謝彥穎 劉亮生 陳進(jìn)東

抑郁癥(Depression)作為目前常見的精神疾病之一，主要臨床表現(xiàn)為情緒低落、愉快感缺失、乏趣、自卑、自責(zé)、意志活動減退等癥狀，有的患者也會伴有幻覺、妄想等精神類癥狀，抑郁癥對個人認(rèn)知能力、社會功能、生活質(zhì)量造成深遠(yuǎn)負(fù)性影響[1,2]。認(rèn)知缺陷是抑郁癥的特征之一，研究表明抑郁癥患者在認(rèn)知加工速度、注意力廣度、記憶力和執(zhí)行功能方面都有損害[3,4]。同時抑郁癥也是阿爾茨海默病的一個危險因素[5]，可能是阿爾茨海默病的前兆[6]。電針作為針灸的主要衍生方式，在臨床中已經(jīng)被證實能夠?qū)σ钟舭Y有著較好的療效[7]，同時對認(rèn)知功能損傷的恢復(fù)有積極的作用[8-10]。雖然有報道不同的電針參數(shù)對認(rèn)知能力的恢復(fù)有不同的影響[11,12]，但尚未有關(guān)于不同電針頻率對抑郁癥及其認(rèn)知功能的影響的研究報道。本研究從認(rèn)知的角度，選擇連續(xù)波中不同頻率的電針參數(shù)觀察電針對抑郁樣小鼠抑郁樣行為及認(rèn)知功能的影響，探討電針治療抑郁癥認(rèn)知功能的最優(yōu)電針參數(shù)。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與分組SPF級雄性C57/BL6小鼠60只，7周齡，體質(zhì)量18～22 g，購于浙江維通利華實驗技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2019-0001]。實驗小鼠飼養(yǎng)于廈門市仙岳醫(yī)院精神衛(wèi)生研究室，飼養(yǎng)環(huán)境：每籠4只小鼠，溫度22～25 ℃，濕度50%～55%，12 h/12 h明暗時長，自由飲食飲水。實驗小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)區(qū)組分為對照組(Ctrl=12只)、模型組(CUMS=12只)、模型+2 Hz電針組(2 Hz=12只)、模型+15 Hz電針組(15 Hz=12只)、模型+100 Hz電針組(100 Hz=12只)。實驗過程中對動物的處置嚴(yán)格遵照中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》[13]，所有實驗由廈門市仙岳醫(yī)院實驗動物管理倫理委員會進(jìn)行監(jiān)督與管理(2021-KY-001)。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑①氯化鈉(美國，SIGMA.S7653-1KG)；②碳酸氫鈉(美國，SIGMA.S5761-500G)；③蔗糖(美國，SIGMA.V90016)；④氯化鉀(美國，SIGMA.P9333-1KG)；⑤二水合氯化鈣(美國，SIGMA.C5080-500G)；⑥葡萄糖(美國，SIGMA.G7021-1KG)；⑦二水合磷酸二氫鈉(美國，SIGMA.71500-1KG)；⑧硫酸鎂(美國，SIGMA.M2643-500G)；⑨人工腦脊液(Artificial Cerebrospinal Fluid,ACSF,250 ml)：120.0 mM氯化鈉，2.5 mM氯化鉀，1.2 mM二水合磷酸二氫鈉，2.0 mM硫酸鎂，2.0 mM二水合氯化鈣，26 mM碳酸氫鈉，10 mM葡萄糖；pH7.35～7.45，滲透壓290～310 mOsm。

1.2.2 電針治療相關(guān)設(shè)備①針灸針(中國，中研太和，0.16 mm×7 mm)；②Master-9(以色列，A.M.P.Instruments LTD.7733)；③小動物麻醉機(jī)(中國，瑞沃德，R58S)。

1.2.3 行為學(xué)檢測相關(guān)設(shè)備動物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)(美國，Stoeling，ANY version 4.99 m)。

1.2.4 電生理檢測相關(guān)設(shè)備及耗材①震動切片機(jī)(德國，徠卡，VT1000S)；②膜片鉗CCD(日本，尼康，ECLIPSE FN1)；③膜片鉗顯微鏡(日本，尼康，OFN22 WD30)；④數(shù)模轉(zhuǎn)換器(美國，MD，Axon Digidata 1550B)；⑤數(shù)字放大器(美國，MD，Axon Multi Clamp 700B)；⑥微電極拉制儀(美國，Sutter，P-1000)；⑦恒溫水浴鍋(中國，南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司，SM8D)；⑧玻璃微電極(美國，Sutter，BF100-50-10)；⑨異氟烷(中國，瑞沃德，R510-22)。

1.3 模型制備模型組與電針組實驗動物采用慢性溫和性不可預(yù)見性應(yīng)激(Chronic Unpredictable Mild Stress, CUMS)方法制備抑郁模型[14]，造模連續(xù)3周，期間小鼠每天隨機(jī)給予不同應(yīng)激，包括：①24 h禁食；②24 h禁水；③2 h束縛；④7 h籠子傾斜；⑤夜間照明；⑥24 h臟籠飼養(yǎng)(每100 g墊料加水200 ml)；⑦8 ℃水中強(qiáng)迫游泳30 min；⑧24 h暴露在異物中(如塑料)。造模期間給予對照組小鼠常規(guī)方式飼養(yǎng)，不進(jìn)行應(yīng)激。

1.4 干預(yù)方法造模后，電針組小鼠進(jìn)行電針干預(yù)，使用5%異氟烷誘導(dǎo)麻醉后使用2%異氟烷維持麻醉。小鼠麻醉后，俯臥位置于保溫墊上，參照《實驗針灸學(xué)》[15]選取百會穴、印堂穴，采用0.16 mm×7 mm一次性針灸針，百會穴與印堂穴向后斜刺2 mm，連接master-9進(jìn)行電針治療，選用連續(xù)波，電流1 mA，相應(yīng)分組分別采用2 Hz、15 Hz、100 Hz的電針頻率，每次治療時間30 min，每周治療6 d，連續(xù)治療3周。對照組與模型組進(jìn)行相同方式的麻醉，不電針。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 行為學(xué)檢測行為學(xué)檢測前，將實驗小鼠提前2 h轉(zhuǎn)運至小動物行為學(xué)室進(jìn)行適應(yīng)，行為學(xué)室為隔音室，濕度、溫度同小鼠飼養(yǎng)環(huán)境。

糖水偏好實驗(Sucrose Preference Tests, SPT)[14]：小鼠單籠飼養(yǎng)，首先訓(xùn)練動物消耗來自2個不同瓶子的1%蔗糖溶液(正式實驗前48 h)。24 h后，允許動物自由接觸來自2個不同瓶子的1%蔗糖溶液和水。為避免位置偏愛，12 h后將2個瓶子位置互換。24 h后測量兩瓶中的液體量，并根據(jù)以下公式計算蔗糖偏好：蔗糖偏好=蔗糖消耗量/(蔗糖+水消耗量)×100%。

懸尾實驗(Tail Suspension Tests, TST)[14]：將小鼠的尾巴懸掛在丙烯酸棒上6 min(直徑1.5 cm，高30 cm)，并使用視頻跟蹤系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)控。記錄6 min內(nèi)的不動持續(xù)時間，分析后5 min的實驗數(shù)據(jù)。每只小鼠結(jié)束實驗后均用10%乙醇進(jìn)行清理小鼠排泄物，消除氣味對其他小鼠的影響。

強(qiáng)迫游泳實驗(Forced Swimming Tests, FST)[14]：小鼠放置在一個裝有水(23±1)℃深13 cm透明丙烯酸圓柱桶中(直徑10 cm，高20 cm)。使用視頻跟蹤系統(tǒng)將小鼠放入水中6 min；記錄測試的最后5 min內(nèi)的不動持續(xù)時間。

Morris水迷宮實驗(Morris Water Maze Task)[16]：為了評估學(xué)習(xí)和記憶，實驗小鼠進(jìn)行為期5 d的 Morris水迷宮任務(wù)測試。水迷宮裝置由直徑120 cm，高50 cm，水深40 cm 的圓柱形水箱和連接計算機(jī)的攝像機(jī)組成。水箱分為4個象限，平臺(直徑10 cm)放置在第三象限，距離水面1 cm。在定位導(dǎo)航訓(xùn)練過程中，將一只老鼠從每個象限的等距位置放入水中4 d。當(dāng)一只老鼠在90 s內(nèi)停留在平臺上超過3 s時，這個時間將被記錄為該象限老鼠的逃避潛伏期。如果老鼠在90 s內(nèi)沒有找到平臺，它就會被從水中取出，放在平臺上進(jìn)行15 s學(xué)習(xí)。第5天是測試實驗，調(diào)查記憶的鞏固。平臺被移走，老鼠被放在第一象限，記錄每只小鼠的游泳軌跡。

跳臺回避實驗(Step-down Avoidance Test)[16]：在Morris水迷宮任務(wù)測試之后進(jìn)行跳臺回避測試，將小鼠放入實驗箱(20 cm×20 cm×60 cm)的圓柱形隔熱平臺中，適應(yīng)周圍環(huán)境3 min。當(dāng)老鼠走下平臺時會立即接受2 s電刺激(電壓32 V，電流0.25 A)，訓(xùn)練時間5 min。訓(xùn)練后24 h，記錄潛伏期(第1次下臺)和錯誤次數(shù)(跳臺次數(shù))，記錄時間5 min。

1.5.2 電生理檢測腦片制備：0～4 ℃ ACSF通入95%O2+5%CO2混合氣體30 min，小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后快速取腦放入0～4 ℃ ACSF中，使用震動切片機(jī)將小鼠大腦切至400 μm厚的腦片，34 ℃ ACSF孵育30 min，室溫孵育1 h后進(jìn)行記錄。ACSF全程通入上述混合氣體。

長時程增強(qiáng)記錄(Long-term Potentiation，LTP)[17]：使用同心圓電極刺激 SC-CA1通路，3～5 MΩ的玻璃電極內(nèi)部裝入ACSF，電流鉗記錄 CA1局部的場電位(field EPSPs, fEPSPs)。刺激參數(shù)100 μs的恒定電流脈沖，頻率為0.033 Hz，強(qiáng)度為最大振幅的30%左右，時間為1 s。通過測量fEPSPs的斜率來確定突觸傳遞的強(qiáng)度。記錄刺激前10 min基線及刺激后60 min的fEPSPs。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠抑郁樣行為學(xué)比較與對照組(Ctrl)相比，模型組(CUMS)表現(xiàn)出典型的抑郁樣表現(xiàn)：糖水偏好減少，懸尾與強(qiáng)迫游泳中的靜止時間增多(圖1A、1B、1C，P<0.01)；與模型組(CUMS)相比，2 Hz電針治療能夠明顯改善小鼠抑郁樣行為：糖水偏好增加，懸尾與強(qiáng)迫游泳中的靜止時間減少(圖1A、1B、1C，P<0.01)，而15 Hz、100 Hz的電針治療只能改善部分抑郁樣行為(圖1B，P<0.01)。見圖1。

注：A圖：在糖水實驗中，CUMS組小鼠對糖水的偏好明顯降低，而2 Hz較15 Hz、100 Hz的電針治療能夠更為明顯改善小鼠對糖水的偏好；B圖：在懸尾實驗中，CUMS組小鼠靜止的時間明顯增長，而電針能夠有效減少小鼠的靜止時間，其中2 Hz的電針參數(shù)效果最好；C圖：在強(qiáng)迫游泳實驗中，CUMS組小鼠靜止的時間明顯增長，只有2 Hz的電針能夠有效減少小鼠靜止的時間。*P<0.05，**P<0.01，n=12只/組。

2.2 各組小鼠認(rèn)知行為學(xué)比較與對照組(Ctrl)相比，模型組(CUMS)有明顯的認(rèn)知功能損傷：Morris水迷宮的潛伏期縮短，跳臺規(guī)避實驗中的潛伏期延長、錯誤次數(shù)增多(圖2A、2B、2C、2D、2E，P<0.01)；與模型組(CUMS)相比，2 Hz電針治療能夠明顯改善小鼠認(rèn)知功能：Morris水迷宮的潛伏期縮短，跳臺規(guī)避實驗中的潛伏期延長、錯誤次數(shù)減少(圖2A、2B、2C、2D、2E，P<0.01)，而15 Hz、100 Hz的電針治療只能改善部分認(rèn)知功能：Morris水迷宮的潛伏期縮短(圖2A、2B、2C，P<0.01)；15 Hz的電針治療也能夠減少跳臺規(guī)避實驗中的錯誤次數(shù)(圖2E，P<0.05)。見圖2

注：A圖：各組小鼠水迷宮實驗代表性例圖；B圖、C圖：水迷宮實驗中，CUMS組小鼠的潛伏期明顯延長，而電針能夠有效減少小鼠的潛伏期，其中2 Hz的電針參數(shù)效果最好；D圖、E圖：在跳臺回避實驗中，CUMS組小鼠的潛伏期明顯縮短，錯誤次數(shù)明顯增多，只有 2 Hz的電針能夠有效延長小鼠潛伏期。*P<0.05，**P<0.01，n=12只/組。

2.3 各組小鼠LTP比較與對照組(Ctrl)相比，模型組(CUMS)的LTP明顯受損(圖3A、3B、3C，P<0.01)；與模型組(CUMS)相比，2 Hz電針治療能夠顯著改善小鼠受損的LTP(圖3A、3B、3C，P<0.01)，而15 Hz、100 Hz的電針治療也能夠明顯改善小鼠受損的LTP(圖3A、3B、3C，P<0.05)。見圖3。

注：A圖：各組小鼠LTP代表性例圖；B圖、C圖：CUMS組小鼠的LTP受損最嚴(yán)重，而電針能夠有效減少小鼠LTP受損情況，其中2 Hz的電針參數(shù)效果最好。*P<0.05，**P<0.01，n=8腦片/3只/組。

3 討論

抑郁癥的發(fā)病機(jī)制紛繁復(fù)雜，至今尚不明確，除了與遺傳因素密切相關(guān)外，心理社會因素是其另一主要發(fā)病因素[18]。慢性不可預(yù)見性溫和刺激(CUMS)作為應(yīng)激的一種主要模式被廣泛應(yīng)用于抑郁癥、焦慮癥等精神心理疾病模型中，通過不同的應(yīng)激方法作用于小鼠可以獲得比較穩(wěn)定的抑郁癥樣小鼠模型[19]。抑郁樣小鼠行為主要表現(xiàn)在糖水偏好的降低、懸尾實驗和強(qiáng)迫游泳實驗的不動時間延長、新環(huán)境進(jìn)食抑制實驗潛伏期延長等方面[19]。

雖然抑郁癥是以情緒低落、興趣減退、快感缺失為主要癥狀，但越來越多的研究報道抑郁癥患者的認(rèn)知功能有不同程度的損傷[20]，并且認(rèn)知功能的損傷在老齡抑郁癥患者中表現(xiàn)得更加明顯[21]，因此有學(xué)者認(rèn)為抑郁癥是老齡癡呆的一大危險因素[22]。

百會穴位于督脈之上，而督脈入絡(luò)腦，腦為諸陽之會，且百會穴位于巔頂，其下為腦，故百會具有調(diào)和機(jī)體陰陽、調(diào)節(jié)情志活動、醒腦開竅、安神定志等功效。印堂穴位于面部兩眉頭之間，其內(nèi)為額葉，因其隸屬于督脈，故與腦聯(lián)系密切，因此印堂、百會穴一脈相通，可調(diào)督醒神?，F(xiàn)代研究表明選用百會穴、印堂穴能夠?qū)δX內(nèi)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、谷氨酸、γ-氨基丁酸等神經(jīng)遞質(zhì)有不同的調(diào)節(jié)作用[23]，同時研究報道，電針“印堂”“百會”兩穴可使腦內(nèi)5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素的含量增加，改善抑郁[24]。

針灸/電針在改善認(rèn)知功能障礙方面有明顯的療效，針刺聯(lián)合藥物治療對阿爾茲海默病(Alzheimer’s Disease, AD)患者的短期和中期認(rèn)知功能比單獨用藥有明顯的改善作用[9]，同時針灸有利于改善老年人的輕度認(rèn)知功能障礙[10]?；A(chǔ)實驗研究表明，電針百會穴能顯著提高 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，上調(diào)N-乙酰天冬氨酸、谷氨酸和肌醇代謝，增加海馬存活神經(jīng)元，促進(jìn)BDNF和TrkB的表達(dá)[15]。LTP是發(fā)生在2個神經(jīng)元信號傳輸中的一種持久的增強(qiáng)現(xiàn)象，由于記憶被認(rèn)為是通過突觸強(qiáng)度的改變來編碼的，因此LTP 被廣泛認(rèn)為是構(gòu)成學(xué)習(xí)和記憶基礎(chǔ)的主要細(xì)胞機(jī)制之一[25,26]，血管性癡呆(Vascular Dementia，VD)大鼠的LTP受損明顯，針灸可增強(qiáng)VD大鼠海馬體中的LTP和去甲腎上腺素水平從而改善VD大鼠的認(rèn)知功能[27]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，CUMS后的小鼠表現(xiàn)出糖水偏好減少、懸尾實驗與強(qiáng)迫游泳實驗的不動時間延長等典型的抑郁樣行為，同時也有水迷宮實驗與跳臺規(guī)避實驗中的潛伏期延長、LTP受損等認(rèn)知功能障礙的表現(xiàn)，而2 Hz電針干預(yù)在改善小鼠的抑郁樣行為和認(rèn)知功能障礙方面效果突出，15 Hz、100 Hz電針干預(yù)則只能夠部分改善小鼠的抑郁樣行為及認(rèn)知功能。

4 結(jié)論

本實驗的研究結(jié)果表明，在選用連續(xù)波的情況下，2 Hz電針治療不僅能夠有效改善小鼠抑郁樣行為，同時能夠明顯改善抑郁樣小鼠的認(rèn)知功能；15 Hz、100 Hz電針治療只能夠部分改善小鼠的抑郁樣行為及認(rèn)知功能，其中15 Hz的療效優(yōu)于100 Hz。