麻 凱,劉 江,王亞卉,池華博文,項敏泓
作者單位:1(200062)中國上海市,上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院眼科;2(200082)中國上海市,上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院眼科
結(jié)膜松弛癥(conjunctivochalasis,CCH)是臨床常見的眼表疾病,它是由于球結(jié)膜過度松弛和(或)下瞼緣張力升高,致使松弛的球結(jié)膜堆積在眼球與下瞼緣、內(nèi)眥部、外眥部之間形成皺褶,引起眼表淚液學微環(huán)境異常,常伴有眼部干澀、異物感、溢淚等不適癥狀的一種年齡相關(guān)性眼病,影響患者的視覺和生活質(zhì)量[1-3]。目前對結(jié)膜松弛癥的發(fā)病機制尚無明確定論,學者認為結(jié)膜松弛癥主要與結(jié)膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)兩者之間的失衡[4-5]、彈力纖維降解[6]、細胞衰老[7-9]等致病因素有關(guān)。成纖維細胞是疏松結(jié)締組織中的主要細胞,它不僅合成和分泌多種膠原蛋白和彈性蛋白,生成膠原纖維、網(wǎng)狀纖維和彈性纖維,還能分泌細胞外基質(zhì),是結(jié)膜組織中的重要成分之一[10-12]。自 De Falco等[13]報道體外成功提取人Tenon囊原代成纖維細胞以來,關(guān)于CCH的實驗研究進入了新的階段。但結(jié)膜成纖維細胞的原代提取及穩(wěn)定傳代對于初學者而言仍較為棘手,失敗率相對較高,因此有必要建立一種更加完善和高效的培養(yǎng)方法。本研究旨在通過原代培養(yǎng)、純化及鑒定,觀察不同培養(yǎng)時期內(nèi)CCH球結(jié)膜成纖維細胞的生長狀況及形態(tài)學變化,明確其生長周期,以期體外獲得穩(wěn)定、一致的CCH球結(jié)膜成纖維細胞,從而為CCH發(fā)病機制的研究及尋求切實有效的治療方法搭建平臺。
1.1材料
1.1.1標本收集結(jié)膜組織取自2021-03/06于上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院眼科確診為CCH Ⅲ級[14]且符合手術(shù)指征的患者6例10眼,年齡65~83(平均74.35±1.57)歲,其中2例3眼合并糖尿病病史。納入患者均行詳細的眼部檢查和手術(shù)評估,排除青光眼、瞼緣炎、角結(jié)膜疾病(結(jié)膜炎、角膜炎、角結(jié)膜腫瘤等)、淚囊炎、淚道阻塞等其他眼部疾病,由同一術(shù)者采用經(jīng)典的松弛結(jié)膜新月形切除術(shù)進行手術(shù)[15]。本研究已通過上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院倫理委員會批準(No.PTEC-A-2021-14-1),所有患者均簽署知情同意書。
1.1.2主要試劑及儀器DMEM細胞培養(yǎng)基(美國Hyclone公司);青霉素-鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液、胎牛血清(美國Gibco公司);波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體(ab137332)(英國Abcom公司);4%多聚甲醛固定液、免疫染色通透液(Triton X-100)、抗熒光淬滅封片液、山羊血清、Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG(H+L)二抗(A0208)(上海碧云天生物科技有限公司)。CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司);超凈工作臺(蘇凈安泰公司);倒置光學顯微鏡(日本Olympus公司);低溫高速離心機(德國Eppendorf公司);離心機(長沙湘儀公司);酶聯(lián)免疫檢測儀(Bmg Labtech公司);熒光顯微鏡(德國Leica公司);高精確電子分析天平(德國Sartorious公司)。
1.2方法
1.2.1原代細胞培養(yǎng)無菌條件下取手術(shù)切除的松弛結(jié)膜組織,生理鹽水沖洗祛除血污,立即放入裝有完全培養(yǎng)基的1.5mL EP管中,低溫保存,采用組織塊貼壁法行原代球結(jié)膜成纖維細胞的分離培養(yǎng)。超凈工作臺中用眼科顯微剪修剪結(jié)膜組織約1mm×1mm大小,移入25cm2培養(yǎng)瓶中,將結(jié)膜組織平鋪于培養(yǎng)瓶底,待其微微干燥時,貼壁緩緩加入5mL含體積分數(shù)10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、1%生長因子的DMEM完全培養(yǎng)液,勿使組織浮起。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),每2~3d換液1次,倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。
1.2.2細胞傳代觀察CCH球結(jié)膜成纖維細胞生長特性,組織貼壁細胞生長到第8d時行消化、傳代。超凈工作臺中取出培養(yǎng)瓶,棄去培養(yǎng)基,加入1mL PBS洗滌,輕輕晃動,棄去PBS,再加入1mL 0.25%胰蛋白酶(EDTA)后靜置2min,倒置顯微鏡下觀察。當細胞質(zhì)出現(xiàn)回縮,細胞變圓呈球形,細胞連接松散或有成片的細胞浮起時,表示消化時間適合,立即加入1mL完全培養(yǎng)基終止消化。離心管離心,見其底部乳白色細胞團塊,棄去上清液,加入1mL完全培養(yǎng)基,輕輕吹打制成均勻的細胞懸液,接種于6孔板,置于細胞培養(yǎng)箱中。每2~3d換液1次,待細胞鋪滿瓶底后再用同樣方法消化傳代。
1.2.3細胞形態(tài)學觀察倒置顯微鏡下定期觀察,記錄CCH結(jié)膜組織貼壁后第1、2、3、5、7、9、12、15d細胞的生長狀態(tài)及形態(tài)變化,注意防止污染,控制拍照觀察時間,以防離開培養(yǎng)箱時間過長進而影響細胞生長。
1.2.4細胞鑒定取第4~5代生長良好的CCH結(jié)膜成纖維細胞行胰蛋白酶消化,制成細胞懸液,常規(guī)鋪板培養(yǎng),待細胞完全貼壁時行免疫熒光染色。吸出原培養(yǎng)液,加入PBS溶液輕輕晃動,洗3遍,每次3min,室溫下加入4%多聚甲醛固定20min,PBS溶液洗滌,0.5% Triton X-100溶液破膜30min,5%山羊血清封閉,加入Vimentin單克隆抗體(1∶500),4℃冰箱孵育過夜;次日PBS洗滌后,加入Alexa Fluor 488熒光標記山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1∶500)室溫避光孵育60min,PBS洗滌3次,DAPI染核5min,甘油明膠進行封片,熒光顯微鏡下拍照。
2.1CCH成纖維細胞的形態(tài)學觀察第1d,CCH結(jié)膜組織周圍有細胞逸出,表現(xiàn)為膠狀樣逸出帶,細胞較小,緊密排列,圓形或橢圓形,呈鋪路石樣分布,細胞輪廓不清晰;第2d,組織周圍膠狀樣細胞逸出帶較前明顯擴大,細胞融合成片并彼此連接成網(wǎng)狀,大小不一,排列不規(guī)則;第3d,細胞逸出帶較前進一步擴大,組織邊緣細胞生長較密集,細胞平行排列呈束帶狀、放射狀,周圍細胞分布相對疏松,部分細胞呈長梭形或多角形,可見偽足形成并向外逐漸伸展;第5d,細胞輪廓逐漸清晰,可見卵圓形細胞核,細胞核邊界清楚,細胞從組織周圍呈島狀生長爬出,島中心的細胞排列較緊密,多呈編織狀、魚群狀排列;周圍細胞排列相對疏松,相互交織成網(wǎng)狀,有較大的細胞間隙,長梭形細胞形態(tài)逐漸明顯;第7d,結(jié)膜組織透亮度高,細胞分布均勻,數(shù)目較多,胞體大小適中,細胞核明顯甚至雙核,細胞質(zhì)清晰無空泡,細胞輪廓清晰、飽滿,形態(tài)規(guī)則;第9d,組織塊顏色加深,但未見黑化,細胞形態(tài)較模糊,細胞表面可見混濁、顆粒狀及深黃色的碎屑,其為細胞的分泌物或衰老的細胞器;第12d,組織塊邊緣部分黑化,組織周圍可見折光性較強的細胞碎片,細胞排列相對疏松,體積大而扁平,形狀不規(guī)則,細胞漿內(nèi)可見空泡與顆粒,細胞透亮度降低;第15d,組織塊完全黑化,細胞老化,邊界模糊,細胞扁平呈鋪展狀生長,細胞漿內(nèi)有大量顆粒狀物質(zhì)和小泡產(chǎn)生,部分細胞開始從培養(yǎng)瓶底脫落,細胞之間出現(xiàn)較大空隙(圖1)。
圖1 不同時期CCH球結(jié)膜成纖維細胞形態(tài)學觀察 A、B:第1d,組織周圍有細胞爬出,細胞較小,緊密排列,呈鋪路石樣分布;C、D:第2d,細胞較前明顯增多,細胞融合成片并彼此連接成網(wǎng)狀;E、F:第3d,細胞較前進一步增多,組織邊緣細胞生長密集,周邊相對稀疏;G、H:第5d,細胞輪廓逐漸清晰,邊緣細胞有較大的間隙,長梭形細胞形態(tài)逐漸明顯;I、J:第7d,細胞分布均勻,數(shù)目較多,胞體大小適中,輪廓清晰,形態(tài)規(guī)則;K、L:第9d,組織塊顏色加深,細胞表面見混濁、顆粒狀及深黃色的碎屑堆積;M、N:第12d,組織塊邊緣部分黑化,胞體大而扁平,細胞漿內(nèi)可見空泡與顆粒;O、P:第15d,組織塊完全黑化,部分細胞從培養(yǎng)瓶底脫落,細胞間出現(xiàn)較大空隙。
2.2傳代后CCH球結(jié)膜成纖維細胞形態(tài)學觀察傳代后細胞呈細長梭形、扁平星狀或多突的紡錘形,中間稍寬大,兩頭相對細小,有卵圓形的細胞核,伴向外伸出2~3個長短不同的細長突起,細胞密度均勻,排列規(guī)則,大小基本一致(圖2)。
球結(jié)膜成纖維細胞體外培養(yǎng)的主要方法有組織塊貼壁法和酶消化法[16-17]。酶消化法多選擇胰蛋白酶或胰蛋圖2 傳代后CCH球結(jié)膜成纖維細胞形態(tài)學觀察 A:第4代CCH球結(jié)膜成纖維細胞;B:第5代CCH球結(jié)膜成纖維細胞。
2.3CCH球結(jié)膜成纖維細胞免疫熒光鑒定對球結(jié)膜成纖維細胞標記性蛋白Vimentin進行免疫熒光染色鑒定,結(jié)果顯示球結(jié)膜成纖維細胞的細胞漿內(nèi)可見綠色熒光,呈陽性反應(yīng),細胞核呈藍色熒光(圖3)。
圖3 CCH球結(jié)膜成纖維細胞標記性蛋白免疫熒光染色 A:Vimentin免疫熒光染色;B:細胞核DAPI染色;C:Merged。
2.4原代培養(yǎng)失敗的CCH球結(jié)膜成纖維細胞形態(tài)學表現(xiàn)部分原代培養(yǎng)的結(jié)膜組織貼壁良好但未見細胞從組織周圍爬出,選取原代培養(yǎng)失敗的不同時間點觀察組織形態(tài)學變化見圖4。
圖4 CCH球結(jié)膜成纖維細胞原代培養(yǎng)失敗的形態(tài)學觀察 A:第1d,組織貼壁,組織周圍未見細胞爬出;B:第3d,組織形態(tài)較前未見明顯變化,周圍未見細胞爬出;C:第7d,組織呈棕黃色,組織周圍未見細胞爬出;D:第15d,組織塊完全黑化,組織失去活性。
白酶與膠原酶聯(lián)合消化,但酶處理組織時間和酶濃度難以掌控,消化時間過長或酶濃度過高均可導致細胞活性下降,進而影響細胞的爬出與貼壁,且酶消化解離細胞的過程中容易導致細胞壁破損,使原代細胞狀態(tài)受到影響,對細胞生物學特性損傷較大,不利于細胞的傳代與后續(xù)實驗[18]。而組織塊貼壁法簡單易行,只需1~2mm2大小組織即可獲取大量穩(wěn)定的成纖維原代細胞,同時又可避免消化酶對細胞的化學損傷,培養(yǎng)的細胞均質(zhì)性與穩(wěn)定性較好,也避免由于酶的長時間作用造成細胞損傷或遺傳特性改變。通過差速貼壁消化祛除結(jié)膜成纖維細胞中混合的結(jié)膜上皮細胞,傳至3代及以上即可得到純度相對較高且穩(wěn)定的結(jié)膜成纖維細胞系[19-20]。既往研究主要確定了合適的細胞培養(yǎng)基及細胞鑒定方法,但對于原代成纖維細胞的傳代時間及不同時期的形態(tài)學觀察尚未見相關(guān)報道。
成纖維細胞原代培養(yǎng)過程中,因細胞增殖生長達到一定密度后,細胞之間會出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象,細胞的生長、分裂速度會逐漸減慢甚至停止,如不及時進行消化和傳代,細胞會出現(xiàn)衰老甚至死亡。原代細胞消化傳代的頻率和時間間隔與接種細胞的種類、細胞生物學特性以及培養(yǎng)基性質(zhì)等多種因素有關(guān)[21-22]。本研究通過組織塊貼壁法對CCH結(jié)膜成纖維細胞進行體外培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)CCH球結(jié)膜組織接種于培養(yǎng)瓶24h后即可見組織周圍有細胞逸出;第2~7d為球結(jié)膜成纖維細胞生長的對數(shù)期,此時可見細胞輪廓逐漸清晰,分布逐漸均勻,數(shù)目逐漸增多,中心生長的細胞排列相對緊密,呈放射狀、柵欄狀及魚群樣生長;周圍細胞排列較疏松,細胞呈紡錘形、扁平狀分布;第9~15d為細胞生長的平臺期,細胞增長緩慢,排列疏松,體積變大,形狀扁平,呈圓盤狀分布,部分細胞從培養(yǎng)瓶底部脫落,細胞之間出現(xiàn)較大空隙,且結(jié)膜組織透亮度逐漸降低,顏色加深,至組織塊黑化。與既往皮膚及肝臟成纖維細胞生長特性的研究相一致,符合成纖維細胞的生長規(guī)律[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn),組織貼壁后細胞平均生長時間為第8d時行消化傳代,傳代后細胞生長速度較快,形態(tài)規(guī)則,呈典型細長梭形,并伴有2~3個長短不一的突起,與目前所公認的成纖維細胞的形態(tài)學表現(xiàn)相符[25]。因此,根據(jù)上述球結(jié)膜成纖維細胞的生長周期及消化傳代后的生長狀況,原代細胞培養(yǎng)至第8d時行消化傳代,可獲得最佳的細胞狀態(tài),且細胞數(shù)目相對較多,細胞的生物學特性能較穩(wěn)定地傳遞下來,符合后續(xù)實驗的細胞數(shù)量要求。
Vimentin是成纖維細胞特異性高表達的一種蛋白,廣泛參與組織與細胞的修復和再生,包括細胞增殖、遷移、細胞外基質(zhì)重塑及免疫反應(yīng)等[26]。因此,Vimentin可作為成纖維細胞的一種標志性蛋白,并通過免疫熒光實驗技術(shù)進行成纖維細胞的鑒定[27-28]。Budel等[29]通過細胞免疫熒光檢測成纖維細胞標志性蛋白Vimentin染色呈綠色,DAPI染核呈藍色,證實為成纖維細胞。本研究通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)CCH球結(jié)膜成纖維細胞標志性蛋白Vimentin染色結(jié)果為陽性,且符合成纖維細胞的形態(tài)學特征,證明本研究通過組織塊貼壁法所提的原代細胞為球結(jié)膜成纖維細胞。
然而,CCH球結(jié)膜成纖維細胞原代培養(yǎng)過程并非一帆風順,實驗中出現(xiàn)組織塊貼壁良好但始終未見細胞爬出。分析其失敗的原因可能有以下幾點:(1)患者年齡相對較大且合并多種基礎(chǔ)疾病,如糖尿病等,結(jié)膜組織活性相對較低;(2)取材后結(jié)膜組織塊未及時放入含培養(yǎng)基的EP管中低溫保存,暴露空氣中時間過長使組織失去活性;(3)平鋪組織操作時間過長,組織過于干燥,脫水而失去活性;(4)實驗操作不規(guī)范,結(jié)膜組織取材后未及時清洗致組織污染,影響細胞爬出;(5)未及時更換培養(yǎng)液,培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的有害代謝性物質(zhì)堆積阻礙細胞爬出。 成纖維細胞培養(yǎng)過程中經(jīng)歷多次失敗,總結(jié)經(jīng)驗得出:(1)取材盡量選取相對年輕且無基礎(chǔ)代謝性疾病(如糖尿病等)的患者;(2)取材后,無菌生理鹽水沖洗結(jié)膜組織以祛除血污,并立即放入含完全培養(yǎng)基的EP管中冷藏,否則組織活性降低影響成纖維細胞的爬出;(3)超凈工作臺中盡快完成結(jié)膜組織貼壁,勿使組織過于干燥,貼壁后緩緩加入完全培養(yǎng)基,以覆蓋組織為宜;(4) 貼壁后12h內(nèi)盡量不要移動培養(yǎng)瓶,以免晃動引起組織塊漂浮,24h后可取出觀察并拍照記錄。如此操作,即可獲得均一、穩(wěn)定的原代球結(jié)膜成纖維細胞。
綜上,本研究采用組織塊貼壁法分離提取原代CCH球結(jié)膜成纖維細胞,通過觀察成纖維細胞生長周期發(fā)現(xiàn),當細胞爬出平均時間為第8d時行消化傳代最優(yōu),并通過差速貼壁法純化成纖維細胞可獲得穩(wěn)定、一致的CCH球結(jié)膜成纖維細胞,為CCH發(fā)病機制的研究及尋找切實有效的治療方法創(chuàng)造了良好的實驗平臺。