙[1]。蠶沙富含有機(jī)物質(zhì)及各種養(yǎng)分元素[2]，可發(fā)酵成有機(jī)肥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。然而，蠶沙也是家蠶病原物的載體之一，因此，蠶沙的無(wú)害化、肥料化處理無(wú)論是對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)副產(chǎn)物的高效、合理利用，還是對(duì)阻斷家蠶病原物的傳播途徑，都具有重要的意義。

據(jù)報(bào)道，銳鈦礦型納米二氧化鈦表現(xiàn)出強(qiáng)的光活性，其抗菌、抗紫外線等功能突出，已廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域[3]。近年來(lái)，將納米二氧化鈦?zhàn)鳛樘硎硠?yīng)用于養(yǎng)蠶生產(chǎn)的研究在國(guó)內(nèi)外取得了一定進(jìn)展。已有研究表明，以5 mg/L納米二氧化鈦?zhàn)鳛樘砑觿﹪姙⒃谏Ｈ~上飼喂家蠶，有利于家蠶生長(zhǎng)發(fā)育，不僅可提高飼料效率以及全繭量和繭層量[4-5]，還能促進(jìn)家蠶生殖發(fā)育[6]、絲蛋白合成[7]以及脂肪和碳水化合物的合成與代謝[8-9]。此外，添食納米二氧化鈦還能在一定程度上增強(qiáng)家蠶對(duì)核型多角體病毒(BmNPV)和黑胸?cái)⊙?BmBb)的抵抗性[10-12]，能緩解辛硫磷農(nóng)藥對(duì)家蠶神經(jīng)系統(tǒng)[13]、絲腺[14-15]、中腸及脂肪體的損傷[16-17]，提高家蠶幼蟲(chóng)微量農(nóng)藥中毒后的存活率以及蠶繭產(chǎn)量和質(zhì)量。隨著研究的深入，程嵐[18]采用ICP-MS法測(cè)定了納米Cu、Ag金屬粒子能否被家蠶吸收及其進(jìn)入蠶體后的代謝途徑，結(jié)果表明這2種納米金屬粒子都能夠通過(guò)食物被家蠶吸收，在家蠶的血淋巴、表皮、前部絲腺、中部絲腺以及后部絲腺中均有分布，但大部分的納米粒子則是通過(guò)蠶沙排到了體外。雖然家蠶添食納米二氧化鈦的益處已有較多的研究報(bào)道，但蠶沙中含有的納米二氧化鈦對(duì)蠶沙肥料發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響尚不清楚。因此，本研究用5 mg/L納米二氧化鈦處理蠶沙后，采用Illumina Miseq技術(shù)對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)域測(cè)序，分析納米二氧化鈦處理對(duì)蠶沙細(xì)菌群落影響，為制備含納米二氧化鈦的蠶沙有機(jī)肥，拓展納米二氧化鈦在蠶業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 材料

供試家蠶品種為兩廣二號(hào)，由廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學(xué)研究院饋贈(zèng)。供試納米二氧化鈦為銳鈦礦型，購(gòu)自杭州萬(wàn)景公司，平均粒徑為6～10 nm。將供試的納米二氧化鈦配置成5 mg/L懸濁液。

1.2 蠶沙處理方法

飼養(yǎng)家蠶收獲5齡蠶的蠶沙，等量分成對(duì)照組和處理組，每組6 kg，各設(shè)3個(gè)平行重復(fù)組。處理組蠶沙添加5 mg/L納米二氧化鈦500 mL并攪拌均勻，對(duì)照組以等量無(wú)菌水代替。在相同環(huán)境條件下放置24 h后，在對(duì)照組和處理組中分別隨機(jī)選取5個(gè)點(diǎn)采集蠶沙樣品，將采集的蠶沙充分混勻成1個(gè)樣品，各取3次重復(fù)。后續(xù)對(duì)蠶沙樣本的細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)域測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

經(jīng)Illumina MiseqTM/HiseqTM得到各樣本有效數(shù)據(jù)后，進(jìn)行操作分類(lèi)單元(OTU)聚類(lèi)，以相似性>97%的非重復(fù)序列為標(biāo)準(zhǔn)，去除嵌合體后得到OTU代表序列，再將所有優(yōu)化序列與OTU代表序列比對(duì)，選取相似性97%以上的序列進(jìn)行物種注釋及統(tǒng)計(jì)、物種分布、相對(duì)豐度、功能注釋和BugBase分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶沙菌群測(cè)序的序列數(shù)目和OTU聚類(lèi)

按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列 (不含單序列) 進(jìn)行OTU聚類(lèi)，對(duì)照組和處理組蠶沙測(cè)序分別獲得62個(gè)和61個(gè)OTU，覆蓋度均達(dá)到99%(表1)，其中對(duì)照組和處理組共有的OTU數(shù)為50個(gè)，對(duì)照組和處理組特有的OTU數(shù)分別為12個(gè)和11個(gè)(圖1)。去除Read引物接頭，對(duì)照組和處理組樣品分別平均獲得62 648和66 284有效序列。

表1 納米二氧化鈦處理蠶沙中的菌群高通量測(cè)序結(jié)果

圖1 納米二氧化鈦處理組與對(duì)照組蠶沙菌群分布韋恩圖

2.2 蠶沙菌群的α多樣性

α多樣性又被稱(chēng)之為生境內(nèi)的多樣性(within-habitat diversity)。蠶沙經(jīng)納米二氧化鈦處理后，反映樣品中含OTU 數(shù)目的Chao指數(shù)與菌群組成豐富度和均勻度的Ace指數(shù)均高于對(duì)照組，表明納米二氧化鈦處理增加了菌群的豐度。對(duì)照組蠶沙樣品反映菌群多樣性的Shannon指數(shù)高于處理組，Simpson指數(shù)則低于處理組(表2)，表明處理組菌群多樣性低于對(duì)照組。綜上所述，納米二氧化鈦處理增加了蠶沙菌群的豐度，但菌群的多樣性降低。

表2 納米二氧化鈦處理對(duì)蠶沙菌群豐度和多樣性的影響

2.3 蠶沙菌群中優(yōu)勢(shì)菌的相對(duì)豐度

對(duì)蠶沙菌群中優(yōu)勢(shì)菌的相對(duì)豐度進(jìn)行分析，結(jié)果表明：在分類(lèi)階元門(mén)和綱水平上，對(duì)照組和處理組蠶沙中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)(圖2-A)、優(yōu)勢(shì)菌綱(圖2-B)類(lèi)別均相同，只是相對(duì)豐度不同；在目水平，處理組蠶沙中假單孢桿菌目(Pseudomonadales)消失(圖2-C)；在科水平，處理組蠶沙中新增了棒狀桿菌科(Corynebacteriaceae)，而莫拉菌科(Moraxellaceae)則消失(圖2-D)；在屬水平，處理組蠶沙中葡萄球菌屬(Staphylococcus)豐度增加，此外還新增了棒桿菌屬(Corynebacterium)，而不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)消失(圖2-E)?？梢?jiàn)，納米二氧化鈦處理蠶沙，對(duì)其中的不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌具有抑制作用，而與其具有拮抗作用的葡萄球菌屬、棒桿菌屬則豐度增加。

A～E圖分別為對(duì)照組在門(mén)、綱、目、科、屬水平上的優(yōu)勢(shì)菌群差異。

2.4 蠶沙菌群的功能注釋

COG功能注釋結(jié)果表明，處理組蠶沙具有復(fù)制、重組和修復(fù)[(L)Replication, recombination and repair]功能的細(xì)菌增加，具有脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝[(I)Lipid transport and metabolism]、轉(zhuǎn)錄[(K)Transcription]、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[(N)Cell motility]、次級(jí)代謝物生物合成、運(yùn)輸和分解代謝[(Q)Secondary metabolites biosynthesis, transport, and catabolism]、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸[(U)Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport]等功能的細(xì)菌減少，具有其余功能的細(xì)菌差異不顯著(圖3-A)。FAPROTAX功能注釋結(jié)果表明：納米二氧化鈦處理蠶沙引起具有以下功能的菌類(lèi)減少，包括芳香族化合物降解(aromatic compound degradation)、纖維素水解(cellulolysis)，哺乳動(dòng)物腸道(mammal gut)、人類(lèi)腸道(human gut)感染，碳?xì)浠衔锝到?hydrocarbon degradation)、脂肪族非甲烷烴降解(aliphatic non methane hydrocarbon degradation)、芳香烴降解(aromatic hydrocarbon degradation)；具有以下功能的菌類(lèi)則增加，如葉綠體形成(chloroplasts)、氮呼吸(nitrogen respiration)、硝酸鹽呼吸(nitrate respiration)、尿解(ureolysis)、甲基營(yíng)養(yǎng)(methylotrophy)、甲醇氧化(methanol oxidation)；具有發(fā)酵功能(fermentation)的菌類(lèi)無(wú)明顯差異(圖3-B)?？梢?jiàn)，納米二氧化鈦處理可使蠶沙中對(duì)哺乳動(dòng)物及人類(lèi)腸道有害的致病菌減少，而具有光合作用和氮呼吸功能的菌類(lèi)增加，同時(shí)也不會(huì)影響蠶沙的發(fā)酵功能。

進(jìn)一步對(duì)差異菌進(jìn)行了BugBase分析，結(jié)果表明，納米二氧化鈦處理使蠶沙中的需氧型菌群減少(圖4-A)，厭氧型(圖4-B)和兼性厭氧型(圖4-C)菌群增加；革蘭陰性菌減少(圖4-D)，革蘭陽(yáng)性菌增加(圖4-E)。潛在致病性分析結(jié)果表明，對(duì)照組蠶沙中存在變形菌(Proteobacteria)等致病菌，而納米二氧化鈦處理后可完全抑制蠶沙中該類(lèi)菌的存活(圖4-F)。

圖3 納米二氧化鈦處理組與對(duì)照組蠶沙菌群的COG功能 (A)及FAPROTAX功能(B)注釋

A—需氧型菌群，B—厭氧型菌群，C—兼性厭氧型菌群，

3 小結(jié)

納米二氧化鈦具有抗菌特性，可作為添加劑提高家蠶產(chǎn)絲量，但家蠶食下的納米二氧化鈦大部分是通過(guò)蠶沙排出體外的。蠶沙是蠶桑產(chǎn)業(yè)中的大宗副產(chǎn)物，發(fā)酵成蠶沙有機(jī)肥是目前蠶沙最有效的利用方式。本研究結(jié)果表明，以納米二氧化鈦處理蠶沙，增加了蠶沙菌群的豐度，但菌群的多樣性降低；納米二氧化鈦抑制了蠶沙中的不動(dòng)桿菌屬，而與其具有拮抗作用的葡萄球菌屬、棒桿菌屬則豐度增加。此外，F(xiàn)APROTAX功能注釋結(jié)果表明，納米二氧化鈦處理使蠶沙中對(duì)哺乳動(dòng)物及人類(lèi)腸道有害的致病菌減少，而使具有光合作用和氮呼吸功能的菌類(lèi)增加，同時(shí)不會(huì)影響蠶沙的發(fā)酵功能。進(jìn)一步的BugBase分析表明，納米二氧化鈦可增加蠶沙中厭氧型和兼性厭氧型菌群，對(duì)變形菌等致病菌具有良好的抑制作用。