尚孟秋，廖 良

作者單位：1(100020)中國(guó)北京市，北京中醫(yī)藥大學(xué)；2(100078)中國(guó)北京市，北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院眼科

0引言

非動(dòng)脈炎性前部缺血性視神經(jīng)病變(nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy, NAION)的發(fā)病率約為2.3/100000～10.2/100000[1]，臨床上常以急性視力下降和視野缺損為主要癥狀。NAION可導(dǎo)致嚴(yán)重視功能損害，但目前臨床上尚無(wú)特效治療方法[2]，主要通過(guò)改善視網(wǎng)膜血液循環(huán)以提高患者視功能；且NAION發(fā)病機(jī)制尚未明確，其分子機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。生物信息學(xué)通過(guò)聯(lián)系計(jì)算機(jī)與自然科學(xué)，能夠解釋復(fù)雜的生物機(jī)體，為研究疾病的生物學(xué)過(guò)程及分子機(jī)制提供新思路。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene coexpression network analysis, WGCNA)是依據(jù)基因與基因間的互作關(guān)系構(gòu)建的加權(quán)網(wǎng)絡(luò)[3]，在處理大量樣本的復(fù)雜數(shù)據(jù)時(shí)存在優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已應(yīng)用于癌癥、心衰等多種疾病[4]。本研究中使用WGCNA方法篩選出與NAION臨床特征高度相關(guān)的模塊，并對(duì)模塊內(nèi)進(jìn)行通路富集分析與關(guān)鍵基因篩選，并通過(guò)關(guān)鍵基因預(yù)測(cè)相關(guān)微小RNA(micro ribonucleic acid，miRNA),從而為闡明NAION的發(fā)病機(jī)制提供有力支持。

1材料和方法

1.1數(shù)據(jù)預(yù)處理與加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)GEO(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載芯片GSE43671，芯片平臺(tái)為GPL6294，其中包含18只NAION模型大鼠及18只空白對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜組織中的基因表達(dá)譜。利用R軟件(4.0.3)內(nèi)的limma包對(duì)原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)、基因名稱注釋、構(gòu)建表達(dá)矩陣等預(yù)處理。使用R語(yǔ)言中的WGCNA包對(duì)預(yù)處理后的基因表達(dá)譜進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)分析：(1)應(yīng)用hclust函數(shù)對(duì)樣本聚類，剔除離群樣本；(2)應(yīng)用pickSoftThreshold函數(shù)篩選合適的軟閾值以構(gòu)建無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)，設(shè)定擬合指數(shù)為R2≥0.85；隨后，用blockwiseModules函數(shù)通過(guò)動(dòng)態(tài)樹(shù)剪切算法對(duì)模塊聚類，要求最小簇基因數(shù)30個(gè)，合并相似模塊的閾值為0.25。

1.2特異性模塊識(shí)別與模塊內(nèi)基因相關(guān)性分析對(duì)每個(gè)模塊進(jìn)行主成分分析(principle component analysis, PCA)，將模塊特征基因值(module eigengene, ME)即模塊的第一主成分[5]與表型性狀相關(guān)聯(lián)，與性狀相關(guān)性R最高且P≤0.05的模塊即為組織特異性模塊，計(jì)算基因顯著性(gene significance， GS)和模塊成員(module membership, MM)，對(duì)模塊內(nèi)基因進(jìn)行篩選，范圍設(shè)置為MM>0.8且|GS|>0.2。

1.3富集分析使用R語(yǔ)言的clusterProfiler包對(duì)特異性模塊進(jìn)行基因本體論分析(GO)和京都基因與基因組百科全書(shū)分析(KEGG)富集分析。以P<0.05表示富集的通路有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4篩選核心基因與miRNA預(yù)測(cè)將特異性模塊內(nèi)符合篩選范圍的基因?qū)朐诰€數(shù)據(jù)庫(kù)STRING(https://cn.stringdb.org/cgi/network.pl)，選擇綜合分?jǐn)?shù)大于0.9的主要蛋白，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(proteinprotein interaction，PPI)，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件，使用軟件內(nèi)cytohubba插件，基于最大集團(tuán)中心性(maximal clique centrality, MCC)[6]篩選排名前10的關(guān)鍵基因。將獲得的關(guān)鍵基因?qū)隩argetScan數(shù)據(jù)庫(kù)[7]預(yù)測(cè)靶向miRNA，用Cytoscape繪制miRNA-關(guān)鍵基因網(wǎng)絡(luò)圖。

2結(jié)果

2.1加權(quán)基因共表達(dá)模塊構(gòu)建將高度設(shè)定為45，未發(fā)現(xiàn)離群樣本，納入所有樣本進(jìn)行分析，見(jiàn)圖1A。當(dāng)擬合指數(shù)R2為0.85時(shí)，選擇合適的軟閾值為9，見(jiàn)圖1B。使用動(dòng)態(tài)剪切樹(shù)算法分割模塊并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1C，在GSE43671數(shù)據(jù)集中共識(shí)別出22個(gè)模塊，見(jiàn)圖1D。繪制模塊相關(guān)性熱圖，見(jiàn)圖2A，根據(jù)模塊與性狀間的相關(guān)系數(shù)選擇特異性模塊，22個(gè)模塊中藍(lán)色模塊相關(guān)性系數(shù)最高(cor=0.79,P<0.01)，見(jiàn)圖2B。計(jì)算藍(lán)色模塊內(nèi)基因的|GS|和MM值并繪制散點(diǎn)圖，設(shè)置MM>0.8、|GS|>0.2對(duì)藍(lán)色模塊內(nèi)的基因進(jìn)行初步篩選，最終納入1380個(gè)基因進(jìn)行后續(xù)關(guān)鍵基因的篩選。

圖1 WGCNA分析NAION相關(guān)模塊 A：樣本聚類；B：選定最佳軟閾值；C：基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，確定共表達(dá)數(shù)據(jù)模塊；D：各模塊特征與性狀間的相關(guān)系數(shù)，括號(hào)中的數(shù)字為相應(yīng)的P值。

圖2 WGCNA分析NAION相關(guān)模塊 A：模塊聚類及相關(guān)性熱圖；B：GS與MM的相關(guān)性，cor為兩者間的絕對(duì)相關(guān)系數(shù)。

2.2富集分析將藍(lán)色模塊的全部1 958個(gè)基因納入分析，GO分析共得到富集分析通路130條，包括生物學(xué)過(guò)程(biological process, BP)93條、細(xì)胞組分(cellular component, CC)34條、分子功能(molecular function, MF)3條，排名前10的通路信息見(jiàn)表1；KEGG分析共富集得到通路18條，主要集中在神經(jīng)信號(hào)傳遞通路、人乳頭瘤病毒感染通路、MAPK通路、PI3K/Akt通路等，排名前10的通路見(jiàn)表2，應(yīng)用R語(yǔ)言GOplot包繪制GO分析可視化圖,ggplot2包繪制KEGG可視化圖(圖3)。

圖3 GO及KEGG富集分析圖 A：GO富集分析氣泡圖；B：KEGG富集分析氣泡圖；C：GO富集分析網(wǎng)絡(luò)圖。

表1 GO富集分析排名前10通路

表2 KEGG富集分析排名前10通路

2.3關(guān)鍵基因篩選及miRNA預(yù)測(cè)基于Cytoscape軟件中的cytohubba插件，關(guān)鍵基因?yàn)镸CC算法排名前10的基因，分別為Psmb9、Psma7、Map3k14、Psme1、Nfkb1、Rela、Psma5、Relb、Psmb4、Nfkb2，共預(yù)測(cè)得到6個(gè)miRNA靶點(diǎn)，分別為rno-miR-383-5p、rno-miR-9a-5p、rno-miR-155-5p、rno-miR-223-3p、rno-miR-495、rno-miR-325-3p(表3)，使用R語(yǔ)言的ggcorrplot包繪制關(guān)鍵基因的相關(guān)性圖(圖4A)，表明關(guān)鍵基因間存在正相關(guān)關(guān)系，使用cytoscape軟件繪制miRNA-關(guān)鍵基因網(wǎng)絡(luò)圖(圖4B)。

圖4 關(guān)鍵基因分析及miRNA預(yù)測(cè) A：關(guān)鍵基因相關(guān)性熱圖；B：關(guān)鍵基因-miRNA網(wǎng)絡(luò)圖。

表3 關(guān)鍵基因及miRNA預(yù)測(cè)

3討論

目前公認(rèn)的NAION誘發(fā)因素為視盤血供灌注壓降低和危險(xiǎn)視盤結(jié)構(gòu)[8]，現(xiàn)已證實(shí)的血管危險(xiǎn)因素包括高血壓、夜間低血壓、糖尿病等，同時(shí)可能與高脂血癥、貧血、吸煙、服用部分藥物等因素有關(guān)[9-10]。但目前NAION的病理機(jī)制尚未完全明確，且臨床上缺乏有效的治療藥物。因此，開(kāi)展NAION分子機(jī)制的研究有助于NAION的治療。

與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組差異基因分析方法相比，WGCNA算法能夠在基因相互關(guān)系的基礎(chǔ)上引入加權(quán)值，更充分地利用基因信息，從而構(gòu)建出了更具有生物學(xué)意義的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，更貼近生物體內(nèi)的真實(shí)情況。本研究通過(guò)WGCNA方法分析GSE43671數(shù)據(jù)集，共獲得22個(gè)模塊，其中藍(lán)色模塊相關(guān)性最為顯著，對(duì)藍(lán)色模塊內(nèi)基因進(jìn)行GO與KEGG富集分析，結(jié)果顯示這些基因主要富集于MAPK通路、PI3K/Akt通路等。PI3K/Akt是經(jīng)典的抗凋亡、促存活信號(hào)通路，也是保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)功能的重要通路。有研究表明PI3K/Akt通路可以通過(guò)激活下游mTOR分子，通過(guò)調(diào)控自噬以保護(hù)視神經(jīng)[11]。Husain等[12]學(xué)者研究表明PI3K/Akt通路可抑制RGCs的凋亡，其機(jī)制與促進(jìn)下游NF-κB活化，引起其調(diào)控的促凋亡基因的凋亡有關(guān)[13]。MAPK信號(hào)通路包含ERK、JNK、SAPK以及P38 MAPK共4條途徑，在細(xì)胞增殖、炎癥、凋亡等多種生物過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。Foxton等[14]學(xué)者證明P38 MAPK介導(dǎo)了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突遠(yuǎn)端運(yùn)輸丟失。Produit-Zengaffinen等[15]學(xué)者發(fā)現(xiàn)將JNK抑制劑注射進(jìn)入缺血再灌注大鼠的玻璃體腔內(nèi)，結(jié)果顯示RGCs凋亡率顯著下降。Yang等[16]證明MAPK通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)會(huì)打破軸突能量平衡，引起ATP減少以及鈣離子積累，最終激活鈣蛋白，使軸突破裂。以上實(shí)驗(yàn)證明MAPK信號(hào)通路對(duì)NAION有重要作用。

通過(guò)cytohubba插件對(duì)特異性模塊內(nèi)的基因進(jìn)行篩選，得出關(guān)鍵基因，關(guān)鍵基因中Rela、Relb均為NF-κB蛋白的亞基，Nfkb1、Nfkb2則分別調(diào)控NF-κB蛋白的亞基P50與P52,NF-κB能夠在能量平衡、炎癥及凋亡中發(fā)揮多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。Ando等[17]學(xué)者在體外實(shí)驗(yàn)中證明NF-κB可降低RGCs的凋亡率。

miRNA是一類由21～24個(gè)RNA構(gòu)成的非編碼蛋白單鏈RNA，其功能主要是將沉默的mRNA翻譯成蛋白質(zhì)，以此調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)，其在調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖等生物過(guò)程中起到重要作用。本文通過(guò)Target Scan數(shù)據(jù)庫(kù)共預(yù)測(cè)到6個(gè)miRNA，其中部分miRNA在神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用或其在眼科相關(guān)疾病中的作用已得到證實(shí)[18]。Wang等[19]學(xué)者通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明miR-155-5p可以促進(jìn)Wistar大鼠的神經(jīng)修復(fù)，其機(jī)制可能與cAMP/PKA通路有關(guān)；miR-9a-5p的上調(diào)可抑制ATG5介導(dǎo)的自噬活動(dòng)[20]，減輕大腦中動(dòng)脈閉塞導(dǎo)致的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷；miR-495可以通過(guò)Gria2蛋白減輕神經(jīng)元損傷[21]；miR-383可調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路的表達(dá)，Jiang等[22]發(fā)現(xiàn)miR-383上調(diào)會(huì)上調(diào)PRDX3表達(dá)，引起高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活力下降，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和活性氧形成。miR-325-3p在多種疾病的發(fā)展進(jìn)程中起作用，有研究表明上調(diào)miR-325-3p可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡[23]，過(guò)表達(dá)miR-325-3p可通過(guò)使MAPK通路失活來(lái)減少氧糖剝奪/復(fù)氧(OGD/R)誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡[24]。

綜上所述，本研究將WGCNA方法應(yīng)用到NAION以研究其基因表達(dá)，并篩選獲得關(guān)鍵基因，構(gòu)建miRNA-關(guān)鍵基因網(wǎng)絡(luò)，為研究NAION的發(fā)病機(jī)制和治療方法提供了新見(jiàn)解。但本研究同時(shí)也存在樣本量少且缺乏基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)等不足之處，下一步還需進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。