儲金林，馬?，?，鐵璐，李琳琳

1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011；2北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系

糖尿病腎病（DKD）是終末期腎病的常見原因，是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，嚴重影響糖尿病患者的整體生活質(zhì)量。細胞游離DNA（cfDNA）是由于不同組織細胞死亡而降解的DNA片段釋放到血漿中，攜帶了起源細胞的遺傳和表觀遺傳信息，檢測血漿cfDNA可視為一種“液體活檢”，有利于開展各種相關(guān)診斷，避免有創(chuàng)的組織活檢［1］。5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）主要是5-甲基胞嘧啶通過TET酶氧化形成，是活性DNA去甲基化相對穩(wěn)定的中間體，被認為是重要的表觀遺傳特征［2］。研究表明，血漿cfDNA的5hmC譜是癌癥及糖尿病等相關(guān)疾病早期檢測和進展監(jiān)測的有力工具［3-5］。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上通過調(diào)控各種機制，從而影響基因表達的重要因子［6-7］。有研究表明，lncRNA基因表達也可能受到表觀DNA修飾的調(diào)控，如DNA甲基化和組蛋白修飾［8-9］，而對編碼lncRNA的基因組區(qū)域中潛在5hmC變化的研究較少。2021年2月—2022年2月，我們采用5hmC-Seal測序方法探討DKD患者血漿cfDNA中編碼lncRNA的基因組區(qū)域的關(guān)鍵5hmC改變，再進行l(wèi)ncRNA、miRNA和mRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，篩選可能的作用分子，為DKD的后續(xù)機制研究及診療策略奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集北京大學(xué)第三醫(yī)院收治的2型糖尿?。―M）患者14例，其中男9例、女5例，年齡31～62（47.9±6.9）歲；DKD患者17例，男9例、女8例，年齡32～77（51.1±16.7）歲。DM的診斷依據(jù)美國糖尿病協(xié)會（ADA）2020年發(fā)布的標準［10］，DKD的診斷依據(jù)KDIGO 2020臨床實踐指南和2014年中國糖尿病學(xué)會糖尿病腎病防治共識［11］。本研究通過北京大學(xué)第三醫(yī)院倫理委員會審批，受試者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 DKD患者血漿cfDNA的提取 采集DKD患者外周靜脈血2 mL，4℃、1 350 g離心15 min分離血漿，取上清；4℃、13 500 g離心5 min去除白細胞，取上清。使用QIAamp循環(huán)核酸試劑盒（QIAGEN）提取血漿cfDNA。

1.2.2 DKD與DM患者血漿cfDNA中羥甲基化修飾差異表達基因的篩選 采用5hmC-Seal技術(shù)。通過Fragment Analyzer對每個文庫樣本的DNA條帶大小及分布情況進行質(zhì)控，在使用qPCR的方法對文庫進行準確定量后，在NextSeq500測序平臺上進行雙端38-bp高通量測序，測序試劑盒為Illumina公司的Nextseq500/550 High Output Kit v2（75 cycles），每個樣品的測序通量為1.5 Gb，測序條帶大小為38 bp，最后得到文庫中所有DNA片段的堿基序列。接著進行測序數(shù)據(jù)前期處理：先用Trimmomatic軟件去除每個原始FASTQ數(shù)據(jù)一些低質(zhì)量、無用的數(shù)據(jù)，來評估序列質(zhì)量，提高后續(xù)分析的效率。用Bowtie2軟件將原始reads數(shù)比對到人類hg19基因組上，并進一步用SAMtools進行篩選以保留與基因組的唯一非重復(fù)匹配，使用bedtools將對端讀取進行擴展并轉(zhuǎn)換為BedGraph格式，并將其歸一化為對齊讀取的總數(shù)量，然后使用UCSC基因組瀏覽器中的bedGraphToBigWig轉(zhuǎn)換為bigwig格式，以便在Integrated Genomics Viewer中進行可視化。使用MACS識別潛在的5hmC富集區(qū)域，使用的參數(shù)為MACS14-p1e-3-f BAM-g hs。 使 用bedtools合 并 峰值，只保留出現(xiàn)在10個樣本以上且小于1 000 bp的峰值區(qū)域。X和Y染色體內(nèi)的5hmC富集區(qū)域被排除，并作為下游分析的輸入。用DEseq2包找出差異基因，篩選條件為|log2FC|＞0.5且FDR＜0.05（FC為差異表達倍數(shù)，即DKD組與DM組差異表達倍數(shù)在1.5倍以上；FDR為校正后的P值）。

1.2.3 DKD患者血漿cfDNA中羥甲基化修飾lncRNA的篩選 采用加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)（WGCNA）程序的R語言包來構(gòu)建差異羥甲基化基因的共表達網(wǎng)絡(luò)。以擬合指數(shù)R2＞0.6使得基因之間的連接服從近似無尺度網(wǎng)絡(luò)分布，再繪制出模塊和性狀之間的相關(guān)性熱圖，以通過各個模塊與性狀之間的相關(guān)系數(shù)大小及P＜0.05篩選出與DKD顯著相關(guān)的基因模塊，最后計算基因顯著性（GS）和模塊身份（MM），通過設(shè)置GS和MM的取值范圍對network-Screening函數(shù)計算得到的基因列表進行篩選，從而識別和鑒定出關(guān)鍵樞紐基因，并從中篩選關(guān)鍵lncRNA進行后續(xù)分析。

1.2.4 羥甲基化修飾lncRNA細胞定位lncRNA在細胞中具有廣泛的亞細胞分布，這決定了其功能調(diào)控的多樣性，只有定位在細胞質(zhì)中，才能形成ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而為理解基因的作用機制提供研究方向。因此我們應(yīng)用 lncLocator（http：//www. csbio. sjtu.edu. cn/bioinf/lncLocator/）對 lncRNA 的亞細胞定位進行預(yù)測，尋找lncRNA所在的細胞位置。

1.2.5 靶向miRNA 的羥甲基化修飾lncRNA 篩選 Starbase 在線分析工具數(shù)據(jù)庫主要對高通量測序的CLIP-Seq 測序分析數(shù)據(jù)和降解組測序分析數(shù)據(jù)的整合來尋找miRNA 的靶標，可為探討miRNA的靶標提供可視化過程，該數(shù)據(jù)庫包括大量miRNA-ncRNA、miRNA-mRNA、RBP-RNA 和RNA-RNA 的數(shù)據(jù)。因此，我們利用Starbase（http：//starbase. sysu.edu.cn/）預(yù)測lncRNA的靶向miRNA。

1.2.6 羥甲基化修飾lncRNA 診斷價值及表達驗證 對最終的關(guān)鍵lncRNA 進行受試者工作特征曲線（ROC）分析，若曲線下面積（AUC）≥0.8，則認為該基因具有較高的臨床診斷價值。取SPF 級雄性C57BL/6 小鼠 9 只，8 周齡，體質(zhì)量 20～22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，飼以蛋白含量為21%的標準飼料塊，不限制飲水飲食。適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周后，將小鼠隨機分成 DM 組、DKD 組和對照組各3 只，DM 組和 DKD 組連續(xù) 5 d 腹腔注射 60 mg/kg STZ，對照組腹腔注射檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.2～4.5）。96 h 后，斷尾取血，測定血糖濃度，以血糖＞16.7 mmol/L為DM造模成功。繼續(xù)飼養(yǎng)16周，以空腹血糖＞16.7 mmol/L，蛋白尿、尿素氮、血肌酐水平明顯升高，為DKD 造模成功。取小鼠腎組織，-80 ℃保存。使用TRIzol 試劑提取腎組織總RNA，按試劑盒說明書進行RNA 逆轉(zhuǎn)錄，并進行擴增反應(yīng)，目的基因的相對表達量用2-ΔΔCt法計算。

1.2.7 miRNA 靶基因的預(yù)測及功能富集 應(yīng)用miRDB（https：/www. mirdb. org/）和 TargetScan（https：//www.targetscan.org/）2 個在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA 的靶向 mRNA。此外，從 NCBI 的 GEO 數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載 mRNA 轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)編號為 GSE96804，使用相關(guān) R 包找到差異基因（|log2FC|＞0.5 且FDR＜0.05）。將3 個數(shù)據(jù)庫得到的靶基因取交集作為最后miRNA 靶基因集合。將靶向基因集提交Metascape（https：//metascape.org/gp）網(wǎng)站，以P＜0.05 為條件進行基因本體（GO）分析。

1.2.8 競爭內(nèi)源性RNA（ceRNA）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（即lncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)）的構(gòu)建 mRNA、lncRNA 和circRNA 任意類型的兩個RNA 分子間只要結(jié)合到相同的miRNA，就可能構(gòu)成ceRNA 對，包括mRNA-mRNA、lncRNA-lncRNA、circRNA-circRNA。ceRNA 分析作為lncRNA 功能研究的一種方式，lncRNA-mRNA 共表達分析結(jié)果結(jié)合miRNA 靶基因數(shù)據(jù)集，基于篩選后競爭性吸附結(jié)合miRNA 進而調(diào)控靶mRNA表達的lncRNA-mRNA和circRNA-mRNA關(guān)系對，對lncRNA 的功能進行預(yù)測。我們使用Cytoscape（3.7.1版）繪制ceRNA網(wǎng)絡(luò)，以確定ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的lncRNA在疾病中是否有關(guān)鍵作用，調(diào)控關(guān)鍵蛋白。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS17.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，三組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。使用Graph Prism 8.3.0 軟件作圖，使用R 語言版本4.1.0進行數(shù)據(jù)分析并生成圖像。

2 結(jié)果

2.1 DKD 患者血漿cfDNA 中羥甲基化修飾差異表達基因的篩選結(jié)果 測序數(shù)據(jù)分析顯示，與DM患者比較，DKD 患者的5hmC 整體分布水平明顯降低。5hmC 主要在轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）和轉(zhuǎn)錄終止位點（TTS）內(nèi)富集，在側(cè)翼區(qū)域耗損（見OSID 碼圖1），說明5hmC 的累積與轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。以|log2FC|＞0.5、FDR＜0.05 為標準，獲得 DKD 與 DM 的差異基因共1 644個。

2.2 DKD患者血漿cfDNA中羥甲基化修飾lncRNA的篩選結(jié)果 將獲得的差異基因用于樣本的聚類分析，表型熱圖分析結(jié)果見OSID 碼圖2A，無離群樣本。計算DKD 基因間的鄰接矩陣和拓撲矩陣，基于動態(tài)剪切樹法把輸入的差異基因分成3 個模塊，分別用3 種顏色矩形表示，相似度高的基因被聚類到同種顏色的模塊中，結(jié)果見OSID 碼圖2B。為了得到各個模塊與臨床表型之間的關(guān)系，我們對共表達模塊與臨床表型進行關(guān)聯(lián)性分析，以相關(guān)性熱圖表示，結(jié)果見OSID 碼圖2C。結(jié)果顯示與DKD 表型相關(guān)性最強的模塊是藍綠色模塊（r=0.73，P＜0.001），總體上與DKD 表型呈正相關(guān)。進一步將藍綠色模塊作為關(guān)鍵模塊進行GS 和MM 分析，藍綠色模塊的GS 與 MM 的相關(guān)系數(shù)r=0.82，P＜0.001，結(jié)果見OSID 碼圖 2D，最后通過對 GS 和 MM 設(shè)定條件，以GS＞0.7，MM＞0.9 的標準來篩選藍綠色模塊中與DKD 相關(guān)性高的關(guān)鍵樞紐基因。由于本研究主要分析和篩選關(guān)鍵羥甲基化修飾lncRNA，故最終獲得15個lncRNA，見表1。

2.3 羥甲基化修飾lncRNA的亞細胞定位 為了分析這些差異lncRNA 是否參與ceRNA 競爭機制，利用lnclocater 網(wǎng)站對其亞細胞定位進行分析，結(jié)果顯示，這15 個關(guān)鍵lncRNA 均定位于細胞質(zhì)，大部分lncRNA 預(yù)測分數(shù)都大于0.8，結(jié)果見表1，說明對亞細胞定位的預(yù)測結(jié)果的準確性很高。

表1 羥甲基化修飾lncRNA的亞細胞定位

2.4 lncRNA 靶向miRNA 的預(yù)測結(jié)果 使用Starbase分析工具預(yù)測lncRNA的靶基因miRNA，發(fā)現(xiàn)只有2 個lncRNA 在數(shù)據(jù)庫中有預(yù)測結(jié)果，分別是LINC00641和LINC00863。其羥甲基化水平見OSID碼圖 3 所示，與 DM 患者相比，DKD 患者的 2 個關(guān)鍵lncRNA 羥甲基化水平降低（P均＜0.05）。接著以bioComplex＞1 為篩選條件，LINC00641 的靶基因有12 個，分別為 hsa-miR-320b、hsa-miR-194-5p、hsamiR-320d、hsa-miR-539-5p、hsa-miR-320c、hsa-miR-153-3p、hsa-miR-378b、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-378d、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-378h、hsa-miR-206。LINC00863 的靶基因為hsa-miR-218-5p。最終確定的2個關(guān)鍵lncRNA預(yù)測的靶基因共有13個。

2.5 羥甲基化修飾lncRNA 診斷價值及表達驗證結(jié)果 對篩選得到的2 個關(guān)鍵lncRNA 進行ROC曲線分析，結(jié)果顯示LINC00641 和LINC00863 在本數(shù)據(jù)集中診斷DKD 準確性均滿足AUC≥0.8，具有較好的診斷價值，見OSID 碼圖4。與對照組和DM組 相 比 ，DKD 組 腎 組 織 LINC00863、LINC00641 mRNA 表達水平降低（P均＜0.05），見表2。

表2 DKD小鼠腎組織中相關(guān)lncRNA的表達水平（）

表2 DKD小鼠腎組織中相關(guān)lncRNA的表達水平（）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與DM組相比，#P＜0.05。

組別對照組DM組DKD組LINC00641 1.01±0.16 0.80±0.08 0.57±0.04**#n 3 3 3 LINC00863 1.00±0.16 0.92±0.14 0.66±0.06*#

2.6 miRNA 靶基因的篩選及功能富集結(jié)果 對DKD 腎組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行差異分析（|log2FC|＞0.5，F(xiàn)DR＜0.05），上調(diào)基因 1 259 個，下調(diào)基因1 386 個，見 DSID 碼圖 5A。使用數(shù)據(jù)庫 miRDB 和TargetScan 分別預(yù)測上述13 個miRNA 的靶向mRNA，然后分別與DKD 轉(zhuǎn)錄組差異基因取交集、去重后，最終得到可在外部數(shù)據(jù)集中驗證出的246個差異靶基因。對這246 個基因進行GO 富集分析，主要與泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育、腎臟發(fā)育、腎系統(tǒng)發(fā)育、腎上皮細胞及后腎的發(fā)育等生物學(xué)途徑相關(guān)，見 DSID 碼圖 5B。

2.7 ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 將所得lncRNA、miRNA 與 mRNA 在 Cytoscape3.8.0 中繪制出 ceRNA網(wǎng)絡(luò)，共246條通路，261個節(jié)點，259條邊。見OSID碼圖6。

3 討論

DKD 是一種由于DM 患者長期處于高血糖狀態(tài)引起的慢性腎臟病，其發(fā)病機制復(fù)雜。研究顯示，lncRNA 在多種慢性疾病的進展中起關(guān)鍵作用。動物實驗顯示，使用TGF-β1處理小鼠系膜細胞后，通過lncRNA 啟動子和原癌基因Ets-1 的組蛋白乙酰化，miR-192 與其宿主 lncRNA CJ241444 共同調(diào)節(jié)，導(dǎo)致Smads 的富集和lncRNA 以及miR-192 的上調(diào)［12］。KATO 等［13］研究顯示，具有 DKD 相關(guān)功能的關(guān)鍵miRNA（miR-216a和miR-217）由TGF-β1及其宿主lncRNA RP23-298H6.1-001 在系膜細胞中被誘導(dǎo)。其后續(xù)研究顯示，lnc-megacluster（lnc-MGC）是miR-379 簇中近 40 個 miRNA 的 lncRNA 宿主，可在早期DKD 小鼠中促進系膜細胞的細胞外基質(zhì)積累和肥大［14］。在 1 型和 2 型 DM 小鼠的腎小球以及暴露于高糖培養(yǎng)的小鼠系膜細胞中，lnc-MGC 及其幾種駐留miRNA 表達增加，主要是TGF-β1通過涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子CHOP（C/EBP 同源蛋白）的機制。因此，lnc-MGC 可以增加DKD 中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，這反過來可能導(dǎo)致lnc-MGC 的持續(xù)表達，繼續(xù)循環(huán)并可能有助于代謝記憶。值得注意的是，在暴露于高葡萄糖和TGF-β1下，人類系膜細胞中的lnc-MGC 直系同源物也會上調(diào)。這是個重要發(fā)現(xiàn)，因為與miRNA 不同，lncRNA 通常在物種間不太保守，這提示該lncRNA 簇可能與人類DKD 相關(guān)。此外，有研究報道，血漿cfDNA 攜帶了起源細胞的遺傳和表觀遺傳信息［1］。所以，本研究基于人血漿來源cfDNA 的羥甲基化修飾lncRNA 在DKD 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中進行初步探索。

本研究通過對DKD及DM 患者血漿cfDNA 進行5hmC 全基因組測序，結(jié)果顯示整體5hmC 信號主要在 TSS 區(qū)域富集，RNA 的轉(zhuǎn)錄始于 TSS，并且 DM 與DKD 患者之間存在顯著差異，表明這些區(qū)域在通過5hmC調(diào)節(jié)疾病基因（如lncRNA基因）表達中發(fā)揮關(guān)鍵作用。使用WGCNA 算法得到與DKD 相關(guān)編碼lncRNA 的關(guān)鍵5hmC 標志物，用這種計算方法的優(yōu)勢是：以生物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為基礎(chǔ)，能夠更加精準的展現(xiàn)生物學(xué)特性；可幾乎覆蓋到人類的所有編碼基因；與已發(fā)表的研究偏倚性較小。該結(jié)果為后續(xù)疾病的深入研究提供了更廣泛的理論基礎(chǔ)。

此外，本研究通過亞細胞定位確定了15 個lncRNA 在細胞質(zhì)中的表達，表明上述lncRNA 可通過ceRNA 機制調(diào)控基因表達參與DKD 的發(fā)病。Starbase 預(yù)測結(jié)果顯示，相關(guān)lncRNA 可通過調(diào)控miRNA 從而影響DKD 中的基因表達，但我們發(fā)現(xiàn)只有2 個lncRNA 在Starbase 數(shù)據(jù)庫中有預(yù)測結(jié)果，分別為 LINC00863 和 LINC00641，同時發(fā)現(xiàn)這 2 個lncRNA 的羥基化水平能很好的區(qū)分DKD 和DM。另外，在DKD小鼠腎臟組織中對這2個lncRNA的表達水平也得到了與預(yù)測一致的實驗驗證結(jié)果。因此，我們認為LINC00863 和LINC00641 很可能成為DKD 診斷的潛在生物標志物和治療靶點。我們進一步對已在小鼠腎組織中得到有效驗證的lncRNA，篩選得到下游調(diào)控miRNA，最后基于數(shù)據(jù)庫預(yù)測上述miRNA 的靶向mRNA，為了得到較為準確的lncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，我們篩選與外部DKD 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集差異表達的靶向mRNA，得到具有一定可信度的ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。但事實上ceRNA 目前還處于一個起步階段，具體的研究案例比較少，本研究只是可視化構(gòu)建了一個基本的網(wǎng)絡(luò)，具體的調(diào)控方式還有待繼續(xù)探究。另外，對于最終篩選得到的關(guān)鍵lncRNA文獻報道較少，有研究表明LINC00641 過表達會抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，可通過海綿化miR-194-5p 抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲［15］。

最后，基于Metascape網(wǎng)站對我們篩選出的基因進行GO 功能富集分析，結(jié)果顯示，主要參與泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育和腎臟發(fā)育通路，說明持續(xù)高血糖的環(huán)境對于腎臟功能及結(jié)構(gòu)會存在一定的不利影響，與DKD的發(fā)病機制息息相關(guān)。

綜上所述，本研究基于臨床樣本數(shù)據(jù)，通過對DKD 及 DM 患者的血漿 cfDNA 進行 5hmC-Seal測序，發(fā)現(xiàn)了與DKD 相關(guān)編碼lncRNA 的關(guān)鍵5hmC 標志物，構(gòu)建了完整的ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為DKD 分子機制的深入研究提供了嚴謹?shù)臄?shù)據(jù)支持。