艾尼瓦爾·艾木都拉，張?bào)K馳，張瑞麗，阿不來提·買買提明

1 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，烏魯木齊 830054；2 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿中心

腎癌是人類泌尿系統(tǒng)最具侵襲性的惡性腫瘤之一，其中以腎細(xì)胞癌（RCC）最為常見，約占所有腎癌的85%［1］。研究顯示，約33%的RCC 患者在初診時(shí)就發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移病灶，最終發(fā)展為轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌（mRCC）［2］。舒尼替尼是mRCC 一線治療方案，初始反應(yīng)率高達(dá)47%，但9～12 個(gè)月后往往發(fā)生耐藥和腫瘤進(jìn)展，提示對舒尼替尼獲得性耐藥［3］。目前關(guān)于mRCC 對舒尼替尼耐藥的機(jī)制仍未明確，深入了解RCC的耐藥機(jī)制有助于為mRCC患者提供更有效的治療策略。研究表明，環(huán)狀RNA（circRNA）可介導(dǎo)微小RNA（miRNA）調(diào)控靶基因信使RNA（mRNA）表達(dá)。circRNA可作為miRNA的分子海綿，與miRNA相互作用來調(diào)控信號通路相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡及調(diào)節(jié)腫瘤耐藥。但cirRNA 影響舒尼替尼耐藥的分子機(jī)制鮮有報(bào)道?？缒ax抑制劑的母體6（TMBIM6）是一種鈣離子通道樣蛋白，可降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜表面表達(dá)的鈣離子穩(wěn)態(tài)，它在許多癌癥類型中上調(diào)，參與了多種癌癥的發(fā)生，而TMBIM6 在腎RCC 中表達(dá)和對舒尼替尼耐藥性的影響尚無相關(guān)研究。本研究通過體外試驗(yàn)觀察circTMBIM6 在舒尼替尼耐藥RCC 細(xì)胞中的表達(dá)，并通過生物信息學(xué)預(yù)測和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)circTMBIM6 調(diào)控的 miRNA 和 mRNA，探討 circTMBIM6在RCC細(xì)胞舒尼替尼耐藥性的作用機(jī)制，以期為RCC的靶向治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎透明細(xì)胞癌A498、Caci-1、780-O細(xì)胞株購于中科院上海細(xì)胞庫。舒尼替尼購于大連美侖生物技術(shù)有限公司。DMEM 培養(yǎng)基、PBS、胎牛血清購于以色列BioInd 公司，0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA購于美國Biosharp公司，蛋白定量試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，抗體均購自英國Abcam 公司，ECL 顯影液購自美國 Biosharp 公司，CCK-8 試劑盒購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。RNA 提取試劑盒購自超研生物科技有限公司（上海）；Lipofectamine 2000 購于美國 Invitrogen 公司，雙熒光素酶檢測報(bào)告系統(tǒng)試劑盒、miR-19a-3p mimics 及陰性對照購于美國Promega 公司。野生型和突變型的circTMBIM6 的3′UTR、PPARα mRNA 的3′UTR 雙熒光報(bào)告質(zhì)粒購自上?；蚬煞萦邢薰尽Ｄz成像儀購自美國Bio-Rad 公司。酶標(biāo)儀購于美國Thermo。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)

1.2.1 正常RCC 細(xì)胞的培養(yǎng) 取A498、Caci-1、780-O細(xì)胞，加入含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素 100 μg/mL 的 DMEM 培養(yǎng)液，置于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每48 h 更換培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到90%時(shí)，0.25%胰酶消化后傳代，取3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 舒尼替尼耐藥細(xì)胞RCC 的培養(yǎng) 取A498、Caci-1、780-O 細(xì)胞，加入含10%胎牛血清、1%青霉素—鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液，加入終濃度為2.5μmol/L 的舒尼替尼，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，開始耐藥篩選。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，待細(xì)胞生長至覆蓋瓶底約90%左右時(shí)，按1∶2進(jìn)行傳代并凍存細(xì)胞備用。采用低濃度梯度法，分別以2.5、7.5、12.5、20.0 μmol/L 舒尼替尼培養(yǎng)細(xì)胞。在同一藥物濃度作用細(xì)胞大約傳代15 代左右穩(wěn)定后增加藥物濃度，最終建立舒尼替尼耐藥細(xì)胞A498/S、Caci-1/S、780-O/S。

1.3 舒尼替尼耐藥和正常RCC細(xì)胞circTMBIM6表達(dá)檢測 采用qRT-PCR法。使用TRIzol試劑分別提取三種耐藥細(xì)胞和正常RCC細(xì)胞中的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green PCR 試劑盒 CFX ConnectTMreal-time PCR 檢測系統(tǒng)上進(jìn)行qPCR。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用兩步法PCR 擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序。qPCR 引物及內(nèi)參照U6逆轉(zhuǎn)錄引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：上游 5′-TGTGAAGACAAAGGTGTTTTTGA-3′，下游：5′-TCAATATCAGGGAGCCCAAG-3′。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 A498、Caci-1、780-O 細(xì)胞 PPARα 蛋白檢測采用 Western blotting 法。取 A498、Caci-1、780-O 細(xì)胞，加入RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取40 μg 總蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶封閉2 h。洗膜3 次，加入PPARα 及 GAPDH 一抗，4 ℃孵育過夜。洗膜 3 次，加入二抗室溫孵育2 h，洗膜3 次。ECL 化學(xué)發(fā)光顯像。采用Image J 圖像分析軟件，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算PPARα與內(nèi)參蛋白灰度值的比值，獲得PPARα蛋白相對表達(dá)量。

1.5 circTMBIM6 靶 向 miRNA 和 RNA 的 預(yù) 測 及驗(yàn)證

1.5.1 miR-19a-3p 與 circTMBIM6、PPARα mRNA靶向關(guān)系的預(yù)測 采用circRNA interactome 數(shù)據(jù)庫，預(yù)測 miR-19a-3p 與 circTMBIM6 的 3′非翻譯區(qū)（3′UTR）是否可能存在互補(bǔ)結(jié)合。采用Targetscan數(shù)據(jù)庫，預(yù)測 miR-19a-3p 與 PPARα mRNA 的 3′UTR是否存在直接結(jié)合。

1.5.2 miR-19a-3p 與 circTMBIM6、PPARα mRNA結(jié)合位點(diǎn)的驗(yàn)證 采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。以pmirGLO 為載體，構(gòu)建包含結(jié)合位點(diǎn)的野生型及突變型 circTMBIM6 3′UTR 和 PPARα mRNA 3′UTR質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染至A498、Caci-1、780-O 細(xì)胞，同時(shí)分別轉(zhuǎn)染 miR-19a-3p mimics 或 miR-NC 陰性對照，檢測雙熒光素酶報(bào)告基因活性。

1.5.3 circTMBIM6 對 miR-19a-3p 表達(dá)的調(diào)控作用觀察 將A498、Caci-1、780-O 細(xì)胞分為抑表達(dá)組與空白對照組，以Lipofectamine2000 分別轉(zhuǎn)染sicircTMBIM6、si-NC+miR-NC。采用qRT-PCR 法檢測細(xì)胞miR-19a-3p的相對表達(dá)量，檢測步驟同1.3。

1.5.4 miR-19a-3p 對 PPARα mRNA 和蛋白表達(dá)的調(diào)控作用觀察 將A498、Caci-1、780-O 細(xì)胞分為miR-19a-3p 過表達(dá)組、miR-19a-3p 抑表達(dá)組與空白對照組，以Lipofectamine 2000 分別轉(zhuǎn)染miR-19a-3p mimics、miR-19a-3p inhibitor、si-NC+miR-NC。24 h后收集各組細(xì)胞，采用qRT-PCR 法檢測細(xì)胞PPARα mRNA、Western blotting法檢測PPARα蛋白，檢測步驟同1.3。

1.5.5 circTMBIM6 通 過 miR-19a-3p 靶 向 調(diào) 控PPARα 表達(dá)的作用觀察 將A498、Caci-1、780-O 細(xì)胞分為陰性對照組、miR-19a-3p抑制組、circTMBIM6抑制組，分別轉(zhuǎn)染si-NC+miR-NC、si-NC+miR-19a-3p inhibitor、si-circTMBIM6+miR-NC、si-circTMBIM6+miR-19a-3p inhibitor。 采 用 qRT-PCR 和 Western blotting法檢測PPARα mRNA 和蛋白表達(dá)，檢測步驟同1.3。

1.6 舒尼替尼耐藥RCC 細(xì)胞中circTMBIM6 與miR-19a-3p/PPARα 軸的調(diào)控作用觀察 將A498/S、Caci-1/S、780-O/S 細(xì)胞分為陰性對照組、miR-19a-3p 抑制組、circTMBIM6 抑制組，分別轉(zhuǎn)染si-NC+miR-NC、si-NC+miR-19a-3p inhibitor、si-circTMBIM。加入100 μL CCK-8 試劑，37 ℃孵育2 h，上酶標(biāo)儀測量各孔450 nm 處的OD 值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（%）=［（OD對照孔-OD實(shí)驗(yàn)孔）/OD對照孔］×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用One-way ANOVA 法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 舒尼替尼耐藥與正常RCC細(xì)胞circTMBIM6表達(dá)比較 A498、Caci-1、780-O 細(xì)胞circTMBIM6 相對表達(dá)量分別為 1.00 ± 0.11、3.42 ± 0.32、3.64 ±0.63，A498/S、Caci-1/S、780-O/S 細(xì)胞 circTMBIM6相對表達(dá)量分別為3.64±0.71、7.91±0.80、9.47±0.78。與正常 RCC 細(xì)胞比較，A498/S、Caci-1/S、780-O/S 細(xì)胞 circTMBIM6 表達(dá)水平均升高（P均＜0.01）。

2.2 circTMBIM6 與 miR-19a-3p 和 PPARα 靶向關(guān)系的預(yù)測結(jié)果 Starbase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-19a-3p 與circTMBIM6 的 3′UTR 存在結(jié)合區(qū)域，Targetscan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測 miR-19a-3p 與 PPARα mRNA 的 3′UTR 存在潛在的結(jié)合區(qū)域。見表1、2。

表1 miR-19a-3p與circTMBIM6 3′UTR結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果

表2 miR-19a-3p與PPARα 3′UTR結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果

2.3 miR-19a-3p 與 circTMBIM6、PPARα mRNA 靶向結(jié)合的驗(yàn)證結(jié)果 miR-19a-3p mimics+circTMBIM6 WT 組熒光素酶活性低于circTMBIM6 WT+miR-NC 組（P＜0.05），miR-19a-3p mimics+circTMBIM6 MUT組與circTMBIM6 MUT+miR-NC組熒光素酶活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），說明circTMBIM6-WT 能夠與miR-19a-3p 結(jié)合，見表3。轉(zhuǎn)染miR-19a-3p mimics 可以降低野生型 PPARα mRNA 3′UTR 熒光素酶報(bào)告基因活性（P＜0.05），但對突變型PPARα mRNA 3′UTR 報(bào)告基因活性無顯著影響（P＞0.05），提示PPARα是miR-19a-3p的靶點(diǎn)，見表4。

表3 miR-19a-3p對circTMBIM6 3′UTR熒光素酶報(bào)告基因活性調(diào)控（）

表3 miR-19a-3p對circTMBIM6 3′UTR熒光素酶報(bào)告基因活性調(diào)控（）

注：與miR-NC組比較，*P＜0.05。

circTMBIM6-WT 1.02±0.28 0.44±0.48*組別miR-NC組miR-19a-3p mimics組circTMBIM6-MUT 0.97±0.28 0.88±0.14

表4 miR-19a-3p對PPARα mRNA 3′UTR熒光素酶報(bào)告基因活性調(diào)控（）

表4 miR-19a-3p對PPARα mRNA 3′UTR熒光素酶報(bào)告基因活性調(diào)控（）

注：與miR-NC組比較，*P＜0.05。

組別miR-NC組miR-19a-3p mimics PPARα-WT 1.12±0.25 0.41±0.24*PPARα-MUT 1.24±0.45 1.11±0.17

2.4 circTMBIM6 對miR-19a-3p 表達(dá)的影響 三種RCC 細(xì)胞中，circTMBIM6 抑表達(dá)組 miR-19a-3p 表達(dá)均高于空白對照組（P均＜0.05）。見表5。

表5 circTMBIM6對miR-19a-3p表達(dá)的影響（）

表5 circTMBIM6對miR-19a-3p表達(dá)的影響（）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05。

組別786-O 2.13±0.64*0.49±0.13 miR-19a-3p circTMBIM6抑表達(dá)組空白對照組A498 4.12±0.65*0.15±0.57 Caki-1 3.37±0.35*0.34±0.21

2.5 miR-19a-3p 對 RCC PPARα mRNA 及蛋白表達(dá)的影響 三種RCC 細(xì)胞中，PPARα mRNA 及蛋白水平在抑表達(dá)組＞對照組＞過表達(dá)組（P均＜0.05），見表6、7。

表6 miR-19a-3p對PPARα mRNA表達(dá)的影響（）

表6 miR-19a-3p對PPARα mRNA表達(dá)的影響（）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05。

組別PPARα mRNA miR-19a-3p抑表達(dá)組miR-19a-3p過表達(dá)組空白對照組786-O 2.13±0.64*1.12±0.25*0.49±0.13 A498 4.12±0.65*1.11±0.89*0.15±0.57*Caki-1 3.37±0.35*0.89±0.22*0.34±0.21

表7 miR-19a-3p對PPARα蛋白表達(dá)的影響（）

表7 miR-19a-3p對PPARα蛋白表達(dá)的影響（）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05。

組別PPARα蛋白miR-19a-3p抑表達(dá)組miR-19a-3p過表達(dá)組空白對照組786-O 3.13±0.44*0.42±0.22*1.23±0.11 A498 6.20±0.21*1.34±0.27*3.24±0.34 Caki-1 4.37±0.35*0.77±0.14*2.34±0.21

2.6 舒尼替尼耐藥RCC 細(xì)胞中circTMBIM6 通過miR-19a-3p 靶向調(diào)控PPARα 表達(dá) 在舒尼替尼耐藥 RCC 細(xì)胞系中，miR-19a-3p 抑制組 PPARαmRNA和蛋白表達(dá)較陰性對照組上調(diào)，circTMBIM6 抑制組PPARα mRNA和蛋白表達(dá)較陰性對照組下調(diào)（P均＜0.05）。見表8、9。

表8 舒尼替尼耐藥RCC細(xì)胞中circTMBIM6通過miR-19a-3p對PPARα mRNA表達(dá)的影響（）

表8 舒尼替尼耐藥RCC細(xì)胞中circTMBIM6通過miR-19a-3p對PPARα mRNA表達(dá)的影響（）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05。

786-O/S 1.34±0.24 3.45±0.21*0.34±0.23*組別陰性對照組miR-19a-3p抑制組circTMBIM6抑制組PPARα mRNA A498/S 1.11±0.89 4.12±0.65*0.15±0.57*Caki-1/S 1.02±0.13 3.21±0.23*0.43±0.11*

表9 舒尼替尼耐藥RCC細(xì)胞中circTMBIM6通過miR-19a-3p對PPARα蛋白表達(dá)的影響（）

表9 舒尼替尼耐藥RCC細(xì)胞中circTMBIM6通過miR-19a-3p對PPARα蛋白表達(dá)的影響（）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05。

786-O/S 2.67±0.33 6.32±0.43*1.55±0.89*組別陰性對照組miR-19a-3p抑制組circTMBIM6抑制組PPARα蛋白A498/S 2.23±0.53 4.50±0.60*1.23±0.23*Caki-1/S 2.79±0.23 5.11±0.76*0.96±0.64*

2.7 circTMBIM6 通 過 miR-19a-3p/PPARα 軸 對RCC 細(xì)胞舒尼替尼耐藥性的影響 circTMBIM6 抑制組細(xì)胞增殖抑制率高于miR-19a-3p 抑制組和陰性對照組（P均＜0.05）。見表10。

表10 各組舒尼替尼耐藥RCC細(xì)胞增殖抑制率比較（%，）

表10 各組舒尼替尼耐藥RCC細(xì)胞增殖抑制率比較（%，）

注：與circTMBIM6抑制組比較，*P＜0.05。

組別細(xì)胞增殖抑制率A498/S 20.98±1.08*13.56±4.17*62.45±1.69 786-O/S 25.27±2.02*14.71±3.21*67.79±1.25 Caki-1/S 22.73±2.46*14.07±2.84*65.09±2.75陰性對照組miR-19a-3p抑制組circTMBIM6抑制組

3 討論

近年來，以舒尼替尼為首的酪氨酸激酶抑制劑的研究在mRCC 治療方面取得了很大進(jìn)展［4］。舒尼替尼可以有效抑制腫瘤血管生成，最終抑制腫瘤生長，但耐藥性是制約療效的瓶頸。目前對于腎癌臨床無有效治療方法，其分子生物學(xué)基礎(chǔ)及調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。因此，我們迫切需要了解腎癌的發(fā)病及耐藥機(jī)制，從而為mRCC 患者提供更有效的治療策略。

circRNA 作為 miRNA 和 lncRNA 之后新的研究熱點(diǎn)，對腫瘤的影響逐漸被認(rèn)識(shí)。由于其特殊的結(jié)構(gòu)，circRNA 比lncRNA 更穩(wěn)定，更適合于腫瘤的診斷和治療。circRNA 是由前體RNA 剪接而形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，主要由編碼蛋白質(zhì)基因的外顯子產(chǎn)生。circRNA 作為一種調(diào)控RNA，可以促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)選擇性剪接、抑制miRNA 成熟、促進(jìn)蛋白—蛋白相互作用和miRNA 海綿等多種功能。此外，circRNA-miRNA軸可能是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)并在腫瘤的診斷和預(yù)后中具有巨大潛能。TMBIM6 又稱Bax-1 抑制劑，MBIM6 基因位于 12p13.12 號染色體上，是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的陽離子（Ca2+載體），包含6 個(gè)跨膜Bax 抑制劑基序。TMBIM6 在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、鼻咽癌和肝癌等多種腫瘤類型中表達(dá)上調(diào)，并改變葡萄糖代謝和激活鈉—?dú)浣粨Q器來促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)，TMBIM6 缺失或敲除會(huì)抑制原發(fā)腫瘤的生長。此外，TMBIM6 可上調(diào)mTORC2 的激活，并刺激糖酵解、蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)合成基因和糖基化蛋白的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，TMBIM6拮抗劑可以阻止TMBIM6 與mTORC2 結(jié)合，降低mTORC2 活性，還可以調(diào)節(jié)TMBIM6 泄漏的鈣離子，進(jìn)一步抑制腫瘤的形成和進(jìn)展［7］。DOYCHEVA 等［8］發(fā)現(xiàn)，TMBIM6 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的一種新的調(diào)節(jié)因子。根據(jù)KIM等［9］的研究，TMBIM6是一種跨膜Bax 抑制劑，可以參與順鉑誘導(dǎo)生殖毒性的分子機(jī)制；對野生型和TMBIM6 缺陷小鼠模型注射順鉑后，突變型小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平和蛋白質(zhì)羰基化水平高于野生型小鼠。經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的突變小鼠TMBIM6 表達(dá)后，睪丸和血清中的各項(xiàng)指標(biāo)均可恢復(fù)，提示TMBIM6 可通過誘導(dǎo)HO-1 來保護(hù)順鉑致睪丸毒性。盡管許多證據(jù)支持TMBIM6參與了多種癌癥的發(fā)生，但TMBIM6 在RCC 耐藥進(jìn)展中作用的分子機(jī)制的文獻(xiàn)較少。我們研究TMBIM6在RCC對靶向藥物舒尼替尼耐藥中的作用，有一定的前沿意義。本研究結(jié)果顯示，對RCC細(xì)胞系A(chǔ)498、Caki-1、780-0進(jìn)行耐藥培養(yǎng)后，耐藥RCC細(xì)胞中的circTMBIM6表達(dá)顯著上升，提示circTMBIM 在RCC 細(xì)胞對舒尼替尼的耐藥過程中發(fā)揮作用。

cirRNAc 作為miRNA 海綿，可以競爭性地結(jié)合miRNA，從而影響miRNA 的活性和下游靶基因的表達(dá)，這一機(jī)制已在多種腫瘤中得到證實(shí)，但是RCC對舒尼替尼耐藥的機(jī)制尚未清楚。故本研究首先探討circTMBIM6 調(diào)控的下游miRNA 及其靶基因。本研究通過 Starbase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測 circTMBIM6 3′UTR 中存在miR-19a-3p 目標(biāo)堿基序列，通過生物信息學(xué)軟件Targetsan 預(yù)測 PPARα 可能為 miR-19a-3p 的潛在靶基因，并采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了進(jìn)一步的證明。后續(xù)通過qRT-PCR 驗(yàn)證，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-circTMBIM6 降低miR-19a-3p 表達(dá)水平，進(jìn)一步揭示circTMBIM6競爭性結(jié)合miR-19a-3p并升高其表達(dá)。

miR-19a-3p 屬于miRNA-17-92 基因簇。它位于人類染色體13q31.3，具有重要的生物學(xué)功能。研究顯示，miR-19a/b 能夠靶向腫瘤抑制因子MXD1，調(diào)控胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，通過PITX1 下調(diào)影響轉(zhuǎn)錄激活的PDCD5 促進(jìn)細(xì)胞惡性，并預(yù)測胃癌的不良預(yù)后。YANG 等［12］發(fā)現(xiàn)，miR-19a-3p 在小鼠乳腺癌細(xì)胞中可下調(diào)M2表型巨噬細(xì)胞的表達(dá)，而miR-19a-3p在脊椎動(dòng)物中廣泛保守。miR-19a-3p mimic 基因轉(zhuǎn)染RAW264.7 巨噬細(xì)胞后，F(xiàn)ra-1 基因的表達(dá)明顯受到抑制（Fra-1基因作為支持乳腺癌侵襲發(fā)展的原癌基因），并降低下游基因Fra-1、VEGF、STAT3 和PS的表達(dá)，同時(shí)通過熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-19a-3p與Fra-1的結(jié)合活性。由此可見，miR-19a-3p可下調(diào)M2 巨噬細(xì)胞的M2 表型，在上調(diào)Fra-1 表達(dá)、誘導(dǎo)M2 巨噬細(xì)胞極化中發(fā)揮重要作用。FENG 等［13］分別構(gòu)建miR-19a-3p 模擬質(zhì)粒和空白對照質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-19a-3p能夠抑制SOX4蛋白表達(dá)，從而抑制DU145 細(xì)胞的遷移和侵襲，說明miR-19a-3p 通過SOX4 抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT。

本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-19a-3p inhibitor 可在蛋白及mRNA 水平負(fù)向調(diào)控PPARα。舒尼替尼耐藥的RCC細(xì)胞中circTMBIM6表達(dá)顯著上升，并通過與miR-19a-3p結(jié)合，促進(jìn)PPARα 表達(dá)。由于本課組前期研究發(fā)現(xiàn)敲低PPARα 通過激活NF-κB 信號通路促進(jìn)舒尼替尼對RCC 細(xì)胞的藥物敏感性［14］，提示PPARα可能參與耐藥調(diào)控過程。

為了探討 circTMBIM6/miR-19a-3p/PPARα 軸在RCC 舒尼替尼的耐藥過程中調(diào)控機(jī)制。進(jìn)一步探討這兩個(gè)非編碼RNA 是否可以調(diào)節(jié)PPARα 的表達(dá)影響RCC 對舒尼替尼敏感性，我們將si-NC+miRNC、si-NC+miR-19a-3p inhibitor、si-circTMBIM6+miR-NC 分別轉(zhuǎn)染到舒尼替尼耐藥的RCC 細(xì)胞，結(jié)果顯示，抑制 miR-19a-3p 后，PPARα 基因和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，細(xì)胞增殖抑制率下降，細(xì)胞活性增強(qiáng)，RCC 細(xì)胞對舒尼替尼的耐藥性增加；而抑制circRNA-TMBIM6 可 上 調(diào) miR-19a-3p 表 達(dá) ，抑 制PPARα 基因和蛋白表達(dá)，細(xì)胞增殖抑制率升高，細(xì)胞存活率降低，從而提高RCC 細(xì)胞對舒尼替尼的敏感性。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)分析和進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)，初步顯示circTMBIM6通過海面吸附作用 miR-19a-3p，影響PPARα 表達(dá)，調(diào)控 RCC 對舒尼替尼的敏感性。因此，circRNA TMBIM6可能是潛在的RCC耐藥治療新靶點(diǎn)。