張良志 唐顯江 任世恩 趙雅琪 張堰銘*

(1 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，中國(guó)科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810001)(2 青海省動(dòng)物生態(tài)基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，西寧810001)(3 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

室內(nèi)飼養(yǎng)是野生動(dòng)物實(shí)驗(yàn)化和疾病模型創(chuàng)建最基本的技術(shù)手段(邵義祥，2003)。然而，當(dāng)野生動(dòng)物帶入室內(nèi)后，由于生活空間、食物條件以及社群關(guān)系等發(fā)生一系列的變化(鄭強(qiáng)和林永紅，1996)，進(jìn)而導(dǎo)致其內(nèi)分泌失調(diào)(Chalifouxet al.,1982)、肥胖(Neumanet al.,2015)、免疫水平下降(Martinet al.,2011) 以及不孕不育等疾病(Crean and Senior,2019)。已有研究表明，圈養(yǎng)可引起大熊貓(Ailuropoda melanoleuca) 腸道菌群多樣性顯著降低(Guoet al.,2019)；與野生相比，動(dòng)物園飼養(yǎng)的白唇鹿(Przewalskium albirostris) 腸道菌群中擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)豐度顯著增加，而厚壁菌門(mén)(Firmicutes) 豐度則顯著降低(Liet al.,2022)；在冬季，動(dòng)物園飼養(yǎng)的藏野驢(Equus kiang) 腸道菌群中厚壁菌門(mén)豐度較野外種群顯著增加，而擬桿菌門(mén)豐度顯著降低(Gaoet al.,2019)。室內(nèi)飼養(yǎng)還可導(dǎo)致穿山甲(Manis pentadactyla) 抗性基因豐度及多樣性顯著增加(Liuet al.,2021)。然而，迄今為止，有關(guān)室內(nèi)飼養(yǎng)或圈養(yǎng)對(duì)腸道微生物群落構(gòu)建過(guò)程的研究基本沒(méi)有涉及。

過(guò)去十余年，微生物群落多樣性、穩(wěn)定性以及構(gòu)建過(guò)程一直是國(guó)際生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)(Hutchinson,1959;Zhou and Ning,2017)。探討群落構(gòu)建可增進(jìn)對(duì)生物多樣性維持機(jī)制(Weiheret al.,2011)、群落演替(Drake,1990)、種群恢復(fù)(Keddy,1999)、物種入侵(Pearsonet al.,2018)以及有害生物防治等方面的理解(Martínez-Salinaset al.,2016)，為野生動(dòng)物資源利用和環(huán)境保護(hù)提供必要的基礎(chǔ)理論。依據(jù)物種共存關(guān)系和多樣性形成機(jī)制，生態(tài)學(xué)家先后提出中性理論和生態(tài)位理論以解釋群落的構(gòu)建過(guò)程(Hubbell,2001;Chave,2004;Volkovet al.,2004)。中性理論假設(shè)所有物種的生態(tài)功能是均等的，物種豐度的變異主要受到出生、拓殖、死亡、滅絕以及分化等影響，被稱為隨機(jī)過(guò)程 (MacArthur and Wilson,1967;Hubbell,2001;Chave,2004;Etienne and Olff,2004)。與此對(duì)應(yīng)，生態(tài)位理論則強(qiáng)調(diào)環(huán)境因子(溫度、pH 值、濕度等)和生物因子(物種特性、種間互作等)是控制群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素，也被稱作確定性過(guò)程(Peter,2000)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，隨機(jī)過(guò)程和確定性過(guò)程可同時(shí)對(duì)群落的構(gòu)建產(chǎn)生作用，并在不同的環(huán)境和宿主條件下表現(xiàn)出一定的主次關(guān)系(Chase,2010;Ofi?eruet al.,2010;Stegenet al.,2016)。

高原鼠兔(Ochotona curzoniae) 是青藏高原分布最廣、種群數(shù)量最多的物種，也是高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵物種(Smithet al.,2019)。高原鼠兔低氧性肺血管收縮反應(yīng)鈍化，無(wú)右心室肥大，是最理想的高山生理學(xué)和高原疾病研究模型(賀爭(zhēng)鳴，2010)。此外，一些高原鼠兔對(duì)嗎啡極不敏感，對(duì)某些寄生線蟲(chóng)極易感染，這些特征使其作為神經(jīng)系統(tǒng)藥物活性研究和感染病因研究的模型被廣泛應(yīng)用于高原醫(yī)學(xué)、低氧生理和抗逆適應(yīng)等研究。然而，由于高原鼠兔在室內(nèi)不能正常繁殖，極大地限制了疾病模型的創(chuàng)制和低氧適應(yīng)研究。

高原鼠兔野生種群腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能的研究已有較多的報(bào)道，通過(guò)測(cè)定其季節(jié)性特征，確定了該動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能依植被的營(yíng)養(yǎng)特征而改變(Fanet al.,2022)；隨海拔梯度的增加，腸道菌群的構(gòu)建由隨機(jī)性向確定性轉(zhuǎn)變(Yuet al.,2022)，血液及體表寄生蟲(chóng)的細(xì)菌群落也有不同的構(gòu)建方式(Liet al.,2018)。然而，高原鼠兔繁殖季節(jié)及非繁殖季節(jié)群落構(gòu)建過(guò)程有怎樣的差異，室內(nèi)飼養(yǎng)是否導(dǎo)致腸道菌群構(gòu)建過(guò)程發(fā)生明顯的改變以及與室內(nèi)繁殖病理的關(guān)系等均沒(méi)有得到詳細(xì)的闡述。

本研究以高原鼠兔為模型動(dòng)物，采集不同生理階段的目標(biāo)動(dòng)物和室內(nèi)飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)處理，通過(guò)16S rRNA 基因測(cè)序和分析技術(shù)，使用中性模型擬合群落構(gòu)建過(guò)程，回答以下問(wèn)題：(1)高原鼠兔繁殖季節(jié)與非繁殖季節(jié)腸道菌群在結(jié)構(gòu)和功能等方面是否存在差異？(2)室內(nèi)飼養(yǎng)是否導(dǎo)致高原鼠兔腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生重大改變，群落的構(gòu)建過(guò)程是否也產(chǎn)生相應(yīng)的變化？以此，為探索高原鼠兔室內(nèi)繁殖病理及野生動(dòng)物實(shí)驗(yàn)化提供必要的理論基礎(chǔ)。

1 研究方法

1.1 糞便樣品采集

本研究采樣地點(diǎn)為青海省海北藏族自治州剛察縣熱水鎮(zhèn)(海拔：3 650 m；北緯37°09′03″，東經(jīng)100°28′40″)。樣地植被為典型高寒草甸，屬高原大陸性氣候，年平均氣溫2℃；四季放牧，全年無(wú)休牧期。

采樣時(shí)間：非繁殖季節(jié)，2019 年1 月，冬季(1月，n=15)。采用繩套法，無(wú)損傷捕捉高原鼠兔雄性成體(體重120～150 g)，捕獲個(gè)體放置于清洗干凈并用75% 酒精消毒的聚乙烯飼養(yǎng)盒中。待其自行排便后，戴一次性PE 手套將新鮮糞便顆粒裝入2 mL 凍存管中(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)，放入液氮帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存于DWHL398 型超低溫冰箱內(nèi)(美菱，合肥，中國(guó))。糞便采集完成后，將高原鼠兔帶回西寧飼養(yǎng)，自由取食飲水，自然光照，飼料為兔顆粒飼料(北京科奧協(xié)力飼料有限公司)。飼養(yǎng)至4 月，采集糞便樣品并保存。繁殖季節(jié)，2019 年4 月，在原采樣地，再次采集野外高原鼠兔糞便樣品，放入液氮后帶回西寧，超低溫冰箱保存。所有的實(shí)驗(yàn)程序均按照中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》(2017年修訂)執(zhí)行。

1.2 DNA提取測(cè)序和16S rRNA數(shù)據(jù)處理

使用E.Z.N.A.?soil DNA kit(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)試劑盒進(jìn)行糞便微生物群落總DNA 提取，提取完成后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量，使用NanoDrop2000 測(cè)定DNA 的濃度和純度。使用引物338F (5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 和806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’) 對(duì)16S rRNA 的V3～ V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性3 min，27 個(gè)循環(huán)(95℃，變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s)，然后72℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4℃進(jìn)行保存；PCR 反應(yīng)體系：5 × Trans Start Fast Pfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上下游引物(5 μmol/L) 各0.8 μL，Trans Start Fast Pfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA10 ng，ddH2O補(bǔ)足至20 mL，每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)。

將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后，使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，使用Axy Prep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences,Union City,CA,USA) 進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，并用Quantus?Fluorometer (Promega,USA) 對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行定量。使用NEXTflex? Rapid DNA-Seq Kit 進(jìn)行建庫(kù)：(1)接頭鏈接；(2) 使用磁珠篩選去除接頭自連片段；(3) 利用PCR 擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集；(4) 磁珠回收PCR 產(chǎn)物得到最終文庫(kù)。使用Illumina公司的Miseq PE300 平臺(tái)測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用fastp (https://github.com/OpenGene/fastp,version 0.20.0) 軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控(Chenet al.,2018)，使用FLASH (http://www.cbcb.umd.edu/software/flas,version 1.2.7) (Mago? and Salzberg,2011) 軟件進(jìn)行拼接：(1) 過(guò)濾reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基，過(guò)濾質(zhì)控后50 bp以下的reads，去除含N 堿基的reads；(2)根據(jù)PE reads之間的overlap 關(guān)系，將成對(duì)reads 拼接成一條序列，最小overlap 長(zhǎng)度為10 bp；(3) 拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.2，篩選不符合序列；(4)根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向。

使用UPARSE 軟件(http://drive5.com/uparse/，version 7.1)，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類并剔除嵌合體(Edgar,2013)。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/,version 2.2)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)(v138)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%(McDonaldet al.,2012)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

腸道菌群alpha 多樣性指數(shù)的組間差異、主坐標(biāo)分析、置換多元方差分析均使用R中的“vegan”軟件包來(lái)完成。菌群組間差異分析使用LEfSe多級(jí)物種差異判別分析(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root? tool_id=lefse_upload)；使 用PICRUSt 功能預(yù)測(cè)軟件對(duì)擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果進(jìn)行功能預(yù)測(cè)(Langilleet al.,2013)。預(yù)測(cè)的功能通路相對(duì)豐度使用STAMP軟件進(jìn)行組間差異分析。

1.5 菌群構(gòu)建過(guò)程分析

采用Sloan 中性模型評(píng)估野外及室內(nèi)飼養(yǎng)條件下高原鼠兔腸道菌群構(gòu)建的重要性(Sloanet al.,2006)。模型預(yù)測(cè)集合群落(Metacommunity) 中豐度較高的物種主要通過(guò)隨機(jī)擴(kuò)散方式在不同群落中定殖，豐度較低的物種則因隨機(jī)漂變而走向滅絕。在特定分組中分析OTUs 在一個(gè)樣本中(一個(gè)個(gè)體的腸道菌群) 出現(xiàn)的頻次和其在集合群落(組中所有個(gè)體)中的平均豐度與模型的擬合優(yōu)度。根據(jù)OTUs 是否偏離中性模型預(yù)測(cè)的95%置信區(qū)間，將一個(gè)分組中所有OTUs 劃分為3 個(gè)部分：高于中性[發(fā)生的頻率和(或) 比中性模型預(yù)測(cè)的更多]，低于中性[發(fā)生的頻率和(或) 比預(yù)測(cè)的更低]，中性(預(yù)測(cè))。模型中Nm參數(shù)是評(píng)估物種在群落間的擴(kuò)散性。N表示集合群落的大小，m表示遷移率，R2表示數(shù)據(jù)和模型的擬合優(yōu)度。

2 結(jié)果

2.1 野外和室內(nèi)高原鼠兔腸道菌群多樣性變化

經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序和數(shù)據(jù)處理后，將所有樣本序列按照最小序列進(jìn)行抽平，抽平后每個(gè)樣本共獲得66 502條高質(zhì)量序列，聚類共得到7 501個(gè)OTUs。

在繁殖季節(jié)，高原鼠兔野外和室內(nèi)飼養(yǎng)群腸道菌群alpha 多樣性存在顯著差異，且野外組顯著高于室內(nèi)飼養(yǎng)組。群落豐度指數(shù)(Sobs,Chao,Ace)和群落覆蓋度指數(shù)(Coverage) 在非繁殖季節(jié)顯著高于繁殖季節(jié)(圖1a～d)；室內(nèi)飼養(yǎng)組的群落多樣性指數(shù)(Shannon) 和均勻度指數(shù)(Shannoneven) 顯著低于野外組(圖1e、f)。

圖1 不同組間高原鼠兔腸道微生物alpha多樣性指數(shù)差異.a：Sobs指數(shù)；b：Ace指數(shù)；c：Chao指數(shù)；d：Coverage 指數(shù)；e：Shannon指數(shù)；f：Shannoneven指數(shù)Fig.1 Differences in alpha diversity of the gut microbiota among three plateau pika groups.a:Sobs index;b:Ace index;c:Chao index;d:Coverage index;e:Shannon index;f:Shannoneven index

野外和室內(nèi)飼養(yǎng)高原鼠兔腸道菌群的β多樣性也存在顯著差異。Unweighted UniFrac 聚類結(jié)果顯示，室內(nèi)飼養(yǎng)組、野外組繁殖季節(jié)和非繁殖季節(jié)高原鼠兔菌群結(jié)構(gòu)均存在顯著差異，每個(gè)組都各自聚類，但野外組之間的相對(duì)距離更近(圖2a)。Weighted UniFrac 聚類結(jié)果顯示室內(nèi)飼養(yǎng)組和野外組分別聚類，而野外組在繁殖季節(jié)和非繁殖季節(jié)則聚為一類(圖2b)，菌群結(jié)構(gòu)更相似。

圖2 不同組間高原鼠兔腸道微生物結(jié)構(gòu)變化.a：依據(jù)不加權(quán)UniFrac 距離的PCoA；b：依據(jù)加權(quán)UniFrac 距離的PCoAFig.2 The structure of the gut microbiota among different plateau pika groups.a:PCoA based on unweighted UniFrac distances;b:PCoA based on weighted UniFrac distances

2.2 野外和室內(nèi)高原鼠兔腸道菌群優(yōu)勢(shì)物種的變化

在門(mén)水平，我們選取了相對(duì)豐度排名前7位的菌群，這些菌群約占所有菌群的95%以上。室內(nèi)飼養(yǎng)高原鼠兔腸道高豐度菌群依次為：擬桿菌門(mén)(55.90%)、厚壁菌門(mén)(33.92%)、螺旋體門(mén)(Spirochaetes,3.11%)、Epsilonbacteraeota (1.88%)、p_unclassified_k_norank_d_Bacteria (1.83%)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia,1.07%)和變形菌門(mén)(Proteobacteria,0.60%) (圖3a，表1)。在野外繁殖季節(jié)，高原鼠兔腸道菌群相對(duì)豐度從高到低依次為：厚壁菌門(mén)(64.20%)、擬桿菌門(mén)(22.58%)、Epsilonbacteraeota (6.33%)、螺旋體門(mén)(2.18%)、變形菌門(mén)(1.13%)、疣微菌門(mén)(0.92%) 和unclassified_k_norank_d_Bacteria(0.57%)(圖3a，表1)。非繁殖季節(jié)，腸道高豐度菌群與繁殖季節(jié)基本一致，主要有：厚壁菌門(mén)(65.96%)、擬桿菌門(mén)(25.27%)、螺旋體門(mén)(1.98%)、疣微菌門(mén)(1.57%)、變形菌門(mén)(1.54%)、Epsilonbacteraeota (1.27%) 和unclassified_k_norank_d_Bacteria(0.67%)(圖3a，表1)。

表1 高原鼠兔腸道菌群門(mén)水平相對(duì)豐度Table 1 The percentage of the bacteria in phylum level of plateau pika

圖3 不同組間高原鼠兔腸道微生物組成分析.a：門(mén)水平組成；b：科水平組成.Fig.3 Differences in taxonomic compositions of the gut microbiota among different plateau pika groups.a:phylum level;b:family level

在科水平，室內(nèi)飼養(yǎng)高原鼠兔腸道高豐度菌群依次序：瘤胃球菌科 (Ruminococcaceae,16.56%)、Muribaculaceae (41.27%)、毛螺菌科(Lachnospiraceae,8.17%)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae,8.92%)、理研菌科 (Rikenellaceae,4.06%)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae,2.40%)、Clostridiales_vadinBB60_group (1.70%)、丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae,2.89%)、彎曲菌科(Campylobacteraceae,2.35%)、螺旋體科(Spirochaetaceae,3.11%)，約占總菌群的91.44% (圖3b，表2)。野外繁殖季節(jié)，腸道高豐度菌群依次為：瘤胃球菌科(30.21%)、Muribaculaceae (10.50%)、毛螺菌科(21.17%)、普雷沃氏菌科(5.06%)、理研菌科(5.78%)、克里斯滕森菌科(3.50%)、Clostridiales_vadinBB60_group (5.18%)、丹毒絲菌科(2.78%)、彎曲菌科(5.72%)、螺旋體科(2.18%)，占比約為92.09% (圖3b，表2)；非繁殖季節(jié)，則依次為：瘤胃球菌科(35.09%)、Muribaculaceae(8.90%)、毛螺菌科(19.25%)、普雷沃氏菌科(10.23%)、理研菌科(5.04%)、克里斯滕森菌科(4.27%)、Clostridiales_vadinBB60_group (3.15%)、丹毒絲菌科(2.64%)、彎曲菌科(1.13%)、螺旋體科(1.97%)，占比為91.67%(圖3b，表2)。

表2 高原鼠兔腸道菌群科水平相對(duì)豐度Table 2 The percentage of the bacteria in family level of plateau pika

2.3 野外和室內(nèi)高原鼠兔腸道菌群的組間差異

門(mén)水平上，在繁殖季節(jié)，高原鼠兔室內(nèi)飼養(yǎng)組與野外組比較結(jié)果顯示：擬桿菌門(mén)在室內(nèi)飼養(yǎng)組顯著富集，而厚壁菌門(mén)、Epsilonbacteraeota、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)、迷蹤菌門(mén)(Elusimicrobia)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、軟壁菌門(mén)(Tenericutes)、髕骨細(xì)菌門(mén)(Patescibacteria)在野外組顯著富集(圖4a)；室內(nèi)飼養(yǎng)組與野外非繁殖季節(jié)比較結(jié)果顯示：擬桿菌門(mén)在室內(nèi)飼養(yǎng)組顯著富集，而厚壁菌門(mén)、棒狀桿菌門(mén)(Rokubacteria)、裝甲菌門(mén)(Armatimonadetes)、浮霉菌門(mén)、變形菌門(mén)和硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirae)在野外顯著富集(圖4b)；野外繁殖季節(jié)與非繁殖季節(jié)比較結(jié)果顯示：Epsilonbacteraeota和軟壁菌門(mén)在繁殖季節(jié)顯著富集(圖4c)。

科水平上，在繁殖季節(jié)，高原鼠兔室內(nèi)飼養(yǎng)組與野外組比較結(jié)果顯示：Muribaculaceae、普雷沃氏菌科和葡萄球菌科(Staphylococcaceae)在室內(nèi)飼養(yǎng)組顯著富集，而瘤胃球菌科、毛螺菌科、Clostridiales_vadinBB60_group、彎曲菌科、norank_o_norank_c_KD4-96、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)、Gaiellaceae 和假諾卡氏科(Pseudonocardiaceae) 在野外組顯著富集(圖4d)；室內(nèi)飼養(yǎng)組與野外非繁殖季節(jié)比較結(jié)果顯示：Muribaculaceae 在室內(nèi)飼養(yǎng)組顯著富集，而瘤胃球菌科、毛螺菌科、克里斯滕森菌科和Clostridiales_vadinBB60_group 在野外組顯著富集(圖4e)；野外繁殖季節(jié)與非繁殖季節(jié)比較結(jié)果顯示：彎曲菌科和Clostridiales_vadin-BB60_group 在繁殖季節(jié)顯著富集，而瘤胃球菌科、普雷沃氏菌科和阿克曼氏菌科(Akkermansiaceae)在非繁殖季節(jié)顯著富集(圖4f)。

圖4 不同組間高原鼠兔腸道微生物相對(duì)豐度的差異.a,b,c：門(mén)水平的組間兩兩比較；d,e,f：科水平組間兩兩比較(LEfSe,LDA ＞4,P ＜0.05)Fig.4 Taxonomic alterations of the gut microbiota in different plateau pika groups.Pairwise comparisons of Cap_Apr vs. Wild_Apr;Cap_Apr vs.Wild_Jan;Wild_Apr vs.Wild_Jan in phylum level (a,b,c) and in family level (d,e,f) by the linear discriminant analysis effect size (LEfSe)method(LDA ＞4,P ＜0.05)

2.4 野外和室內(nèi)高原鼠兔腸道菌群功能差異

本研究采用PICRUSt 軟件對(duì)菌群功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，并通過(guò)STAMP 軟件分析了組間功能差異。結(jié)果顯示在KEEG Level 3 水平上，在繁殖季節(jié)，室內(nèi)飼養(yǎng)組與野外組存在顯著差異的通路有細(xì)胞通訊(Cell communication) 和心血管疾病(Cardiovascular disease)(圖5a)；室內(nèi)飼養(yǎng)組與野外非繁殖季節(jié)有顯著差異的通路有氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、核酸 代 謝(Nucleotide metabolism)、脂質(zhì)代謝(Lipid metabolism) 和細(xì)胞移動(dòng)(Cell motility)等(圖5b)；野外繁殖季節(jié)和非繁殖季節(jié)的差異代謝通路有氨基酸代謝、碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)(Membrane transport)和脂質(zhì)代謝等(圖5c)。

圖5 不同組間高原鼠兔腸道微生物菌群功能差異分析.Level 3 水平的KEEG 分析，a：Cap_Apr 和Wild_Apr 比較結(jié)果；b：Cap_Apr 和Wild_Jan 比較結(jié)果；c：Wild_Apr 和Wild_Jan比較結(jié)果,使用welch t-test檢驗(yàn)Fig.5 Functional variations of the gut microbiota in different plateau pika groups.Level 3 KEGG pathways were differentially represented between the Cap_Apr vs. Wild_Apr(a),Cap_Apr vs. Wild_Jan(b),Wild_Apr vs. Wild_Jan(c).Differences were assessed by the Welch t-test and are denoted as the corrected P-value

2.5 野外和室內(nèi)高原鼠兔腸道菌群構(gòu)建過(guò)程

使用中性模型來(lái)評(píng)估室內(nèi)和野外高原鼠兔腸道菌群構(gòu)建的隨機(jī)和確定性過(guò)程。經(jīng)計(jì)算，室內(nèi)飼養(yǎng)組R2值為0.496 (圖6a)，野外繁殖季節(jié)為0.737 (圖6b)，非繁殖季節(jié)達(dá)到0.803 (圖6c)。高原鼠兔室內(nèi)飼養(yǎng)組Nm值顯著低于野外組，而野外組繁殖季節(jié)的Nm值顯著低于非繁殖季節(jié)，說(shuō)明非繁殖季節(jié)高原鼠兔腸道菌群存在高度擴(kuò)散性。這些結(jié)果說(shuō)明野外高原鼠兔腸道菌群群落構(gòu)建主要是隨機(jī)性過(guò)程，而室內(nèi)則是確定性過(guò)程。

圖6 不同組間高原鼠兔腸道微生物菌群構(gòu)建過(guò)程分析.a：Cap_Apr；b：Wild_Apr；c：Wild_JanFig.6 Assembly process of microbiota communities in different groups of plateau pikas.Predicted occurrence frequencies for Cap_Apr (a),Wild_Apr(b)and Wild_Jan(c)

3 討論

3.1 野外和室內(nèi)高原鼠兔腸道菌群多樣性變化

本研究發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)飼養(yǎng)導(dǎo)致高原鼠兔腸道菌群多樣性顯著降低(圖1)。已有研究結(jié)果表明，室內(nèi)飼養(yǎng)或圈養(yǎng)兩棲動(dòng)物(Tanget al.,2020)、鳥(niǎo)類(Wienemannet al.,2011)、哺乳動(dòng)物(Kohlet al.,2014)和靈長(zhǎng)類(Claytonet al.,2016)的腸道微生物群落多樣性均顯著降低。有學(xué)者認(rèn)為，這些變化可能與食物條件、活動(dòng)空間以及社群關(guān)系變化存在密切關(guān)系(Redfordet al.,2012)。研究表明，哺乳動(dòng)物腸道菌群會(huì)隨食物來(lái)源不同而發(fā)生改變(Leyet al.,2008)，靈長(zhǎng)類動(dòng)物在圈養(yǎng)條件下腸道菌群發(fā)生了類人化現(xiàn)象(humanizes)(Claytonet al.,2016)。高蛋白、高脂肪食物不僅能引起人類腸道菌群多樣性的降低，同時(shí)也是諸如魚(yú)類、鳥(niǎo)類及植食性哺乳動(dòng)物腸道菌群多樣性丟失最重要的原因。本研究為高原鼠兔提供了兔顆粒飼料，其蛋白和脂肪含量顯著高于野外覓食獲取的食物，這可能是室內(nèi)飼養(yǎng)引起高原鼠兔腸道菌群alpha 多樣性顯著降低最重要的原因之一。其次，室內(nèi)飼養(yǎng)極大地限制了動(dòng)物的活動(dòng)范圍，減少了與外界環(huán)境的接觸。高原鼠兔具有典型的食糞行為，通過(guò)覓食同類或其它物種的糞便能夠增加菌群的水平傳播(Speakmanet al.,2021;Fuet al.,2021)。室內(nèi)飼養(yǎng)切斷了物種間菌群傳播途徑，因此導(dǎo)致菌群多樣性顯著降低。再次，環(huán)境溫度也是影響腸道菌群多樣性的因素之一。蜥蜴腸道微生物研究表明，隨著環(huán)境溫度的升高，菌群alpha 多樣性減少(Chunbinget al.,2021)，而冷暴露能夠增加腸道微生物群落的alpha 多樣性(Khakisahnehet al.,2020)。盡管本研究沒(méi)有對(duì)室內(nèi)飼養(yǎng)環(huán)境采用加熱處理，但西寧地區(qū)的海拔明顯低于海北州采樣地區(qū)，且平均溫度也高于海北州。因此，本研究室內(nèi)飼養(yǎng)高原鼠兔alpha 多樣性顯著低于野外的結(jié)果也可能與飼養(yǎng)環(huán)境溫度較高有關(guān)。

有研究表明，食物短缺或宿主生理狀況變化會(huì)降低腸道微生物群的β 多樣性(Xiaoet al.,2019)。從PCoA 圖中可以看出，高原鼠兔室內(nèi)飼養(yǎng)和野外的菌群結(jié)構(gòu)也發(fā)生了顯著變化。室內(nèi)飼養(yǎng)與野外環(huán)境條件差異極其明顯，因而導(dǎo)致室內(nèi)與野外樣本間的距離最遠(yuǎn)。在室外，1 月高原鼠兔處于繁殖休眠期，而4月正值動(dòng)情交配高峰期，這種繁殖生理的差異也使兩個(gè)野外群體出現(xiàn)了明顯的分離。

3.2 野外和室內(nèi)高原鼠兔腸道核心菌群的變化

有學(xué)者認(rèn)為，食物條件是改變哺乳動(dòng)物腸道微生物核心菌群相對(duì)豐度的最重要的因素(Leyet al.,2008)。Clayton 等(2016)發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門(mén)的變化通常與食物中多糖含量有關(guān)。擬桿菌(Bacteroides)對(duì)食物營(yíng)養(yǎng)成分具有極其敏感的反應(yīng)，并能夠降解多糖和增加醋酸鹽(Kauet al.,2011)。本研究中，室內(nèi)飼養(yǎng)高原鼠兔腸道擬桿菌顯著增加可能與Muribaculaceae 有關(guān)。在提供的飼料中，無(wú)氮浸出物(主要是碳水化合物，包括淀粉和單糖) 的含量約為52.8% (表3)。高豐度的Muribaculaceae 可以幫助室內(nèi)高原鼠兔更好地降解食物中的多糖。厚壁菌門(mén)、毛螺菌科、Ruminocococaceae、普雷沃氏菌科和Clostridiales_vadinBB60_group 是大多數(shù)草食動(dòng)物腸道微生物群落中最主要的成分，對(duì)纖維素和木質(zhì)素等纖維的發(fā)酵和降解至關(guān)重要(Penget al.,2021;Tettet al.,2021)。這類菌群的相對(duì)豐度在高原鼠兔野外種群中占有較高的比例，且與植被纖維含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。此外，有研究發(fā)現(xiàn)Firmicute 與食物消化效率和能量吸收密切相關(guān)(Turnbaughet al.,2006)。1月食物最匱乏，高原鼠兔腸道厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度最高，說(shuō)明高原鼠兔在適應(yīng)極端環(huán)境過(guò)程中腸道菌群也發(fā)生了協(xié)同變化。

表3 飼養(yǎng)高原鼠兔飼料成分表Table 3 The content of the artificial diets of captive plateau pikas

3.3 野外和室內(nèi)高原鼠兔腸道菌群功能的變化

本研究功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，野外高原鼠兔繁殖季節(jié)和非繁殖季節(jié)功能差異較大，而室內(nèi)飼養(yǎng)組與野外組之間差異較小，可能與菌群的功能冗余有關(guān)。菌群功能冗余是保證菌群穩(wěn)定性的必要條件，能夠使菌群對(duì)外界環(huán)境產(chǎn)生一定的抵抗力和恢復(fù)力(Yachi and Loreau,1999;B?ckhedet al.,2005)。有關(guān)人類的研究表明，腸道微生物功能高度冗余，功能穩(wěn)態(tài)獨(dú)立于微生物組成(Tyakhtet al.,2013)。高原鼠兔碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝及酶家族等代謝通路的豐度在非繁殖季節(jié)顯著高于繁殖季節(jié)。1 月食物最匱乏，環(huán)境溫度也最低，因此，高原鼠兔腸道菌群必須增加纖維素、蛋白質(zhì)的降解，使宿主提高食物的利用效率和能量吸收率，以增加產(chǎn)熱和維持生存。此外，宿主的生理狀態(tài)也可能對(duì)菌群的功能產(chǎn)生重要影響。隨著高原鼠兔從繁殖休眠期進(jìn)入交配期，高原鼠兔腸道在菌群結(jié)構(gòu)變化的基礎(chǔ)上，其功能通路也發(fā)生了明顯的改變，以匹配宿主生理特征變化。

3.4 野外和室內(nèi)高原鼠兔腸道菌群組裝過(guò)程的變化

中性模型擬合結(jié)果表明，室內(nèi)飼養(yǎng)明顯降低了隨機(jī)過(guò)程在高原鼠兔腸道菌群組裝過(guò)程中的重要性。我們的結(jié)果與白唇鹿腸道菌群的研究一致(Liet al.,2022)。室內(nèi)飼養(yǎng)降低隨機(jī)性對(duì)宿主腸道菌群構(gòu)建過(guò)程中的重要性主要源于兩方面原因：(1)動(dòng)物腸道菌群可通過(guò)接觸及食糞行為在個(gè)體間互相傳遞(Chiyoet al.,2014;Craft,2015;Milleret al.,2018;Boet al.,2020)。室內(nèi)飼養(yǎng)減少了個(gè)體間的直接接觸，降低了菌群在個(gè)體間的相互傳遞，因而降低了隨機(jī)擴(kuò)散(中性過(guò)程) 在群落構(gòu)建過(guò)程中的重要性(Moelleret al.,2017)；(2)室內(nèi)主要采用單一飼料喂養(yǎng)，其食物的多樣性以及食物中的纖維含量顯著降低(表3)。膳食纖維是腸道菌群的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于腸道菌群的定殖并促進(jìn)菌群的多樣性(Tanget al.,2021)。優(yōu)質(zhì)的棲息環(huán)境，如營(yíng)養(yǎng)豐富，有利于物種的定殖，增加物種在不同群落中擴(kuò)散成功率，提高隨機(jī)過(guò)程在群落組裝過(guò)程中的重要性。該觀點(diǎn)在豬腸道及水體微生物研究中得到證實(shí)(Pontarp and Petchey,2016;Tanget al.,2021)。對(duì)魚(yú)類(Yanet al.,2016) 和蝦(Holtet al.,2019)腸道菌群構(gòu)建的研究表明，宿主的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段，即宿主生理特征的變化，顯著影響確定性過(guò)程在菌群構(gòu)建過(guò)程中的重要性。高原鼠兔4 月開(kāi)始進(jìn)入繁殖季節(jié)，至8 月結(jié)束(Li and Sun,1998)。相對(duì)于非繁殖季節(jié)，其生理特征及性激素水平均發(fā)生顯著變化(Li and Sun,1998；謝惠春等，2017)。由此可推斷，高原鼠兔生理特征的變化也是引起腸道菌群構(gòu)建方式改變的重要因子。

本研究證明室內(nèi)飼養(yǎng)和宿主生理狀況均可以影響和塑造高原鼠兔腸道菌群的組成和構(gòu)建過(guò)程。由于食物的類人化和單一化以及活動(dòng)空間的限制性，室內(nèi)飼養(yǎng)顯著降低了高原鼠兔腸道菌群的多樣性，造成菌群功能丟失，構(gòu)建過(guò)程由隨機(jī)性向確定性轉(zhuǎn)變；宿主繁殖狀態(tài)也會(huì)對(duì)腸道菌群的組成及群落構(gòu)建產(chǎn)生影響，非繁殖季節(jié)腸道菌群存在高度的擴(kuò)散性。為探索高原鼠兔室內(nèi)繁殖成功提供了新的理論基礎(chǔ)。