王華倩 余亞君 張 濤 潘海滔 何 堯

(1.紹興文理學院 醫(yī)學院，浙江 紹興312000；2.紹興市婦幼保健院，浙江 紹興 312000)

稽留流產(chǎn)(Missed Abortion，MA)是指胚胎或胎兒死亡后未及時排出者[1].近年來，隨著三胎政策放開后高齡孕婦的增多，其發(fā)病率逐年上升[2]，給廣大育齡婦女及其家庭造成了很大的心理負擔[3].人胎盤滋養(yǎng)細胞分化障礙是導致多種妊娠并發(fā)癥的關(guān)鍵因素[4].

Hippo通路是指近年來研究較多的參與組織發(fā)育、干細胞分化和細胞凋亡等的信號通路，其核心成分L 型氨基酸轉(zhuǎn)運載體(L-Type Amino Acid Transporter，LAT)[5]、Yes相關(guān)蛋白(Yes-Associated Protein, YAP)[4]、TEA 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子 4(TEA Domain Transcription Factor 4，TEAD4)[6]等已經(jīng)被證實在胚胎植入中發(fā)揮重要作用.YAP1作為該通路下游主要的效應分子，在Hippo信號通路中的某些分子出現(xiàn)突變時,會處于超激活狀態(tài),促進滋養(yǎng)細胞增殖、遷移與侵襲[7].余超等[8]研究發(fā)現(xiàn)，YAP1的突變體與稽留流產(chǎn)的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系，敲除YAP1的卵母細胞雖然能夠正常成熟和受精，但胚胎發(fā)育遲緩，并在3～4天內(nèi)死亡，表明YAP1可能參與了早期胚胎的形成.

JAR細胞與其起源的滋養(yǎng)細胞保持著極為相似的生物學特性，如侵襲組織及血管，被很多學者用來研究滋養(yǎng)細胞功能相關(guān)的調(diào)控機制[9]，Biswarup等[10]研究發(fā)現(xiàn)YAP在人胚胎干細胞和JAR細胞均有強烈表達.因此，本研究擬通過建立人胎盤絨毛癌JAR細胞模型，采用siRNA技術(shù)干擾下調(diào)模型中YAP1的表達，探討YAP1蛋白對滋養(yǎng)細胞生物學行為的調(diào)控作用及其與稽留流產(chǎn)發(fā)病的可能機制.

1 材料與方法

1.1 對象

選擇2018年7月在紹興市婦幼保健院確診為稽留流產(chǎn)的患者4例為實驗組(MT)，稽留流產(chǎn)的診斷標準以第9版《婦產(chǎn)科學》為主，經(jīng)超聲檢查證實停育，孕周小于12周，平均年齡26歲，孕次1～3次.選擇同期自愿在該院行人工流產(chǎn)術(shù)的正常早孕婦女為對照組(MC).兩組孕婦的年齡、孕周、合并癥比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05).本研究方案已獲醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均已簽署知情同意書.

1.2 主要試劑與儀器

JAR細胞株購自美國ATCC公司；siRNA購自銳博生物，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Matrigel購自美國BI公司，Lipo6000、FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑、BeyoFast SYBR Green qPCR Mix(2X，High ROX)、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、YAP1(AF1615)、PI3-k(AF1966)、Caspase-3(AF1213)、Caspase-9(AF1264)、Bax(AF0054)、MEK1/2(AF1057)、Akt1(AF0045)、IRS1(AF2587)、GAPDH小鼠單抗(AG019)、Tubulin抗體(AT819)均購于碧云天.二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo，實時無標記細胞分析儀(RTCA)購自ACEA，PCR儀型號為珠海黑馬Hema9600.

1.3 實驗方法

1.3.1 Western Blot試驗及實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證YAP1在稽留流產(chǎn)絨毛中的表達水平

將臨床收集到的兩組絨毛用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，冰上裂解30 min，4 ℃ 14 000 rpm高速離心4 min，上清液過膜，提取細胞裂解液.按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書步驟檢測YAP1蛋白濃度.取樣本進行SDS-PAGE凝膠配置、電泳、轉(zhuǎn)膜、剪膜，根據(jù)測定的蛋白分子量，分別孵育一抗，4 ℃過夜，12 h后TBST洗膜3次加入二抗，室溫孵育1 h，再洗滌，滴入ECL顯色液2 min后，采用軟件Sage Capture曝光顯影分析各條帶的灰度值.將提取的總RNA按FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑說明書進項操作獲得cDNA，測定濃度后，根據(jù)BeyoFast SYBR Green qPCR Mix(2X，High ROX)說明，并以β-actin作為內(nèi)參基因檢測YAP1 mRNA的表達.

1.3.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

采用RPMI1640培養(yǎng)基(含10% FBS)，在37 ℃ 5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)JAR細胞，待細胞密度達到70%～80%時，添加含0.25%EDTA的胰蛋白酶進行消化傳代.以2×105個/孔的密度將第三代對數(shù)生長期細胞接種于培養(yǎng)板上，隨機分為空白組(NC)、試劑對照組(Li)和轉(zhuǎn)染siRNA-YAP1組(siRNA-YAP1)，根據(jù)Lipo6000說明書操作，將轉(zhuǎn)染試劑加入細胞中，在37 ℃ 5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中孵育6 h更換完全培養(yǎng)基.轉(zhuǎn)染后采用qRT-PCR與Western Blot檢測JAR細胞中YAP1 mRNA與蛋白表達變化.

1.3.3 在細胞水平驗證YAP1下調(diào)表達對JAR細胞特性的影響

收集轉(zhuǎn)染后的JAR細胞，消化離心后配置成細胞懸液，計數(shù)后配置成細胞數(shù)目為1×104個/100μL的細胞懸液，室溫放置30 min后，在37 ℃ 5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中，使用RTCA檢測細胞增殖能力變化.裝配CIM板，同上述方法進行細胞懸液的細胞計數(shù)、細胞懸液配置，然后在測好基線的CIM 板的上室孔中加入100 μL混合均勻的無血清細胞懸液，置于RTCA檢測.采用預冷的無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel進行細胞侵襲能力檢測，用倒吸法加入20 μL Matrigel包被CIM-Plate上室，置于培養(yǎng)箱中約4 h包被至其凝固，后續(xù)與遷移實驗操作一致，檢測細胞侵襲能力.

1.3.4 凋亡及胚胎植入相關(guān)重要信號通路關(guān)鍵蛋白的檢測

實驗方法同上，分別以Tubulin、GAPDH為內(nèi)參，采用Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白BAX、caspase-3、caspase-9和胚胎植入相關(guān)重要信號通路關(guān)鍵蛋白IRS、PI3-k、Akt1、MEK1/2蛋白的表達情況.

1.4 統(tǒng)計學處理

采用Graphpad Rrism 6進行統(tǒng)計分析，計量資料均以(ˉx±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義.所有數(shù)據(jù)以三次重復的平均值±SEM表示.

2 結(jié)果

2.1 YAP1在稽留流產(chǎn)和正常早孕人流絨毛組織中的表達

qRT-PCR和Western Blot結(jié)果均顯示，與正常組織對照相比，稽留流產(chǎn)絨毛組織樣本中YAP1在基因水平和蛋白水平的表達均明顯上調(diào)，如圖1，故選擇下調(diào)YAP1表達的人JAR細胞進行后續(xù)研究.

(a)實時熒光定量PCR檢測；(b、c)：Western Blot 檢測；MC：正常對照組，MT：稽留流產(chǎn)組；P<0.05

2.2 轉(zhuǎn)染siRNA-YAP1后JAR細胞活性比較

與NC組和Li組相比，轉(zhuǎn)染后的JAR細胞中YAP1的表達水平顯著低于NC組和Li組，如圖2所示，表明YAP1的siRNA在JAR細胞系中成功敲減了靶蛋白YAP1，可以進行敲低后的JAR細胞增殖、遷移和侵襲的后續(xù)分析.

圖2 YAP1-si-RNA可明顯抑制JAR細胞中YAP1 的表達

2.3 下調(diào)YAP1表達抑制JAR細胞的增殖、遷移和侵襲能力

隨著培養(yǎng)時間的延長，與NC組和Li組相比，si-YAP1組的增殖、遷移和侵襲能力都明顯受到了抑制，如圖3所示.

(a)YAP1調(diào)節(jié)細胞增殖實驗結(jié)果

2.4 下調(diào)YAP1表達對凋亡相關(guān)蛋白及胚胎植入相關(guān)重要信號通路關(guān)鍵蛋白的影響

Western Blot實驗結(jié)果顯示，YAP1的表達下調(diào)后，caspase-3和9未見明顯變化，但BAX蛋白表達上調(diào)，BAX上調(diào)可促進細胞凋亡發(fā)生，見圖4.胚胎植入相關(guān)重要信號通路關(guān)鍵蛋白中除MEK1/2未見明顯變化，其余IRS1、PI3K和Akt均表達異常，IRS1上調(diào)表達，PI3K和Akt下調(diào)表達，見圖5.這表明YAP1可能通過調(diào)控凋亡及胚胎植入相關(guān)重要信號通路影響JAR細胞的增殖、遷移和侵襲.

圖4 下調(diào)YAP1表達對凋亡相關(guān)蛋白的影響

圖5 下調(diào)YAP1表達對胚胎植入相關(guān)重要信號通路關(guān)鍵蛋白的影響

3 討論

稽留流產(chǎn)的病因錯綜復雜，目前認為主要與母體、胎盤、胎兒和遺傳因素相關(guān)[11]，其中，滋養(yǎng)細胞功能受損導致的胎盤發(fā)育和功能不良發(fā)揮重要作用[12].細胞凋亡是機體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、由基因編碼的細胞主動死亡過程[13]，幾乎發(fā)生在所有的血管內(nèi)壁細胞.絨毛組織血管腔的形成和穩(wěn)定需要適度的滋養(yǎng)細胞凋亡，當細胞“增殖-凋亡”的動態(tài)平衡被打破時，會引起胎盤發(fā)育不良和母胎循環(huán)障礙，從而影響妊娠結(jié)局.

YAP1是一種抗凋亡蛋白，在子癇前期的胎盤中低表達，參與滋養(yǎng)層細胞的增殖和凋亡[14].穿梭于細胞質(zhì)與細胞核之間，在缺氧等不利條件下，會被上游磷酸化，阻滯于細胞質(zhì)中，抑制增殖相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄[15].有研究[16]指出，YAP磷酸化就像胎盤發(fā)育的“剎車”，會隨著孕周的增加而升高，但過高的磷酸化水平會限制YAP向細胞核的移動，影響下游基因的轉(zhuǎn)錄，導致滋養(yǎng)細胞功能障礙，從而引起胎兒生長受限等病理妊娠.但是，目前國內(nèi)外有關(guān)YAP1表達對凋亡、及滋養(yǎng)細胞生物學行為的調(diào)控機制與稽留流產(chǎn)發(fā)病相關(guān)性的研究報道較少.

Wang等研究[16]指出，YAP蛋白異常表達會削弱滋養(yǎng)細胞的侵襲和遷移能力，影響胎盤功能從而引起胎兒生長.Liu等[17]通過檢測重度子癇前期胎盤中YAP1的表達水平，發(fā)現(xiàn)明顯減少，且過表達YAP1會明顯增強滋養(yǎng)細胞的侵襲能力，證明Hippo-YAP1信號通路可能在重度子癇前期中通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞的侵襲和增殖能力發(fā)揮致病作用.有研究[18,19]指出，YAP和PI3K通路的級聯(lián)反應在滋養(yǎng)細胞增殖與凋亡中相互影響、共同調(diào)節(jié)，進而影響妊娠早期的胚胎植入過程.王細先等[20]研究發(fā)現(xiàn)，BAX表達水平高易引發(fā)妊娠胎盤組織的異常凋亡, 導致絨毛功能障礙和蛻膜變性壞死，參與稽留流產(chǎn)的發(fā)生.

本文實驗結(jié)果顯示，YAP1下調(diào)表達顯著抑制了JAR細胞的增殖、體外遷移和侵襲能力，結(jié)果與其他學者的研究結(jié)果一致.同時，檢測到Y(jié)AP1下調(diào)表達的JAR細胞中促凋亡蛋白的表達明顯上調(diào)，胚胎植入相關(guān)重要信號通路關(guān)鍵蛋白表達下調(diào)，這與本文前期實驗中YAP1下調(diào)表達后JAR細胞的生物學行為受到顯著抑制具有一致性與延續(xù)性.

但在臨床樣本中卻檢測到稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中YAP1蛋白和YAP1-mRNA的表達水平明顯高于正常早孕.通過查看其他學者的研究[16]，了解到過高的磷酸化水平會限制YAP1向細胞核的移動，影響下游基因的轉(zhuǎn)錄，也會導致滋養(yǎng)細胞功能障礙，引起胎兒生長受限等病理妊娠的發(fā)生.

綜上所述，本研究從細胞水平闡明YAP1參與稽留流產(chǎn)發(fā)病機制的一個可能的分子機制，即YAP1蛋白異常表達，無論是異常上調(diào)，還是異常下調(diào)，都會導致滋養(yǎng)細胞凋亡失調(diào)，損害該細胞侵襲與遷移能力，影響子宮螺旋動脈的重塑和胚胎植入，參與稽留流產(chǎn)發(fā)生.

但是，稽留流產(chǎn)發(fā)病的具體機制是復雜的，還需要進一步的研究.本研究未進行過表達實驗和動物模型實驗驗證，在后續(xù)研究中有必要補充豐富.隨著越來越多學者對胎盤中相關(guān)蛋白不斷的深入研究，稽留流產(chǎn)相關(guān)發(fā)病機制也會越來越明朗，這將為臨床工作的早期診斷和預防提供新的理論依據(jù).