郭南，賈元威，項(xiàng)婷，王萍，詹翠嬌，王昌茂，沈杰，，楊斌

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是以關(guān)節(jié)退化或老化作為病理基礎(chǔ)，以關(guān)節(jié)腫脹、疼痛或功能障礙作為主要臨床表現(xiàn)的一類關(guān)節(jié)炎性疾病［1-3］，近年來骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病也見于青少年［4］。目前臨床尚無滿意的治療方法，臨床治療為減輕炎性癥狀和改善功能狀態(tài)，常用藥物有止痛藥、非甾體抗炎藥、腎上腺皮質(zhì)激素［5］等，長期應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致胃腸道不良反應(yīng)和代謝紊亂等副作用。青少年病人急需一種具有明確療效且副作用小的治療藥物。

豆腐果苷（圖1，helicid，對(duì)甲醛苯-O-β-D-阿咯吡喃糖苷）提取自山龍眼科山龍眼屬植物深綠山龍眼果實(shí)，是此種屬植物來源唯一已上市成功應(yīng)用于臨床的酚苷類物質(zhì)［6］。毒理學(xué)研究表明，27 mg·kg-1·d-1、270 mg·kg-1·d-1、1 350 mg·kg-1·d-1劑量母體染毒對(duì)大鼠仔代的早期生理發(fā)育及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育沒有影響［7］。文獻(xiàn)報(bào)道，口服豆腐果苷在6.25～50.00 mg/kg范圍內(nèi)的鎮(zhèn)痛作用呈劑量依賴性。本課題組前期基于豆腐果苷抗骨關(guān)節(jié)炎模型（OA模型）大鼠疼痛的藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，給予25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg劑量豆腐果苷21 d后，均可使骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠的機(jī)械痛閾值上升，藥效學(xué)行為呈現(xiàn)鐘形曲線，50 mg/kg劑量組升高機(jī)械痛值閾值作用最強(qiáng)［8］。因此本研究選擇50 mg/kg豆腐果苷作為給藥劑量。

圖1 豆腐果苷分子結(jié)構(gòu)式

采用膝關(guān)節(jié)注射一定濃度碘乙酸鈉可快速建立穩(wěn)定、高效的OA大鼠模型，且大鼠病理表現(xiàn)與關(guān)節(jié)炎患者臨床表現(xiàn)相似，包括關(guān)節(jié)疼痛、間歇性炎癥和關(guān)節(jié)神經(jīng)損傷。這種方法是研究骨關(guān)節(jié)炎的經(jīng)典可靠模型［9-10］。

本研究旨在首次探討對(duì)骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠具有明確鎮(zhèn)痛作用的豆腐果苷50 mg/kg劑量給藥后，大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜和軟骨的病理變化。本研究分別采用HE染色與番紅固綠染色分別對(duì)大鼠軟骨和滑膜進(jìn)行染色觀察，并分別進(jìn)行相應(yīng)的評(píng)分鑒定，以定量評(píng)價(jià)豆腐果苷對(duì)大鼠骨關(guān)節(jié)炎的影響。

1 材料與方法

1.1 材料健康雄性SD大鼠共24只［上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2018-0004］，SPF級(jí)，體質(zhì)量（180±20）g。恒溫（22±2）℃，12 h光照/黑暗循環(huán)條件下自由飲水飲食適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。研究起止時(shí)間為2019年12月至2020年7月。

1.2 藥品與試劑豆腐果苷（TCI Japan公司，純度＞98%，批號(hào)QCCYK-GS）；碘乙酸鈉（Sigma-Aldrich，≥98%，批號(hào)SLBZ7569）；蘇木素染色液（無錫市江原實(shí)業(yè)技貿(mào)總公司，批號(hào)200423）；番紅染色液和固綠染色液（Sigma公司）；伊紅染色液（無錫市江原實(shí)業(yè)技貿(mào)總公司，批號(hào)200609）。

1.3 主要儀器熒光倒置顯微鏡（T8 TOKYO，Nikon公司，JAPAN）；切片機(jī)（型號(hào)LEICA 2245，Germany）；精密電子天平（AL104-IC，METTLER TOLEDO）；數(shù)顯游標(biāo)卡尺（杭州鋼拓工具有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型 結(jié)合相關(guān)研究提及的大鼠骨關(guān)節(jié)炎造模方法進(jìn)行造模［11-12］。操作過程大致為，使用10%水合氯醛（3 mL/kg，ip）對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉；直至大鼠所有感覺反射停止，對(duì)左右膝關(guān)節(jié)進(jìn)行剃毛，醫(yī)用碘伏消毒后用75%乙醇脫碘2次；膝關(guān)節(jié)屈曲45°，自髕骨下韌帶外側(cè)進(jìn)行關(guān)節(jié)腔穿刺，進(jìn)針到股骨髁后稍微回退，一次性膝關(guān)節(jié)腔注射50 μL碘乙酸鈉（0.9%滅菌生理鹽水配制，濃度為3 mg/50 μL）；將大鼠膝蓋伸展和彎曲30 s，使碘乙酸鈉溶液分散至整個(gè)膝關(guān)節(jié)處。同時(shí)，假手術(shù)組對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)注射等量生理鹽水。

1.4.2 分組和給藥 造模成功后，將假手術(shù)大鼠分為一組，骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠隨機(jī)區(qū)組分組法分為模型組和50 mg/kg豆腐果苷治療組，每組8只。豆腐果苷給藥方法：大鼠禁食12 h，造模前1天開始于上午7：30～8：30以50 mg/kg劑量豆腐果苷溶液灌胃大鼠，模型組和假手術(shù)組分別給予等量生理鹽水灌胃。灌胃每天1次，持續(xù)21 d。

1.4.3 膝關(guān)節(jié)標(biāo)本收集、制備、觀察 給藥21 d后，使用1%戊巴比妥鈉（35 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，并頸椎脫臼法處死大鼠。固定大鼠后，分離右側(cè)膝關(guān)節(jié)皮膚及皮下組織，剔除周圍的肌肉組織，保留股骨遠(yuǎn)1/4和脛骨近端1/4截取整個(gè)大鼠膝關(guān)節(jié)，并于4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上。固定后的大鼠膝關(guān)節(jié)用15%EDTA脫鈣4周后，進(jìn)行石蠟包埋，切片，以及HE和番紅固綠染色分別觀察與評(píng)價(jià)軟骨和滑膜病理變化。本研究在2月齡青年期大鼠體內(nèi)開展，此月齡大鼠發(fā)育不完全，潮線尚不清晰［13-14］，所以在評(píng)價(jià)時(shí)采用改良的Mankin評(píng)分，潮線完整性和清晰度不計(jì)入評(píng)分。

1.4.3.1 HE染色評(píng)價(jià) 熒光倒置顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨、滑膜形態(tài)，分別對(duì)假手術(shù)組、模型組及豆腐果苷給藥組滑膜組織病理學(xué)進(jìn)行鑒定評(píng)分。（1）滑膜組織病理評(píng)分［15］。炎細(xì)胞：0分，無；1分，稀疏、散在；2分，較密集；3分，大量。（2）纖維組織增生：0分，無；1分，少量增生；2分，中等；3分，大量。（3）滑膜組織增生：0分，無；1分，單層；2分，2層；3分，3層。（4）巨噬細(xì)胞增生：0分，無；1分，稀疏；2分，較密集；3分，大量。

1.4.3.2 Mankin評(píng)分 熒光倒置顯微鏡下觀察大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨與軟骨下骨和骨組織間關(guān)系。并對(duì)軟骨病理變化進(jìn)行Mankin評(píng)分［16］。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［17］：（1）軟骨結(jié)構(gòu)：正常，0分；表面不規(guī)則，1分；血管翳，2分；血管翳和表面不規(guī)則，3分；到過渡帶的裂隙，4分；到放射帶的裂隙，5分；到鈣化帶的裂隙，6分。（2）軟骨細(xì)胞：正常，0分；細(xì)胞形態(tài)固縮及脂質(zhì)變性，1分；大量簇集樣細(xì)胞團(tuán)，1分；數(shù)量明顯消失，3分。（3）番紅固綠染色：正常，0分；輕度減少，1分；中度減少，2分；重度減少，3分；未著色，4分。（4）潮線完整性：完整，0分；被血管破壞，1分；總分14分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS 19.0軟件用于本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膝關(guān)節(jié)形態(tài)觀察圖2可見假手術(shù)組關(guān)節(jié)面色澤正常，關(guān)節(jié)表面光滑，未見關(guān)節(jié)腫脹及積液形成。模型組較之假手術(shù)組，關(guān)節(jié)軟骨表面不規(guī)則，有潰瘍形成，腔內(nèi)出現(xiàn)積液。豆腐果苷組關(guān)節(jié)表面與模型組相比，關(guān)節(jié)軟骨表面較完整，潰瘍有較大改善，腔內(nèi)未出現(xiàn)積液。我們通過對(duì)處死后大鼠，采用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量各組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑，研究各組大鼠膝關(guān)節(jié)的腫脹程度。如圖2所示，可以清晰觀察到豆腐果苷可顯著緩解模型組關(guān)節(jié)腫脹。上述結(jié)果共同表明豆腐果苷可以減輕碘乙酸鈉誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)損傷。

2.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色結(jié)果由圖3中大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色結(jié)果可知，假手術(shù)組膝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，且細(xì)胞排列規(guī)則，四層結(jié)構(gòu)清晰，軟骨基質(zhì)染色均勻，未見炎細(xì)胞浸潤。相對(duì)于假手術(shù)組，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙且有絨毛狀，軟骨細(xì)胞排列紊亂，軟骨基質(zhì)染色不均，部分區(qū)域的細(xì)胞核固縮、壞死，有炎性細(xì)胞浸潤和血管生成。但是在給予豆腐果苷治療后，大鼠軟骨表面較完整，軟骨基質(zhì)染色較均勻，四層結(jié)構(gòu)較清晰，細(xì)胞排列較整齊。結(jié)果表明豆腐果苷可以減輕碘乙酸鈉導(dǎo)致的大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織病變。

2.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜HE染色結(jié)果圖4中大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組可見大量的脂肪細(xì)胞和滑膜細(xì)胞；模型組較假手術(shù)組表現(xiàn)出更多的炎性細(xì)胞浸潤，滑膜組織明顯增厚，有散在的炎性細(xì)胞如淋巴細(xì)胞出現(xiàn)。但豆腐果苷組炎性細(xì)胞明顯減少，部分可見脂肪細(xì)胞和增生的血管。結(jié)果表明豆腐果苷可以減輕碘乙酸鈉誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞增加。

2.4 各組大鼠滑膜組織病理評(píng)分結(jié)果對(duì)各組大鼠的滑膜組織病理特征進(jìn)行評(píng)分可得，模型組大鼠的評(píng)分相對(duì)于假手術(shù)組顯著增大［（6.88±0.83）比（0.50±0.53）］（P＜0.01），在灌胃50 mg/kg豆腐果苷21 d后，大鼠的滑膜病理評(píng)分顯著降低［（3.50±0.53）比（6.88±0.83）］（P＜0.01）。以上數(shù)據(jù)表明50 mg/kg的豆腐果苷可以顯著改善骨關(guān)節(jié)炎大鼠的滑膜病理損傷。

2.5 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨番紅固綠染色結(jié)果如圖5，由大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的番紅固綠染色圖可觀察到，假手術(shù)組軟骨細(xì)胞的細(xì)胞核呈粉紅色，細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)綠色，其軟骨細(xì)胞形態(tài)結(jié)果與HE染色結(jié)果基本相同，且軟骨基質(zhì)完整，染色均勻，無蛋白多糖丟失。而模型組番紅顯色明顯降低，軟骨基質(zhì)分布不均勻，蛋白多糖丟失明顯。在給予豆腐果苷治療后，軟骨較模型組基質(zhì)分布均勻，蛋白多糖丟失有顯著改善，表明豆腐果苷可以改善大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷。

2.6 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分結(jié)果豆腐果苷以50 mg/kg劑量灌胃大鼠21 d后的膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分結(jié)果如表1所示。數(shù)據(jù)顯示，較假手術(shù)組，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)、軟骨細(xì)胞和番紅固綠染色Mankin評(píng)分值均顯著上升（P＜0.01），而在豆腐果苷干預(yù)后，各項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分值較模型組均有顯著下降，以上數(shù)據(jù)提示豆腐果苷50 mg/kg可以減輕碘乙酸鈉誘導(dǎo)的青年大鼠膝關(guān)節(jié)病變程度。

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)Mankin評(píng)分比較/（分，）

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)Mankin評(píng)分比較/（分，）

注：①與假手術(shù)組比較，P＜0.01。②與模型組比較，P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組豆腐果苷組F值P值關(guān)節(jié)數(shù)888 Mankin評(píng)分軟骨結(jié)構(gòu)0.50±0.53 3.88±0.83①1.63±0.52②64.67＜0.001軟骨細(xì)胞0.25±0.46 1.75±0.46①1.13±0.64②37.56＜0.001番紅固綠染色0.38±0.52 2.38±0.74①0.88±0.64②52.43＜0.001

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是較為常見的關(guān)節(jié)疾病，影響全球約2.4億人，伴有極高的發(fā)病率和死亡率，可導(dǎo)致殘疾，嚴(yán)重降低了病人的生活水平［18-19］，并存在一定數(shù)量的青少年病人。進(jìn)行性、不可逆的軟骨退化是骨關(guān)節(jié)炎標(biāo)志病理特征之一，并且與滑膜、軟骨下骨和半月板及其他關(guān)節(jié)組織的病理發(fā)展密切相關(guān)［20］。向大鼠膝關(guān)節(jié)定量注射碘乙酸鈉建立OA模型是藥理學(xué)當(dāng)中研究骨關(guān)節(jié)炎的經(jīng)典方法。本研究的重點(diǎn)是探討豆腐果苷對(duì)碘乙酸鈉誘導(dǎo)的大鼠OA模型軟骨和滑膜組織的影響。與模型組大鼠相比，豆腐果苷可明顯減輕膝關(guān)節(jié)腫脹程度，改善關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)，并且減少了軟骨基質(zhì)中蛋白多糖的丟失，以及抑制了膝關(guān)節(jié)滑膜組織增厚和炎癥細(xì)胞的增加。其原因可能與豆腐果苷的抗炎、鎮(zhèn)痛機(jī)制有關(guān)，后續(xù)將開展系列研究，進(jìn)一步探索豆腐果苷減輕滑膜炎癥、保護(hù)軟骨的作用機(jī)制。

在OA的治療藥物中目前最常見的為非甾體類抗炎藥、對(duì)乙酰氨基酚等［21］，但因其長期給藥有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，限制了其使用。目前，對(duì)OA治療方法的研究表明天然產(chǎn)物及其衍生物具有一定的潛力，如附子［22］等。豆腐果苷在止痛、鎮(zhèn)靜、抗抑郁、心腦血管系統(tǒng)疾病及各種衍生物的研究等方面都有一定的療效，且毒副作用低，可長期使用［23］?；蛟S可與非甾體抗炎藥聯(lián)合使用或交替使用，以加強(qiáng)療效降低毒副作用，但還有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

此外有研究表明，豆腐果苷結(jié)構(gòu)類似物天麻素（gastrodin，對(duì)羥甲基苯-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）可通過抑制OA大鼠軟骨退化而抑制OA進(jìn)程。本研究結(jié)果也顯示豆腐果苷可抑制OA大鼠軟骨退化。我們猜想，其發(fā)揮作用的機(jī)制是否與天麻素相似，即通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB途徑，減少炎性因子，包括IL-6，TNF-α等的釋放來發(fā)揮抗炎作用［24］，這有待進(jìn)一步研究。據(jù)報(bào)道，豆腐果苷及其代謝產(chǎn)物與天麻素有很多相似藥效學(xué)作用，對(duì)此類具有明確藥效作用且不良反應(yīng)極少的天然產(chǎn)物的深入研究，是發(fā)現(xiàn)新的天然產(chǎn)物及新的作用靶標(biāo)與通路的重要途徑。

綜上，豆腐果苷可顯著改善碘乙酸鈉誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜和軟骨的病理損傷。本研究為豆腐果苷應(yīng)用于軟骨病變和滑膜炎的臨床防治提供了一定的理論基礎(chǔ)。此外，本課題組在研究結(jié)果的基礎(chǔ)上還將對(duì)豆腐果苷發(fā)揮骨關(guān)節(jié)炎治療作用的具體分子機(jī)制進(jìn)一步研究。