甘鈺華,魏 群,馬湘蒙,李忠棠,靳元容,李淑媛

光質(zhì)對(duì)小球藻(Chlorella sorokiniana)生長和代謝機(jī)制的調(diào)控

甘鈺華,魏 群*,馬湘蒙,李忠棠,靳元容,李淑媛

(廣西大學(xué)資源環(huán)境與材料學(xué)院,廣西 南寧 530004)

為研究光質(zhì)對(duì)小球藻()生長和代謝機(jī)制的影響,分析了不同光質(zhì)下的生長情況,利用Illumina平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序.結(jié)果表明:紅?藍(lán)光是生長的有效光質(zhì),紅?藍(lán)光培養(yǎng)7d后藻細(xì)胞密度分別比白光對(duì)照組的高52.96%和61.11%.在不同光質(zhì)下具有獨(dú)特的生理特性,藍(lán)光組Chl a?Chl b和Car最高,分別為(17.84±0.26), (8.39±0.19), (6.04±0.08) mg/L;紅光培養(yǎng)7d后微藻的碳水化合物和脂質(zhì)含量最高,分別達(dá)到了(115.60±1.81) μg/mg和(18.64±0.54)%.通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,不同光質(zhì)下的基因表達(dá)存在差異,紅光下碳酸酐酶?乙酰輔酶A羧化酶和脂肪酸合成酶的基因表達(dá)量較高,差異表達(dá)的基因大部分參與了脂肪酸合成和碳固定過程;藍(lán)光下RubisCO酶的基因表達(dá)量最高且光合系統(tǒng)中富集的差異基因均上調(diào)表達(dá),光合速率和碳固定速率最快;綠光下微藻大部分的基因表達(dá)量較低,新陳代謝潛能較差;白光下的TCA循環(huán)活躍,不利于儲(chǔ)存碳水化合物和脂質(zhì).

光質(zhì)；小球藻；生長；代謝；基因；高通量測(cè)序

微藻作為光氧生物,光質(zhì)可以刺激藻細(xì)胞改變自身的代謝模式以適應(yīng)環(huán)境的變化,從而改變微藻的細(xì)胞代謝產(chǎn)物[1-2].在分子水平上,光質(zhì)會(huì)影響光合生物的基因表達(dá)水平[3],不同的光質(zhì)下微藻的酶活性和細(xì)胞化學(xué)組成均會(huì)發(fā)生改變[4-6],從而調(diào)控微藻的細(xì)胞周期和光合作用等生理活動(dòng).迄今為止,關(guān)于光質(zhì)對(duì)微藻影響的研究重點(diǎn)主要集中在利用光質(zhì)誘導(dǎo)藻細(xì)胞合成某種特定的代謝產(chǎn)物[7-11],或者研究光質(zhì)組合對(duì)微藻生長的影響[12-15],優(yōu)化微藻培養(yǎng)過程中的光質(zhì)參數(shù),提高微藻生物量和具有經(jīng)濟(jì)效益的化合物產(chǎn)量[16-17].事實(shí)上,光質(zhì)對(duì)于微藻的影響存在物種特異性,即每種微藻在不同的照明條件下都會(huì)有適合其生長的最佳光質(zhì)[7],而關(guān)于光質(zhì)對(duì)微藻的具體的代謝調(diào)控機(jī)理還有待深入探究.本研究以紅色、藍(lán)色和綠色LED作為單色光光源培養(yǎng)小球藻(),白色LED為對(duì)照光源,分析不同光質(zhì)下的細(xì)胞密度、光合色素濃度、碳水化合物和脂質(zhì)含量的變化情況,并利用Illumina Novaseq 6000測(cè)序平臺(tái)對(duì)在不同光質(zhì)下培養(yǎng)4d的進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序.通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析揭示代謝途徑的關(guān)鍵差異基因,結(jié)合微藻在不同光質(zhì)下的生理特性變化,明確響應(yīng)不同光質(zhì)的代謝機(jī)制,為后續(xù)選擇合適的光質(zhì)培養(yǎng)微藻提供一定的理論參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

藻種:購自中國科學(xué)院水生生物研究所(武漢),藻株編號(hào)為FACHB-2900.

LED光源:紅色、藍(lán)色、綠色和白色LED燈帶(長10m、寬80mm),功率為1.5～8.5W.藍(lán)光的::= 0:14.4:85.6,峰值波長為460nm;綠光的::=0.3: 98.0:1.7,峰值波長分別為511nm.紅光的::=96.5: 3.5:0,峰值波長為633nm;白光由紅綠藍(lán)光按::= 18.1:68.6:13.3比例混合而成,其峰值波長包括465, 514和630nm.

培養(yǎng)基:BG-11培養(yǎng)基[18].

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 單色光對(duì)生長的影響 將藻液在室溫下以4000r/min離心10min,重復(fù)用純水洗滌離心沉淀物3次.將和配制好的BG-11培養(yǎng)基混合在5L反應(yīng)器中,培養(yǎng)基體積為3L,初始pH值調(diào)整為7.00±0.02.光源設(shè)置為單色光組(紅色、藍(lán)色和綠色)和白光對(duì)照組.用氣泵以3L/min的速度供應(yīng)空氣用于微藻生長.在(25±1)℃和50μmol/(m2·s)條件下進(jìn)行7d的實(shí)驗(yàn).測(cè)定指標(biāo)為:藻細(xì)胞密度、光合色素濃度、碳水化合物和脂質(zhì)含量.

1.2.2 單色光下的轉(zhuǎn)錄學(xué)研究 委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成的測(cè)序?qū)嶒?yàn)步驟.第4d的微藻已經(jīng)適應(yīng)光源條件且對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的攝取處于快速利用的階段,選用該時(shí)間點(diǎn)的微藻進(jìn)行研究.鑒于目前的參考基因組注釋信息尚不明確,因此選擇進(jìn)行無參考基因組的轉(zhuǎn)錄組研究,測(cè)序完成后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行交互分析.測(cè)序數(shù)據(jù)已提交到NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫中,登錄號(hào)為SRR17697914?SRR17697915、SRR17697916、SRR17697917.

1.3 指標(biāo)檢測(cè)方法

藻細(xì)胞密度:用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行顯微鏡計(jì)數(shù).在血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)區(qū)中蓋上蓋玻片,在蓋玻片兩端各加入10μL藻液(藻液OD68030.5時(shí)需要用超純水稀釋至0.5以下),靜置片刻,待微藻細(xì)胞布滿計(jì)數(shù)室.使用連接有攝像頭的顯微鏡在10×10倍數(shù)下進(jìn)行拍攝,拍攝范圍約為320格.每組樣品需拍攝4次.使用Image J軟件處理圖片得到count值,微藻細(xì)胞數(shù)目=(count值/320)×400×稀釋倍數(shù)×10000.

光合色素:參考文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行測(cè)量.取5mL微藻懸浮液于10mL離心管,以4000r/min離心10min后用無菌注射器小心棄去上清液,保留離心管底部的藻泥.往離心管中加入5mL 90%丙酮后置于冰浴中用細(xì)胞破碎儀處理5min.在4℃的黑暗環(huán)境中靜置5h后以4000r/min離心10min,在450, 630, 664, 647, 750nm處,以90%丙酮作為空白參比,測(cè)量上清液的吸光度.

葉綠素a(Chl a)和葉綠素b(Chl b)的濃度分別根據(jù)式(1)和(2)[20]計(jì)算:

Chl a=11.85(664-750)-1.54(647-750)-

0.08(630-750) (1)

Chl b=21.03(647-750)-5.43(664-750)-

2.66(630-750) (2)

參考公式(3)[21]計(jì)算類胡蘿卜素(Car)的濃度(mg/L):

Car=450×10000/2500 (3)

脂質(zhì):采用改良的氯仿-甲醇溶劑提取法[22-23].精確稱量藻粉并記錄每組樣品的質(zhì)量(D)后轉(zhuǎn)入50mL離心管中,往離心管中加15mL氯仿/甲醇(2:1)溶液和150μL HCl溶液(1mol/L).將離心管橫置于搖床震蕩 3h后加入5mL 0.9%的NaCl溶液,旋渦混合均勻后在8000r/min下離心10min.用無菌注射器抽取下層的有機(jī)相至已預(yù)先稱重的錫紙盤內(nèi).在通風(fēng)櫥的電熱板中以80℃干燥錫紙盤至有機(jī)溶劑完全揮發(fā),錫紙盤前后的質(zhì)量差即為微藻的脂質(zhì)產(chǎn)量(L).微藻脂質(zhì)產(chǎn)量與藻粉的質(zhì)量比值即微藻的脂質(zhì)含量.

lipid=L/D×100% (4)

式中:lipid是微藻脂質(zhì)含量, %;L為第天的微藻脂質(zhì)產(chǎn)量, g;D為藻粉的質(zhì)量, g.

碳水化合物:利用HPAEC-PAD進(jìn)行測(cè)定[24],精確稱量(5±0.05) mg藻粉于干凈的色譜瓶中,加入1mL 2mol/L TFA酸溶液,在105℃下加熱6h后氮?dú)獯蹈?加入甲醇重復(fù)清洗吹干2～3次.加入無菌水溶解,轉(zhuǎn)入色譜瓶中待測(cè).采用Thermo ICS5000離子色譜系統(tǒng)(ICS5000,Thermo Fisher Scientific,USA)和Dionex? CarboPac? PA20(150′3.0mm,10μm)液相色譜柱;進(jìn)樣量為5μL.流動(dòng)相A(0.1mol/L NaOH),流動(dòng)相B(0.1mol/L NaOH,0.2mol/L NaAc),流速0.5mL/min;柱溫為30℃;洗脫梯度:0min A相/B相(95:5/),30min A相/B相(80:20/),30.1min A相/B相(60:40/),45min A相/B相(60:40/),45.1min A相/B相(95:5/),60min A相/B相(95:5/).

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,使用IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行單因素方差(ANOVA)分析,Tukey’HSD進(jìn)行事后多重比較檢驗(yàn),在95%的顯著性水平上評(píng)估結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05).

對(duì)于沒有生物學(xué)重復(fù)的基因組測(cè)序,對(duì)4個(gè)樣品(紅光、藍(lán)光、綠光和白光組)的raw counts進(jìn)行基于TMM(Trimmed Mean of M-values,M-值的加權(quán)截尾均值)方法的標(biāo)準(zhǔn)化,然后利用DEGseq軟件進(jìn)行組間差異表達(dá)分析.為了控制整體推斷結(jié)果發(fā)生錯(cuò)誤的概率或頻次,對(duì)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)獲得的-value利用BH(FDR correction with Benjamini & Hochberg,Benjamini & Hochberg法控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率)進(jìn)行多重檢驗(yàn)矯正,矯正后的-value即為-adjust.利用RSEM軟件,根據(jù)基因的表達(dá)量FPKM值計(jì)算出單色光培養(yǎng)/白光培養(yǎng)的FC(Fold change,差異倍數(shù))進(jìn)行差異分析.滿足|log2FC|31 &-adjust<0.05篩選條件的基因視為差異表達(dá)基因(DEGs).KEGG代謝通路使用Fisher 精確檢驗(yàn),當(dāng)-adjust<0.05時(shí),認(rèn)為此KEGG通路在基因集中顯著富集.本文所描述的基因上下調(diào)表達(dá)規(guī)律,均表示單色光(紅光、藍(lán)光和綠光)相較于白光中的同種轉(zhuǎn)錄變化情況.

2 結(jié)果與討論

2.1 單色光對(duì)C. sorokiniana生長的影響

2.1.1 藻細(xì)胞密度 如圖1所示,初始藻細(xì)胞密度為(0.79±0.03)×107cells/mL.根據(jù)單因素方差分析和Tukey’HSD檢驗(yàn),紅光下的藻細(xì)胞密度與綠光和白光均存在顯著性差異(<0.05),與藍(lán)光下獲得的藻細(xì)胞密度之間無顯著性差異.結(jié)果表明:能迅速適應(yīng)紅光和藍(lán)光環(huán)境,細(xì)胞生長速率明顯比綠光和白光下的高(表1),表明與其它波長相比,紅光和藍(lán)光是適合生長的光質(zhì).這與一些學(xué)者的研究結(jié)果相似,Alboresi等[4]、Fan等[25]和唐青青等[26]的研究發(fā)現(xiàn)微藻的葉綠素更傾向于吸收紅色或藍(lán)色光子,雖然這些學(xué)者的研究對(duì)象為不同的微藻,但結(jié)果均表明了微藻在紅光或藍(lán)光中的生長情況較好,獲得了較高的生物量.

圖1 不同光質(zhì)下小球藻的細(xì)胞密度

表1 不同光質(zhì)下小球藻的比生長速率

注:1和2為前3d和前7d的比生長速率.

紅光下微藻前期的生長速率最高,微藻細(xì)胞密度比藍(lán)光大,可能是因?yàn)槎唐趦?nèi)紅光促進(jìn)了微藻分裂.丙酮酸脫氫酶參與的糖酵解過程可提供磷酸核糖和能量參與核酸的生物合成[27].紅光下參與丙酮酸脫氫酶的基因(Gene id:TRINITY_DN29677_ c0_g1)表達(dá)量最高(圖4),微藻細(xì)胞合成核酸的生化反應(yīng)比藍(lán)光、綠光和白光更為迅速,即短期的紅光培養(yǎng)在一定程度上促進(jìn)了的分裂繁殖.這與Kim等[1]的研究結(jié)論相似,他們?cè)谘芯繄?bào)告中指出紅光有利于進(jìn)行細(xì)胞分裂并提高生物量生產(chǎn)率.相反的是,在培養(yǎng)后期藍(lán)光下的藻細(xì)胞濃度增長比紅光快,這是因?yàn)榧t光的波長較長,光子能量較低,隨著反應(yīng)器中微藻濃度增大,紅光光子較難穿透到反應(yīng)器中部,所以在培養(yǎng)后期,紅光下的微藻光合作用不如藍(lán)光活躍.在第7d紅、藍(lán)光的藻細(xì)胞密度分別達(dá)到(4.13±0.39)×107和(4.35± 0.45)×107cells/mL,紅光組和藍(lán)光組的藻細(xì)胞密度分別比白光對(duì)照組的高52.96%和61.11%.

2.1.2 光合色素 如圖2所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),藍(lán)光組的Chl a、Chl b和Car濃度分別為(17.84±0.26), (8.39±0.19), (6.04±0.08) mg/L;紅光組的Chl a、Chl b和Car濃度分別為(14.16±0.37), (4.65±0.19), (5.09± 0.11) mg/L;綠光組的Chl a、Chl b和Car濃度分別為(10.91±0.34), (4.40±0.08), (3.99±0.10) mg/L;白光組的Chl a、Chl b和Car濃度分別為(12.60±0.56), (5.37±0.23), (4.56±0.23) mg/L.在培養(yǎng)初期(第1～3d)和末期(第6～7d),綠光組的光合色素濃度均較低,但在培養(yǎng)中期(第4～5d),綠光組的光合色素濃度逐漸增加,在第5d的時(shí)候Chl a、Chl b和Car濃度最高達(dá)到了(17.60±0.48), (8.61±0.44), (5.98±0.14) mg/L.

藍(lán)光下的光合色素濃度比紅光的高.這與Vadiveloo等[17]和Kim等[1]的研究結(jié)果相似.相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)微藻細(xì)胞的光合色素決定了大部分微藻是傾向于利用紅光和藍(lán)光光子[28-29].結(jié)合圖5分析可知,紅光下參與合成細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體的基因表達(dá)水平下調(diào),而藍(lán)光下參與合成細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體的基因表達(dá)水平上調(diào),意味著的光合色素傾向于捕獲藍(lán)光光子.

綠光LED的::=0.3:98.0:1.7,綠光的光譜范圍中左側(cè)有一部分與藍(lán)光重疊,光譜右側(cè)有一部分與紅光重疊,大部分綠光被反射而不能被吸收,因此在接入綠光培養(yǎng)的初期,微藻的光合色素濃度并沒有顯著改變,在此階段微藻利用原有的儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)的能量物質(zhì)進(jìn)行生長繁殖,導(dǎo)致的碳水化合物濃度有所下降(圖3).在綠光培養(yǎng)的中期,微藻細(xì)胞中儲(chǔ)存的碳水化合物已經(jīng)不足以提供其維持正常的生理活動(dòng),為了適應(yīng)綠光的脅迫環(huán)境,需要合成更多可以吸收綠光中與紅藍(lán)光重疊光譜的光合色素,以進(jìn)行光合作用合成能量物質(zhì),結(jié)合圖5c分析可知,綠光下參與合成細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體的基因表達(dá)水平上調(diào),因此綠光培養(yǎng)中期的光合色素濃度迅速增加.在綠光培養(yǎng)的末期,可能是由于長時(shí)間的綠光脅迫加速了的衰亡期的到來,微藻的光合色素濃度有所下降,且下降幅度較其它3個(gè)光質(zhì)組的大.

(a) 葉綠素 a; (b) 葉綠素 b; (c) 類胡蘿卜素

2.1.3 碳水化合物含量和脂質(zhì)含量 各組的碳水化合物和脂質(zhì)含量初始值為(72.88±0.11) μg/mg和(5.96±0.36)%.如圖3所示,在培養(yǎng)初期,紅光下的分解碳水化合物提供細(xì)胞分裂所需的磷酸核糖和能量,所以在紅光下培養(yǎng)3d后的碳水化合物含量和脂質(zhì)含量均比藍(lán)光低,但紅光培養(yǎng)7d后的碳水化合物含量和脂質(zhì)含量均最高,分別達(dá)到了(115.60±1.81) μg/mg和(18.64±0.54)%.這是因?yàn)榧t光下固定CO2的碳酸酐酶(Gene id:TRINITY_DN442_c0_g5)的基因表達(dá)量比藍(lán)光下的高,合成脂肪酸的乙酰輔酶A羧化酶(Gene id:TRINITY_DN25174_c0_g1)和脂肪酸合成酶(Gene id:TRINITY_DN16349_c0_g2)的基因表達(dá)量(圖4)也比藍(lán)光下的高,即表明紅光下的合成碳水化合物和脂質(zhì)等能量物質(zhì)的生化過程比藍(lán)光的活躍.同時(shí),參與TCA循環(huán)的丙酮酸羧化酶(Gene id:TRINITY_DN10107_c0_g1)和磷酸戊糖途徑的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Gene id: TRINITY_DN24821_c0_g1)的基因表達(dá)量比藍(lán)光的低,表明紅光下分解碳水化合物的生化過程比藍(lán)光緩慢.因此在培養(yǎng)末期,紅光下的碳水化合物含量和脂質(zhì)含量比藍(lán)光的高.在許多學(xué)者的研究中均有紅光刺激微藻合成碳水化合物的結(jié)論[30-34].此外,在許多學(xué)者的研究中也得到了紅光促進(jìn)微藻脂質(zhì)合成的結(jié)論[35-38].

在綠光下生長7d后[(70.76±1.13) μg/mg]的碳水化合物含量比培養(yǎng)3d后[(65.67±1.88) μg/mg]的含量低.相反,綠光下生長7d后(9.16%)的脂質(zhì)含量比培養(yǎng)3d后(7.80%)的高.結(jié)合圖4來看,這是因?yàn)榫G光下的脂肪酸合成過程和磷酸戊糖途徑比較活躍.綠光下參與合成脂肪酸的乙酰輔酶A羧化酶(Gene id:TRINITY_DN18846_ c0_g1;TRINITY_DN18846_c0_g3;TRINITY_DN23484_c0_g1)的基因表達(dá)量較高,參與磷酸戊糖途徑的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Gene id: TRINITY_ DN24821_c0_g1)和參與TCA循環(huán)的丙酮酸羧化酶(Gene id:TRINITY_DN10107_c0_g1)的基因表達(dá)量均較高,表明綠光下微藻細(xì)胞一方面分解碳水化合物維持細(xì)胞正常的生理活動(dòng),另一方面積累脂質(zhì)應(yīng)對(duì)綠光的脅迫環(huán)境.在Ra等[39]和Das等[40]的研究報(bào)告中也提到了短期的綠光脅迫有助于提高微藻的脂質(zhì)含量.

在白光下培養(yǎng)3d后的的碳水化合物含量和脂質(zhì)含量與培養(yǎng)7d后的相比沒有明顯增加.結(jié)合圖4分析,白光下參與糖異生過程的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Gene id:TRINITY_DN5136_ c0_g1;TRINITY_DN21219_c0_g1;TRINITY_DN1384_c0_g1)的基因表達(dá)量較高;參與TCA循環(huán)的異檸檬酸脫氫酶(Gene id:TRINITY_DN5047_c0_g1; TRINITY_DN18028_c0_g1)、酮戊二酸脫氫酶(Gene id:TRINITY_DN11395_c0_g1)、琥珀酸脫氫酶(Gene id:TRINITY_DN25148_c0_g1)和檸檬酸合酶(Gene id:TRINITY_DN9140_c0_g1;TRINITY_DN7537_c0_g1;TRINITY_DN30503_c0_g1)的基因表達(dá)量也較高.綜上分析可知白光下合成有機(jī)物與分解有機(jī)物的生化過程均比較活躍,不利于微藻積累大分子有機(jī)物.這可能是因?yàn)榘咨獿ED光源中包含了紅藍(lán)綠光,白光表現(xiàn)出紅藍(lán)綠光質(zhì)的混合效應(yīng)[41].

圖3 不同光質(zhì)下小球藻的碳水化合物和脂質(zhì)含量

2.2 單色光下C. sorokiniana小球藻轉(zhuǎn)錄學(xué)分析

2.2.1 DEGs的聚類熱圖 如圖4所示,篩選的基因參與的生化過程主要包括:TCA循環(huán)、糖酵解和糖異生過程、磷酸戊糖途徑、類胡蘿卜素合成、碳固定、氮代謝以及脂肪酸合成.不同光質(zhì)下培養(yǎng)的的代謝通路存在較大的差異,紅光下的差異表達(dá)基因大部分參與了脂肪酸的合成和碳固定過程.藍(lán)光引起的差異基因表達(dá)則集中在TCA循環(huán)、磷酸戊糖途徑和碳固定過程.相較于其它光質(zhì)來說,綠光下培養(yǎng)的微藻的基因表達(dá)量最低.白光下微藻差異表達(dá)的基因主要參與TCA循環(huán)、糖酵解和糖異生過程.

2.2.2 光合作用代謝通路 為了研究光合作用相關(guān)基因表達(dá)的變化情況,分析了微藻細(xì)胞在不同光質(zhì)下生長4d后的轉(zhuǎn)錄水平,并與白光培養(yǎng)的微藻細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了對(duì)比.對(duì)紅光組和白光組的差異基因集進(jìn)行KEGG功能富集分析,光合作用變化情況如圖5a所示.光系統(tǒng)Ⅱ(PhotosystemⅡ,PSⅡ)中(Psa C、Psa P、Psa Y和Psb 28)、光合電子傳輸中(Pet H)和F型ATP酶(F-type ATPase)中(alpha)的基因上調(diào)表達(dá),表明紅光在一定程度上可以促進(jìn)PSⅡ水的光解和O2的釋放.此外,通過細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體在PSⅠ和PSⅡ之間進(jìn)行電子傳遞,將光能轉(zhuǎn)化為跨膜質(zhì)子梯度,用于ATP合成[42-43].而紅光下的細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體中(Pet C)基因表達(dá)水平下調(diào),長時(shí)間在紅光培養(yǎng)可能會(huì)降低藻細(xì)胞的電子轉(zhuǎn)移速率和ATP合成速率.綜合比較來說,紅光并不是進(jìn)行光合作用的最佳光源.

圖4 不同光質(zhì)下小球藻差異表達(dá)unigene的聚類熱圖

圖中每列表示一個(gè)樣本(WHITE?RED?BLUE和GREEN分別代表白光?紅光?藍(lán)光和綠光),每行表示一個(gè)unigene,圖中的顏色表示unigene在該樣本中表達(dá)量的高低,紅色代表unigene在樣本中表達(dá)量較高,藍(lán)色代表unigene的表達(dá)量較低對(duì)藍(lán)光組和白光組的差異基因集進(jìn)行KEGG功能富集分析,光合作用代謝通路變化情況如圖5b所示.藍(lán)光明顯促進(jìn)了的光合作用,無論是光合系統(tǒng)(PSⅠ和PSⅡ)還是細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體中,富集的差異基因均上調(diào)表達(dá).Kim等[1]在研究報(bào)告中指出藍(lán)光下參與PSⅡ的基因表達(dá)增加.通過對(duì)比圖5中與PSⅡ相關(guān)的基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),圖5b中(即藍(lán)光)PSⅡ的上調(diào)表達(dá)的基因最多,這與Kim等[1]的研究結(jié)果一致.此外,藍(lán)光下RubisCO酶(Gene id:TRINITY_DN20432_c0_g1;TRINITY_DN7040_c0_g1) 的基因表達(dá)量最高(圖4),該酶是碳固定過程必不可少的酶[44],表明藍(lán)光的碳固定速率比紅光和綠光快. Olga等[45]發(fā)現(xiàn)藍(lán)光促進(jìn)了RubisCO酶的合成,提高了CO2的固定速率.Kim等[1]認(rèn)為藍(lán)光可能激活RubisCO酶,與本研究結(jié)果一致.

圖5 不同光質(zhì)下小球藻的光合作用代謝通路

a、b、c分別為紅光、藍(lán)光、綠光的差異基因表達(dá)情況;長方形綠色方框代表顯著差異表達(dá)的基因注釋到的ko節(jié)點(diǎn);方框內(nèi)的數(shù)字/字母表示酶的EC編號(hào);紅框?qū)?yīng)表達(dá)量上調(diào)的基因,藍(lán)框?qū)?yīng)表達(dá)量下調(diào)的基因,紅藍(lán)框?qū)?yīng)既有上調(diào)又有下調(diào)的基因

對(duì)綠光組和白光組的差異基因集進(jìn)行KEGG功能富集分析,通路變化情況如圖5c所示.除了光合電子傳輸中(Pet F)下調(diào)表達(dá)外,其它顯著富集的基因均上調(diào)表達(dá),綠光中參與光合作用的上調(diào)表達(dá)的基因比紅光的多但較藍(lán)光的少,說明綠光不如藍(lán)光被微藻吸收利用的程度大,光合作用速率較藍(lán)光緩慢.綠光下的細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體中Pet B上調(diào)表達(dá),表明綠光下的為了進(jìn)行光合作用維持細(xì)胞正常的代謝,微藻在綠光脅迫下合成更高濃度的光合色素.

3 結(jié)論

3.1 紅、藍(lán)光是生長的有效光質(zhì).在實(shí)驗(yàn)結(jié)束的時(shí)候,紅光組和藍(lán)光組的藻細(xì)胞密度分別達(dá)到(4.13±0.39)×107和(4.35±0.45)×107cells/mL,紅光組和藍(lán)光組的藻細(xì)胞密度分別比白光對(duì)照組的高52.96%和61.11%.

3.2在不同光質(zhì)下具有獨(dú)特的生理特性.藍(lán)光組的Chl a、Chl b和Car濃度最高,分別為(17.84±0.26), (8.39±0.19), (6.04±0.08) mg/L.微藻細(xì)胞需要合成更多可以吸收綠光中與紅藍(lán)光重疊光譜的光合色素來應(yīng)對(duì)綠光的脅迫,但長時(shí)間的脅迫會(huì)加速微藻衰亡期的到來,降低藻細(xì)胞內(nèi)的光合色素濃度.紅光促進(jìn)微藻積累碳水化合物和脂質(zhì),在紅光下培養(yǎng)7d后微藻的碳水化合物含量和脂質(zhì)含量均最高,分別達(dá)到了(115.60±1.81)μg/mg和(18.64± 0.54)%.

3.3 不同光質(zhì)下培養(yǎng)的的基因存在表達(dá)差異.紅光下微藻差異表達(dá)的基因大部分參與了脂肪酸的合成和碳固定過程.藍(lán)光下微藻的TCA循環(huán)、磷酸戊糖途徑和碳固定過程較為活躍.白光下微藻的TCA循環(huán)很活躍,無法儲(chǔ)存能量物質(zhì).相比之下,綠光微藻的大部分基因表達(dá)量較低,新陳代謝潛能較差.

3.4 藍(lán)光明顯促進(jìn)了的光合作用.無論是光合系統(tǒng)(PSⅠ和PSⅡ)還是細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體中,富集的差異基因均上調(diào)表達(dá),與其它光質(zhì)組相比,光合速率和碳固定速率最快.

[1] Kim D G, Lee C S, Park S M, et al. Manipulation of light wavelength at appropriate growth stage to enhance biomass productivity and fatty acid methyl ester yield using[J]. Bioresource Technology, 2014,159:240-248.

[2] Yoshifumi U, Shimpei A, Akihiko K, et al. Adaptation of light- harvesting functions of unicellular green algae to different light qualities [J]. Photosynthesis Research, 2018,139(1-3):145-154.

[3] 李 瑩,吳興杰,賀治斌,等.宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)在環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2021,41(9):4341-4348.

Li Y, Wu X J, He Z B, et al.Application of metatranscriptomics in environmental microbial ecology [J]. China Environmental Science, 2021,41(9):4341-4348.

[4] Alboresi A, Perin G, Vitulo N, et al. Light remodels lipid bio-synthesis inmodulating carbon partitioning between organelles [J]. Plant Physiology, 2016,171(4):2468-2482.

[5] Mehmet T, Meric D U, Ibrahim B, et al. RNA-seq analysis of the transcriptional response to blue and red light in the extremophilic red alga,[J]. Functional & integrative genomics, 2016,16(6):657-669.

[6] Ra C H, Sirisuk P, Jung J H, et al. Effects of light-emitting diode (LED) with a mixture of wavelengths on the growth and lipid content of microalgae [J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2018,41(4): 457-465.

[7] Shu C H, Tsai C C, Liao W H, et al. Effects of light quality on the accumulation of oil in a mixed culture ofsp. and[J]. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 2012,87(5):601-607.

[8] Hwang J H, Maier N. Effects of LED-controlled spatially-averaged light intensity and wavelength ongrowth and lipid composition [J]. Algal Research, 2019,41:101573.

[9] Jung J H, Sirisuk P, Ra C H, et al. Effects of green LED light and three stresses on biomass and lipid accumulation with two-phase culture of microalgae [J]. Process Biochemistry, 2019,77:93-99.

[10] 孫建瑞,趙君峰,符丹丹,等.不同光質(zhì)對(duì)衣藻(sp.212)生長及油脂積累的影響[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2020,26(4): 1016-1022.

Sun J R, Zhao J F, Fu D D, et al. Effects of different lights on the growth and lipid accumulation ofsp. 212 [J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2020,26(4):1016- 1022.

[11] 李元翔.杜氏鹽藻類胡蘿卜素代謝對(duì)光強(qiáng)和光質(zhì)變化的響應(yīng)機(jī)制[D]. 青島:中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所), 2019.

Li Y X. The response mechanism of carotenoid biosynthesis pathway under different intensities and wavelengths of light in[D]. Qingdao: University of Chinese Academy of Sciences (Institute of Oceanography, Chinese Academy of Sciences), 2019.

[12] 蔡學(xué)花.杜氏鹽藻對(duì)不同濃度CO2與光質(zhì)的代謝響應(yīng)[D]. 青島:中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所), 2018.

Cai X H. Metabolic responses ofto different concentrations of CO2and light quality [D]. Qingdao: University of Chinese Academy of Sciences (Institute of Oceanography, Chinese Academy of Sciences), 2018.

[13] Blair M F, Kokabian B, Gude V G. Light and growth medium effect onbiomass production [J]. Journal of Environmental Chemical Engineering, 2014,2(1):665-674.

[14] 李 珂,李清毅,郭文文,等.高碳與光調(diào)控對(duì)微藻捕集CO2的影響機(jī)制[J]. 化工進(jìn)展, 2020,39(11):4600-4607.

Li K, Li Q Y, Guo W W, et al. Effects of high carbon and light regulation on CO2capture by microalgae [J]. Chemical Industry and Engineering Progress, 2020,39(11):4600-4607.

[15] 魏 群,毛 瑞,馬湘蒙,等.光質(zhì)對(duì)蛋白核小球藻膜生長及除鎘效果的影響[J]. 華北水利水電大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2021,42(1):16- 21.

Wei Q, Mao R, Ma X M, et al. Effects of different light qualities onbiofilm growth and cadmium removal [J]. Journal of North China University of Water Resources and Electric Power (Natural Sciences Edition), 2021,42(01):16-21.

[16] Amrei H D, Ranjbar R, Rastegar S, et al. Using fluorescent material for enhancing microalgae growth rate in photobioreactors [J]. Journal of Applied Phycology, 2015,27(1):67-74.

[17] Vadiveloo A, Moheimani N R, Cosgrove J J, et al. Effect of different .light spectra on the growth and productivity of acclimatedsp. () [J]. Algal Research, 2015,8: 121-127.

[18] Stanier R Y, Kunisawa R, Mandel M, et al. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order) [J]. Bacteriological Reviews, 1971,35(2):171-205.

[19] Cheirsilp B, Torpee S. Enhanced growth and lipid production of microalgae under mixotrophic culture condition: effect of light intensity, glucose concentration and fed-batch cultivation [J]. Bioresource Technology, 2012,110:510-516.

[20] Jeffrey S W, Humphrey G F. New spectrophotometric equations for determining chlorophylls a, b, c1and c2 in higher plants, algae and natural phytoplankton [J]. Biochemie und Physiologie der Pflanzen, 1975,167(2):191-194.

[21] Jensen A. Handbook of phycological methods [M]. London: Cambridge University Press, 1978.

[22] Folch J, Lees M, Sloane S G H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues [J]. Journal of Biological Chemistry, 1957,226(1):497-509.

[23] 熊 偉,黃 云,付 乾,等.微藻生物膜營養(yǎng)環(huán)境對(duì)微藻生長和油脂積累影響[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2016,36(8):2463-2469.

Xiong W, Huang Y, Fu Q, et al.Effect of nutrient solution content of biofilm on algal growth and lipid accumulation [J]. China Environmental Science, 2016,36(8):2463-2469.

[24] Templeton D W, Quinn M, Wychen S V, et al. Separation and quantification of microalgal carbohydrates [J]. Journal of Chromatography A, 2012,1270:225-234.

[25] Fan H H, Wang K, Wang C, et al. A comparative study on growth characters and nutrients removal from wastewater by two microalgae under optimized light regimes [J]. Environmental Technology & Innovation, 2020,19:100849.

[26] 唐青青,方治國,嵇雯雯,等.光質(zhì)對(duì)蛋白核小球藻()生長特征及生化組成的影響研究[J]. 環(huán)境科學(xué), 2014, 35(11):4212-4217.

Tang Q Q, Fang Z G, Ji W W,et al.Effects of light quality on the growth characteristics and biochemical component of[J]. Environmental Science, 2014,35(11):4212-4217.

[27] 馬瑜晗.反義抑制三角褐指藻丙酮酸脫氫酶激酶基因促進(jìn)脂質(zhì)合成的研究[D]. 廣州:暨南大學(xué), 2016.

Ma Y H. Antisense inhibition ofpyruvate dehydrogenase kinase gene to promote lipid synthesis [D]. Guangzhou: Jinan University, 2016.

[28] Tamburic B, Szabó M, Tran N A T, et al. Action spectra of oxygen production and chlorophyll a fluorescence in the green microalga[J]. Bioresource Technology, 2014,169:320- 327.

[29] Takaichi S. Carotenoids in algae: distributions, biosyntheses and functions [J]. Marine drugs, 2011,9(6):1101-1118.

[30] Kim C W, Sung M G, Nam K, et al. Effect of monochromatic illumination on lipid accumulation ofunder continuous cultivation [J]. Bioresource Technology, 2014,159:30-35.

[31] Hogewoning S W, Trouwborst G, Maljaars H, et al. Blue light dose-responses of leaf photosynthesis, morphology, and chemical composition ofgrown under different combinations of red and blue light [J]. Journal of Experiment Botany, 2010,61(11):3107- 3117.

[32] Li X P, Manuel J, Slavens S, et al. Interactive effects of light quality and culturing temperature on algal cell size, biomass doubling time, protein content, and carbohydrate content [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2021,105(2):587-597.

[33] Ajayan K V, Harilal C C, Gani P. Performance of reflector coated LED Bio-box on the augmentation of growth and lipid production in aerophytic trebouxiophyceaen algaesp. [J]. Algal Research, 2019,38:101401.

[34] Schulze P S C, Pereira H G C, Santos T F C, et al. Effect of light quality supplied by light emitting diodes (LEDs) on growth and biochemical profiles ofand[J]. Algal Research, 2016,16:387-398.

[35] Eugenio G L D, Erika O A A, Alejandro R U, et al. Effect of green and red light in lipid accumulation and transcriptional profile of genes implicated in lipid biosynthesis in[J]. Biotechnology Progress, 2016,32(6):1404-1411.

[36] Schulze P S C, Barreira L A, Pereira H G C, et al. Light emitting diodes (LEDs) applied to microalgal production [J]. Trends in Biotechnology, 2014,32(8):422-430.

[37] Hee K S, Yung S I, Jun H H, et al. Lipid and unsaturated fatty acid productions from three microalgae using nitrate and light-emitting diodes with complementary LED wavelength in a two-phase culture system [J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2019,42(9):1-10.

[38] Severes A, Hegde S, Souza L D, et al. Use of light emitting diodes (LEDs) for enhanced lipid production in micro-algae based biofuels [J]. Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology, 2017, 170:235-240.

[39] Ra C H, Kang C H, Jung J H, et al. Effects of light-emitting diodes(LEDs) on the accumulation of lipid content using a two-phase culture process with three microalgae [J]. Bioresource Technology, 2016,212:254-261.

[40] Das P, Lei W, Aziz S S, et al. Enhanced algae growth in both phototrophic and mixotrophic culture under blue light [J]. Bioresource Technology, 2011,102(4):3883-3887.

[41] Wang C Y, Fu C C, Liu Y C. Effects of using light-emitting diodes on the cultivation of[J]. Biochemical Engineering Journal, 2007,37(1):21-25.

[42] Mirkovic T, Ostroumov E E, Anna J M, et al. Light absorption and energy transfer in the antenna complexes of photosynthetic organisms [J]. Chemical Reviews, 2017,117(2):249-293.

[43] Tikhonov A N. Induction events and short-term regulation of electron transport in chloroplasts: an overview [J]. Photosynthesis Research, 2015,125(1/2):65-94.

[44] Teo C L, Atta M, Bukhari A, et al. Enhancing growth and lipid production of marine microalgae for biodiesel production via the use of different LED wavelengths [J]. Bioresource Technology, 2014,162: 38-44.

[45] Olga S, Virginie M, Lionel U, et al. Modulation of lipid biosynthesis by stress in diatoms [J]. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences, 2017,372(1728): 20160407.

Regulation of light quality ongrowth and metabolism.

GAN Yu-hua, WEI Qun*, MA Xiang-meng, LI Zhong-tang, JIN Yuan-rong, LI Shu-yuan

(School of Resources, Environment and Materials, Guangxi University, Nanning 530004, China)., 2022,42(9)：4296～4303

In order to evaluate effects of light quality on the growth ofand metabolic mechanisms, this study was designed to monitor the growth ofunder different light qualities with transcriptome sequencing. The results show that red and blue lights were effective forgrowth, and the algal cell density was 52.96% and 61.11% higher than that of the white light control group after 7days of cultivation with red and blue light culture, respectively.demonstrated unique physiological characteristics under different light qualities, and the blue light group had the highest concentration of Chl, Chland Car with (17.84±0.26), (8.39±0.19) and (6.04±0.08)mg/L, respectively; the carbohydrate and lipid contents of the microalgae were the highest after 7 days of red light incubation, reaching (115.60±1.81)μg/mg and (18.64±0.54)%, respectively. Gene expression ofdiffered under different light qualities as indicated by transcriptome sequencing. The gene expression of carbonic anhydrase, acetyl coenzyme A carboxylase and fatty acid synthase were most significant under red light, and majority of the differentially expressed genes were involved in fatty acid synthesis and carbon fixation; the gene expression of RubisCO enzyme was the highest under blue light and the differentially expressed genes enriched in the photosynthetic system were up-regulated, and the photosynthetic rate and carbon fixation rate were the fastest; the gene expression of most of the genes in microalgae under green light was low with poor metabolic potential. The TCA cycle ofwas active under white light, which was not conducive to the storage of carbohydrates and lipids.

light quality；；growth；metabolism；gene；high-throughput sequencing

X52

A

1000-6923(2022)09-4296-08

2022-02-14

廣西重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科AB1850006)

*責(zé)任作者, 教授, hustweiqun@163.com

甘鈺華(1996-),女,廣西貴港人,廣西大學(xué)碩士研究生,從事水污染控制方面研究.