陳慧彬

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001)

芝麻是一種經(jīng)濟效益好、營養(yǎng)價值高的食品。芝麻含油率達(dá)45%～57%，蛋白質(zhì)含量約21%，是優(yōu)質(zhì)的不飽和脂肪酸和蛋白質(zhì)來源。此外，芝麻還富含木脂素及維生素E等抗氧化成分，素有“八谷之冠”的美譽[1]。然而，芝麻蛋白又是一種不容忽視的食品過敏原。2014年，美國公共事務(wù)科學(xué)中心(CSPI)要求美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)將芝麻制品納入食源性過敏原加以管理。

食品過敏原通過胃腸道初次進入機體后，被抗原提呈細(xì)胞吞噬消化為小分子肽段，由MHCⅡ(T細(xì)胞表位，主要負(fù)責(zé)提呈外源抗原)提呈到細(xì)胞質(zhì)膜表面，與TH2細(xì)胞的TCR結(jié)合，形成MHCⅡ-抗原-TCR復(fù)合體，被激活的T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，IL4和IL10可刺激B細(xì)胞釋放IgE抗體(B細(xì)胞表位)，IgE結(jié)合至肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面，使機體處于致敏狀態(tài)，當(dāng)機體再次接觸過敏原，可迅速引發(fā)Ⅰ型超敏反應(yīng)，進而觸發(fā)過敏癥。

芝麻過敏原主要包括醇溶蛋白超家族的Ses i 1和Ses i 2，Cupin超家族的Ses i 3、Ses i 6和 Ses i 7，以及油質(zhì)蛋白超家族的Ses i 4和Ses i 5[2]。其中Ses i 6和Ses i 7占芝麻蛋白質(zhì)總量的60%～70%，因其具有較強的熱穩(wěn)定性和抗消化能力，容易通過胃腸道屏障薄弱部位進入循環(huán)系統(tǒng)，被免疫細(xì)胞識別消化觸發(fā)Ⅰ型超敏反應(yīng)，是芝麻中的主要過敏原。國內(nèi)關(guān)于芝麻過敏原的研究仍為空白，為此，探究Ses i 6的致敏表位、致敏機理、檢測方法、脫敏加工等尤為重要。本研究采用生物信息學(xué)軟件對Ses i 6的抗原表位進行模擬預(yù)測，以期為后續(xù)的研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 Ses i 6信息檢索及理化性質(zhì)分析

登錄NCBI-Protein數(shù)據(jù)庫，查詢Ses i 6的氨基酸序列(編號：Q9XHP0.1)，獲取如下FASTA序列：MVAFKFLLALSLSLLVSAAIAQTREPRLTQGQQCRFQRISGAQPSLRIQSEGGTTELWDERQEQFQCAGIVAMRSTIRPNGLSLPNYHPSPRLVYIERGQGLISIMVPGCAETYQVHRSQRTMERTEASEQQDRGSVRDLHQKVHRLRQGDIVAIPSGAAHWCYNDGSEDLVAVSINDVNHLSNQLDQKFRAFYLAGGVPRSGEQEQQARQTFHNIFRAFDAELLSEAFNVPQETIRRMQSEEEERGLIVMARERMTFVRPDEEEGEQEHRGRQLDNGLEETFCTMKFRTNVESRREADIFSRQAGRVHVVDRNKLPILKYMDLSAEKGNLYSNALVSPDWSMTGHTIVYVTRGDAQVQVVDHNGQALMNDRVNQGEMFVVPQYYTSTARAGNNGFEWVAFKTTGSPMRSPLAGYTSVIRAMPLQVITNSYQISPNQAQALKMNRGSQSFLLSPGGRRS。Ses i 6共459個氨基酸殘基，以此為基礎(chǔ)進行接下來的表位分析。

登錄UniProtKB，查詢Ses i 6(編號：Q9XHP0)的基本信息和功能注釋。

將Ses i 6的FASTA格式序列導(dǎo)入EXPASY的ProtParam工具，預(yù)測分析Ses i 6蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)。

1.2 B細(xì)胞表位預(yù)測

1.2.1 B細(xì)胞線性表位預(yù)測

1.2.1.1 基于Ses i 6二級結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)預(yù)測

將氨基酸序列導(dǎo)入在線預(yù)測軟件SOPMA，依據(jù)二級結(jié)構(gòu)算法預(yù)測分析潛在的B細(xì)胞線性表位。

1.2.1.2 基于Ses i 6分子特征的生物信息學(xué)預(yù)測

使用DNAstar子程序Protean分析Ses i 6的蛋白質(zhì)特性。其中，Kyte-Doolittle Hydropathy方案可以根據(jù)氨基酸序列得出Ses i 6的親水性分布；Karplus-Schultz方案可以通過分析Ses i 6的主鏈柔性預(yù)測潛在的抗原表位；Emini方案可以預(yù)測Ses i 6的表面可及性；Jameson-Wolf方案可以直接得出Ses i 6的抗原分布，綜合四種方案預(yù)測分析Ses i 6潛在的優(yōu)勢表位。

1.2.1.3 基于Ses i 6與已知過敏原的比對預(yù)測

登錄BepiPred 1.0 Server，輸入氨基酸序列，結(jié)合氨基酸的性質(zhì)(親水性、柔韌性、可及性、極性、暴露表面、轉(zhuǎn)角)和隱馬爾可夫模型預(yù)測潛在的B細(xì)胞線性表位[3]。研究表明，同那些僅依賴于氨基酸性質(zhì)的預(yù)測方法相比，隱馬爾可夫模型可提高BepiPred預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.2 B細(xì)胞構(gòu)象表位預(yù)測

1.2.2.1 Ses i 6三維模型的構(gòu)建

在SWISS-MODLE中通過序列比對尋找模板，需要注意的是，尋找的模板蛋白與Ses i 6的序列相似性應(yīng)高于30%[4]，以模板結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)進行三維建模，下載三維模型的PDB文件以評估其穩(wěn)定性。

1.2.2.2 Ses i 6三維模型穩(wěn)定性評價

在Deep View 4.1中導(dǎo)入SWISS-MODLE構(gòu)建的三維模型PDB文件，獲取拉氏圖(Ramachandran Plot)，評定三維模型的穩(wěn)定性。

1.2.2.3 基于Ses i 6三維模型的生物信息學(xué)預(yù)測

DiscoTope 2.0 Server通過計算抗原抗體接觸數(shù)和氨基酸傾向得出致敏原潛在的構(gòu)象表位，采用新型的空間可及性算法預(yù)估表面暴露的可能性，增加了預(yù)測的準(zhǔn)確性。導(dǎo)入SWISS-MODLE的PDB文件，分析同源模型中的構(gòu)象表位。在Pymol軟件中標(biāo)注獲取的構(gòu)象表位，分析其空間位置關(guān)系。

1.3 敏感人群分析及T細(xì)胞表位預(yù)測

人類白細(xì)胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)是表達(dá)于人體免疫細(xì)胞質(zhì)膜表面的主要相容組織復(fù)合體(Major histocompatibility complex，MHC)[5]，具有廣泛的群體多態(tài)性，與食品過敏的個體差異性密切相關(guān)，根據(jù)差異大小，可分為安全群體和敏感群體。因此，根據(jù)HLA基因型與Ses i 6的相關(guān)關(guān)系分析敏感人群分布格外重要。外源抗原(CD4+T細(xì)胞呈遞)的T細(xì)胞表位由12～17個氨基酸殘基組成，主要是線性表位，與肽段的空間位置沒有關(guān)系，可分布于分子內(nèi)部，研究具體的T細(xì)胞表位可為敏感人群提供安全保障。

1.3.1 敏感人群分析

使用在線分析軟件NetMHCII 2.3 Server[6]分析Ses i 6與HLA-DR(共25種)、HLA-DQ(共20種)、HLA-DP(共9種)的結(jié)合能力，篩選出高親和性肽段(SB)和低親和性肽段(WB)，并判斷敏感人群。

1.3.2 敏感人群的T細(xì)胞表位預(yù)測

根據(jù)1.3.1中敏感人群的高親和肽段分析其T細(xì)胞表位。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)分析

NCBI數(shù)據(jù)庫顯示，Ses i 6的1aa-21aa為信號肽，22aa-277aa為酸性亞基，278aa-459aa為堿性亞基，第24位和第67位的Cys形成二硫鍵，此外，第110位和第284位的Cys形成的二硫鍵連接酸性亞基和堿性亞基。20aa-454aa屬于Cupin蛋白超家族，該蛋白家族擁有β-伴大豆球蛋白、7S豌豆球蛋白及花生主要過敏原Ara h 1等眾多致敏原。

UniProtKB數(shù)據(jù)庫顯示，Ses i 6是一種同源六聚體貯存蛋白，2007年被世界衛(wèi)生組織(WHO)和國際過敏協(xié)會聯(lián)合會(IUIS)正式定名為過敏原Ses i 6.0101。

通過ProtParam分析，Ses i 6的分子式為C2246H3560N682O692S20，分子量為51830.33Da，等電點為7.73，脂肪蛋白系數(shù)(AI)為74.36，平均親水指數(shù)(GRAVY)為-0.537，AI和GRAVY共同指示Ses i 6具有很強的親水性。Ses i 6的氨基酸組成如圖1所示。

2.2 B細(xì)胞表位預(yù)測

2.2.1 線性表位

2.2.1.1 基于Ses i 6二級結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)預(yù)測

根據(jù)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測理論，紅色區(qū)域和紫色區(qū)域因暴露于蛋白質(zhì)分子的外表面，從抗原抗體的可及性觀測，容易被識別，是致敏原分子中的優(yōu)勢表位。Ses i 6酸性亞基含有更多的無規(guī)則卷曲片段，而堿性亞基的各種二級結(jié)構(gòu)分散，難以形成穩(wěn)定的抗原表位。SOPMA分析的Ses i 6的二級結(jié)構(gòu)分布如圖2所示。

圖2 Ses i 6的二級結(jié)構(gòu)分布

以多于5個氨基酸殘基(B細(xì)胞線性表位通常含有5-15個氨基酸殘基)為標(biāo)準(zhǔn)，SOPMA共預(yù)測出圖3所示的21個潛在優(yōu)勢抗原表位，其中，12個分布于酸性亞基。另外9個分布于堿性亞基，根據(jù)表位分布情況可知，Ses i 6的酸性亞基抗原性略高于堿性亞基。

圖3 基于Ses i 6二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果

2.2.1.2 基于Ses i 6分子特征的生物信息學(xué)預(yù)測

圖4展示了DNAstar預(yù)測的Ses i 6分子特征。整體上酸性亞基親水性強于堿性亞基，往往致敏原的親水性基團暴露在蛋白質(zhì)表層，易與免疫細(xì)胞質(zhì)膜受體結(jié)合，觸發(fā)過敏癥，因此，從親水性角度觀測，酸性亞基抗原性較強。65.6%的肽段抗原指數(shù)高于0，部分片段達(dá)1.7，顯示出較強的抗原性。Ses i 6的表面可及性與親水性預(yù)測結(jié)果基本保持一致，酸性亞基環(huán)繞在分子外表面的可能性更大，是Ses i 6潛在抗原表位的優(yōu)勢集中區(qū)。

圖4 DNAstar預(yù)測結(jié)果分布

DNAstar預(yù)測出10個潛在的優(yōu)勢抗原表位(見表1)，其中，7個表位分布于酸性亞基，3個表位分布于堿性亞基，前者抗原性強于后者，與SOPMA預(yù)測結(jié)果一致。

表1 DNAstar預(yù)測結(jié)果

2.2.1.3 基于Ses i 6與已知過敏原的比對預(yù)測

Bepipred預(yù)測出13個抗原表位(見表2)，其中，8個表位分布于酸性亞基，5個表位分布于堿性亞基，與SOPMA和DNAstar預(yù)測結(jié)果一致。

表2 Bepipred預(yù)測結(jié)果

使用單一的數(shù)據(jù)庫或生物信息學(xué)軟件進行預(yù)測，結(jié)果往往有較大的偏差，結(jié)合SOPMA、DNAstar及Bepipred三款軟件的不同算法，得出B細(xì)胞線性表位的綜合預(yù)測結(jié)果(見表3)。綜合來看，所有潛在的優(yōu)勢抗原表位都分布于酸性亞基。

表3 B細(xì)胞線性表位的綜合預(yù)測結(jié)果

2.2.2 構(gòu)象表位

2.2.2.1 Ses i 6三維模型的構(gòu)建

在PDB數(shù)據(jù)庫中搜尋模板，得到序列相似度為39.21%的籽粒莧(AmaranthushypochondriacusL.)11S貯存蛋白(3qac)，構(gòu)建Ses i 6三維模型(見圖5)。堿性亞基和酸性亞基各自形成一個β-桶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)是Cupin蛋白超家族的典型特征，主要由β-折疊構(gòu)成。圖中顯示的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和酸性亞基向外延伸的無規(guī)則卷曲片段已在2.2.1.1中被預(yù)測為潛在的線性抗原表位。

圖5 Ses i 6三維模型

2.2.2.2 Ses i 6三維模型穩(wěn)定性評價

Deep View 4.1通過分析相鄰氨基酸的二面角(φ，ψ)大小評估Ses i 6三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。圖6中的深綠色區(qū)域為允許區(qū)，淺綠色區(qū)域為不完全允許區(qū)，其他區(qū)域為不允許區(qū)。拉氏圖顯示93.41%以上的二面角符合穩(wěn)定性要求。因此，SWISS-MODLE預(yù)測結(jié)果可用于Ses i 6構(gòu)象表位的預(yù)測，并對Ses i 6的立體結(jié)構(gòu)解析有指導(dǎo)意義。

圖6 Ses i 6三維結(jié)構(gòu)的Ramachandran Plot

2.2.2.3 基于Ses i 6三維模型的生物信息學(xué)預(yù)測

以穩(wěn)定的三維模型為基礎(chǔ)，DiscoTope 2.0分析出10個潛在抗原表位(見表4)，其中，8個位于酸性亞基的構(gòu)象表位，2個位于堿性亞基的構(gòu)象表位，與線性表位分布一致。

表4 DiscoTope 2.0預(yù)測結(jié)果

Ses i 6的B細(xì)胞構(gòu)象表位分布如圖7所示。使用Pymol標(biāo)注出10個抗原表位的空間位置，優(yōu)勢表位全部位于Ses i 6表面，容易被免疫細(xì)胞識別，其中，表位1、2、5、6、7和8位于酸性亞基的無規(guī)則卷曲部位，表位9和10位于堿性亞基的無規(guī)則卷曲部位。因為酸性亞基向外延伸較多，表面可及性強，所以與IgE的接觸數(shù)較多，相反，堿性亞基在形成六聚體時被臨近亞基遮擋，只有暴露在表面的位點可被IgE識別。

圖7 Ses i 6的B細(xì)胞構(gòu)象表位分布

2.3 T細(xì)胞表位預(yù)測

2.3.1 敏感人群分析

通過分析445個十五肽段與HLA的親和性高低得到圖8—圖10所示結(jié)果。25種HLA-DR中有23種(92%)強親和肽段，20種HLA-DQ中有18種(90%)強親和肽段，9種HLA-DP中有4種(44.4%)強親和肽段，其中，HLA-DQ的敏感性整體高于HLA-DR，HLA-DP的親和性最弱。由此可見，HLA-DQ攜帶者對Ses i 6有很強的敏感性。其中，HLA-DQA10601-DQB10402的結(jié)合能力最強，可強親和32個十五肽段，攜帶該基因型的人群極有可能在誤食加工不完全的Ses i 6產(chǎn)品后觸發(fā)過敏癥。

圖8 Ses i 6與HLA-DR基因型的相關(guān)性分析

圖9 Ses i 6與HLA-DQ基因型的相關(guān)性分析

2.3.2 敏感人群的T細(xì)胞表位預(yù)測

分析2.3.1中敏感人群的T細(xì)胞表位發(fā)現(xiàn)，Ses i 6與HLA-DQA10601-DQB10402、HLA-DQA10201-DQB10402、HLA-DQA10303-DQB10402、HLA-DRB1*1601親和性最強的T細(xì)胞表位分別為FVVPQYYTSTARAGN、AGYTSVIRAMPLQVI、FVVPQYYTSTARAGN、AFKFLLALSLSLLVS，其中HLA-DQA10601-DQB10402和HLA-DQA10303-DQB10402的強親和表位一致，同時含有這兩個HLA亞型的人群，對FVVPQYYTSTARAGN過敏的可能性極大。

3 總結(jié)與展望

2007年，Beyer等[2]首次證實了Ses i 6可與54%過敏患者的IgE牢固結(jié)合反應(yīng)，但之后關(guān)于Ses i 6的致敏性研究一直處于停滯期。本研究成功預(yù)測出的Ses i 6 B抗原表位，將為其致敏性研究做出貢獻。研究發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞表位中有90%為構(gòu)象表位，加工變性的方式可以使一維不連續(xù)的構(gòu)象表位解聚脫敏，但難以通過打斷蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)破壞線性表位，因此，Ses i 6致敏性研究的關(guān)注點應(yīng)在其線性表位上。Wallowitz等[7]研究發(fā)現(xiàn)，Ses i 6可激活人體嗜堿性粒細(xì)胞。在測試的19名患者中，有58%受試者的IgE抗體可與Ses i 6結(jié)合反應(yīng)，并且與核桃過敏原存在交叉反應(yīng)，即多數(shù)對核桃等食物過敏的人群極有可能對芝麻制品也過敏。T細(xì)胞表位的成功預(yù)測，可以避免臨床的皮膚點刺過敏試驗，通過HLA的基因型判斷即可確診。敏感人群應(yīng)該避免攝入Ses i 6制品和與Ses i 6存在交叉反應(yīng)的過敏原(如核桃)，或者食用符合加工標(biāo)準(zhǔn)的Ses i 6制品。