糯淑梅，王政全，吳 春，楊安錦，劉乃勇

(西南林業(yè)大學(xué)，云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224)

管紋艷虎天牛Rhaphumahorsfieldi是一種雜食性的蛀干害蟲，其寄主包括豆科、樟科和胡桃科植物，不同寄主植物可能促使其體內(nèi)植物細(xì)胞壁降解相關(guān)的酶在數(shù)量、表達(dá)水平、基因結(jié)構(gòu)等方面呈現(xiàn)多樣化，如糖苷水解酶(Glycoside hydrolase,GH；EC 3.2.1)基因家族(云南省林業(yè)廳等,1987;尹寧娜等,2019)。GH是一大類廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌、線蟲等生物體內(nèi)催化糖苷鍵水解的酶，負(fù)責(zé)裂解糖分子與生物分子之間的糖苷鍵，其催化水解過程不需要任何輔酶或輔因子的參與。在植食性天牛昆蟲體內(nèi)，GH主要將纖維素、纖維二糖等多糖水解為可供昆蟲消化吸收的低聚糖或單糖(Watanabe and Tokuda,2010;Pauchetetal.,2010;Fischeretal.,2013)。因此，GH基因?qū)τ谌∈衬颈局参锏奶炫？评ハx的生長發(fā)育尤為重要。

根據(jù)序列相似性和基因功能，昆蟲GH基因超家族可劃分為多個(gè)家族(如GH1、GH9、GH28、GH45等)，同一物種不同GH家族基因間相似性較低，而不同物種同一GH家族的同源基因間相似性較高(Bourne and Henrissat,2001;Palomares-Riusetal.,2014)。在桑天牛Aprionagermari和桑樹黃星天牛Psacotheahilaris中，同源的GH5基因具有89%的氨基酸一致性(Weietal.,2006)。在鞘翅目昆蟲中，赤擬谷盜Triboliumcastaneum(Willisetal.,2011)、光肩星天牛Anoplophoraglabripennis(Mckennaetal.,2016)、葉甲Gastrophysaviridula(Buschetal.,2018)、白蠟窄吉丁Agrilusplanipennis(登錄號(hào)：XP_025831030.1)、螢火蟲Photinuspyralis(Fallonetal.,2018)和椰子犀角金龜Oryctesrhinoceros(Matanetal.,2019)的GH9基因具有60%的氨基酸一致性。然而，光肩星天牛的AglaGH9基因與所有AglaGH1s基因均具有較低的氨基酸一致性(<15%)(Mckennaetal.,2016)。由于鞘翅目不同昆蟲間GH家族數(shù)量存在差異，因此導(dǎo)致了它們的基因數(shù)量變化較大。從玉米根螢葉甲Diabroticavirgiferavirgifera卵、初孵幼蟲和3齡幼蟲中腸的轉(zhuǎn)錄組中鑒定到8個(gè)GH家族的78個(gè)基因(Eyunetal.,2014)；在大足象Cyrtotrachelusbuqueti中，從不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組中鑒定到55個(gè)GH家族的309個(gè)基因(Luoetal.,2018)；基于基因組數(shù)據(jù)，從赤擬谷盜(Tribolium Genome Sequencing Consortium,2008)、中歐山松大小蠹Dendroctonusponderosae(Keelingetal.,2013)、光肩星天牛(Mckennaetal.,2016)和紅棕象甲R(shí)hynchophorusferrugineus(Hazzourietal.,2020)中分別鑒定到27個(gè)(5個(gè)GH家族)、70個(gè)(7個(gè)GH家族)、86個(gè)(6個(gè)GH家族)和224個(gè)(19個(gè)GH家族)GH基因。因此，鞘翅目不同昆蟲間GH基因在家族大小和數(shù)量上均存在不同程度的差異，推測(cè)其可能與不同昆蟲的寄主范圍有關(guān)。

昆蟲GH基因主要在與糖類物質(zhì)消化吸收有關(guān)的腸道中表達(dá)，此外在不同發(fā)育階段的組織中也有表達(dá)。桑天牛的AgerGH5、GH45-1和GH45-2基因均在中腸中特異表達(dá)(Leeetal.,2004;Leeetal.,2005;Weietal.,2006)；類似地，光肩星天牛中腸中也存在大量的GH基因(Scullyetal.,2013)；長須羅蛉Lutzomyialongipalpis的GH基因在幼蟲、蛹、成蟲或成蟲頭部等組織中均有不同程度的表達(dá)(Moraesetal.,2014)。昆蟲GH基因超家族下的家族成員數(shù)量眾多，不同家族的基因功能也有所不同。在光肩星天牛中，GH1和GH5家族的酶主要具有纖維素酶活性；而GH28、GH45和GH48家族的酶則主要具有多聚半乳糖醛酸酶活性(Mckennaetal.,2016)。類似的關(guān)于GH降解糖類物質(zhì)的研究在日本桑天牛Aprionajaponica(Pauchetetal.,2014)、云斑天牛Batocerahorsfieldi(Xiaetal.,2013;Meietal.,2015)、葉甲G.viridula(Buschetal.,2018)、赤擬谷盜(Willisetal.,2011)等鞘翅目昆蟲中也有報(bào)道。

管紋艷虎天牛是一種取食木本植物的蛀干害蟲，其體內(nèi)存在大量GH家族基因，但是至今尚未有該家族基因的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究基于測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、生物信息學(xué)、蛋白同源建模等方法研究管紋艷虎天牛的GH基因。研究結(jié)果可為后續(xù)管紋艷虎天牛GH基因的功能研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為該天牛寄主取食及適應(yīng)機(jī)制的研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

管紋艷虎天牛收集自寄主植物三臺(tái)核桃Juglanssigillata受害木段。首先，野外采集受害核桃木段(云南省楚雄州大姚縣三臺(tái)鄉(xiāng)：N26°00′01.6″，E101°04′04.7″)至室內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)，樹干兩端用凡士林和封口膜進(jìn)行保濕，飼養(yǎng)條件：25±3℃，相對(duì)濕度50%±10%，光周期12 L ∶12 D；其次，待天牛成蟲羽化后根據(jù)腹部形態(tài)特征區(qū)分雌雄蟲(尹寧娜等,2019)，分開飼養(yǎng)，并提供10%的蜂蜜水、核桃枝干和樹葉；最后，分別收集3～5 d的雌雄蟲觸角、跗節(jié)、不含觸角和跗節(jié)的殘?bào)w用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，每個(gè)組織收集兩套生物學(xué)模板和進(jìn)行兩次重復(fù)測(cè)序(Zhaoetal.,2020a)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1基因的鑒定

為了盡可能鑒定管紋艷虎天牛的GH基因，選取光肩星天牛、赤擬谷盜、中歐山松大小蠹、馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata等具有基因組的鞘翅目昆蟲GH蛋白序列(Tribolium Genome Sequencing Consortium,2008;Pauchetetal.,2010;Keelingetal.,2013;McKennaetal.,2016;Buschetal.,2019)，構(gòu)建GH蛋白序列本地?cái)?shù)據(jù)庫。根據(jù)測(cè)序的管紋艷虎天牛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Zhaoetal.,2020a)，將其導(dǎo)入Geneious 10.1.3軟件(https://www.geneious.com/)中。以構(gòu)建的GH蛋白序列本地庫為靶標(biāo)，采用TBLASTN同源搜索的方法搜索經(jīng)Trinity v2.5.1軟件組裝的轉(zhuǎn)錄組(Trinity.fasta)(Grabherretal.,2011)(搜索參數(shù)：BLOSUM62矩陣，E值設(shè)定為1e-5，每條序列最大搜索比對(duì)數(shù)為20)，鑒定RhorGHs基因。采用相同的方法搜索經(jīng)Corset v1.05軟件聚類處理后有注釋信息的轉(zhuǎn)錄組(Unigene.fasta)(Davidson and Oshlack,2014)。以鑒定的RhorGHs蛋白為靶標(biāo)序列，分別搜索Trinity.fasta和Unigene.fasta兩個(gè)數(shù)據(jù)庫，鑒定種間一致性較低但種內(nèi)一致性較高的RhorGHs基因；最后，在NCBI NR蛋白序列數(shù)據(jù)庫(National Center for Biotechnology Information Non-redundant protein sequence database)中進(jìn)行BLASTP比對(duì)，完成亞家族劃分和保守域確定。

1.2.2序列及進(jìn)化分析

為了確定RhorGHs基因是否是全長序列，根據(jù)以下兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷：(1)NCBI BLAST比對(duì)結(jié)果，即與其他昆蟲中具有全長序列的GH進(jìn)行長度比較；(2)昆蟲不同GH家族基因的序列特征，包括糖基化位點(diǎn)、信號(hào)肽和保守域。不同GH家族基因的氨基酸序列比對(duì)采用ClustalW軟件進(jìn)行，比對(duì)完成后分析不同GH間的氨基酸一致性(Larkinetal.,2007)。序列編輯采用Jalview v2.8軟件進(jìn)行(Waterhouse,2009)。分子量(Molecular weight,Mw)和等電點(diǎn)(Isoelectric point,pI)預(yù)測(cè)利用在線工具Compute pI/Mw(https://web.expasy.org/compute_pi/)完成。采用SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)GH的信號(hào)肽序列(Petersenetal.,2011)。N-糖基化位點(diǎn)(N-glycosylation predicted sites,NPS)利用NetNGlyc 1.0 Server在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/netnglyc/)預(yù)測(cè)。

在進(jìn)化分析中，主要選取鞘翅目昆蟲、細(xì)菌和真菌的GH序列，其中GH9家族也選取了其他 5個(gè)目12種昆蟲的蛋白序列：半翅目的桃蚜Myzuspersicae、豌豆蚜Acyrthosiphonpisum、大豆蚜Aphisglycines、雪松長足大蚜Cinaracedri和褐飛虱Nilaparvatalugens；蜚蠊目的達(dá)爾文澳白蟻Mastotermesdarwiniensis、內(nèi)華達(dá)古白蟻Zootermopsisnevadensis、北美散白蟻Reticulitermesflavipes和美洲大蠊Periplanetaamericana；螳螂目的薄翅螳螂Mantisreligiosa；竹節(jié)蟲目的竹節(jié)蟲Timemacristinae；膜翅目的大蜜蜂Apisdorsata。利用MAFFT v7.450軟件進(jìn)行蛋白序列比對(duì)(Katoh and Standley,2013)。采用PhyML 3.0軟件中的最大似然法(Maximum-likelihood method)構(gòu)建進(jìn)化樹(Guindonetal.,2010)。采用FigTree v1.4.4軟件對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行編輯和可視化分析(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)。

1.2.3基因的表達(dá)譜研究

為了明確RhorGHs基因在不同組織的表達(dá)情況，根據(jù)測(cè)序獲得的FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)值構(gòu)建它們的表達(dá)譜。先采用Bowtie 2軟件將Clean reads比對(duì)到Unigene轉(zhuǎn)錄組(Langmead and Salzberg,2012)；利用RSEM軟件統(tǒng)計(jì)比對(duì)到基因上的Reads數(shù)(Dewey and Li,2011)，并用FPKM值方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算每個(gè)基因在不同組織的表達(dá)水平(Trapnelletal.,2010)；然后用RhorGHs基因搜索Unigene.fasta數(shù)據(jù)庫，找到其對(duì)應(yīng)的基因編號(hào)；最后，根據(jù)基因編號(hào)找到其在不同組織的FPKM值，利用兩次重復(fù)的平均值繪制表達(dá)譜熱圖。

1.2.4RhorGH28蛋白的同源建模

選取管紋艷虎天牛RhorGH28家族中具有全長序列的5個(gè)RhorGH28s基因(RhorGH28-1、GH28-2、GH28-3、GH28-4和GH28-5)，在NCBI PDB蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(NCBI Protein Data Bank protein database)中進(jìn)行BLASTP比對(duì)，比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個(gè)RhorGH28s均與黑曲霉Aspergillusniger的多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶(Endo-polygalacturonase,AnigPGA-II)具有最高氨基酸一致性；根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果截取與AnigPGA-II對(duì)應(yīng)長度的RhorGHs的C端區(qū)域；以AnigPGA-II蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：1CZF)為模板(Vanetal.,2016)，采用MODELLER 9v7軟件分別構(gòu)建5個(gè)RhorGH28s蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(Sali and Blundell,1993)。三級(jí)結(jié)構(gòu)的編輯和可視化分析采用PyMOL軟件進(jìn)行(https://pymol.org/)。

2 結(jié)果與分析

2.1 管紋艷虎天牛RhorGHs基因的鑒定

基于已測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Zhaoetal.,2020a)，從管紋艷虎天牛中鑒定到7個(gè)GH基因家族：GH1、GH9、GH13、GH16、GH28、GH31和GH45，共56個(gè)基因；除RhorGH1-13基因僅存在于Trinity轉(zhuǎn)錄組外，其余55個(gè)基因在Trinity和Unigene數(shù)據(jù)庫中均檢測(cè)到。其中，GH1包含23個(gè)基因，有8個(gè)基因(RhorGH1-1～GH1-8)具有全長序列，編碼484～505個(gè)氨基酸；除RhorGH1-2接近中性外，其余7個(gè)均偏酸性；分子量在55.02～58.62 kDa之間；8個(gè)RhorGH1s蛋白間糖基化位點(diǎn)在數(shù)量和位置上均存在一定差異，其中RhorGH1-4、GH1-5和GH1-6均有5個(gè)糖基化位點(diǎn)，而RhorGH1-1只有1個(gè)。其余15個(gè)基因(RhorGH1-9～GH1-23)為片段，編碼216～505個(gè)氨基酸(表1)。

在GH9家族中，只有1個(gè)基因(RhorGH9)，為片段，編碼437個(gè)氨基酸。在GH13家族中，4個(gè)基因均為片段，編碼235～366個(gè)氨基酸。在GH16家族中，2個(gè)基因(RhorGH16-1和GH16-2)均為片段。在GH28家族中，鑒定到10個(gè)基因，其中RhorGH28-1～GH28-5基因具有全長序列，編碼364～369個(gè)氨基酸；除RhorGH28-3和GH28-4偏堿性外，其余3個(gè)均接近中性；糖基化位點(diǎn)數(shù)量相對(duì)較少(1～3個(gè))，但是其位置相對(duì)保守。RhorGH28-6～GH28-10等5個(gè)基因?yàn)槠危幋a182～373個(gè)氨基酸(表1)。

在GH31家族中，鑒定到12個(gè)基因，其中RhorGH31-1～GH31-6基因是全長序列，編碼632～1 020個(gè)氨基酸；分子量在72.23～116.02 kDa之間；RhorGH31-4糖基化位點(diǎn)最多，有16個(gè)，其余5個(gè)基因均有6個(gè)糖基化位點(diǎn)，但位置變化較大。RhorGH31-7～GH31-12等6個(gè)基因?yàn)槠?，編碼282～725個(gè)氨基酸。在GH45家族中，RhorGH45-1～GH45-4基因都是全長序列，編碼234～240個(gè)氨基酸；除RhorGH45-3偏堿性外，其余3個(gè)均偏酸性；4個(gè)RhorGH45S均只有1個(gè)糖基化位點(diǎn)(表1)。

表1 管紋艷虎天牛全長RhorGHs基因的信息Table 1 Information for full-length RhorGH genes of Rhaphuma horsfieldi

2.2 RhorGH1家族基因的序列及進(jìn)化特征

選取GH1家族中具有全長序列的8個(gè)RhorGH1s進(jìn)行序列比對(duì)和分析。結(jié)果表明，所有RhorGH1s在N端均具有信號(hào)肽序列，長度為17～23個(gè)氨基酸。不同蛋白間氨基酸一致性變化范圍較大(38.31%～73.49%)，平均一致性為47.19%，其中RhorGH1-7與GH1-8一致性最高(73.49%)，而RhorGH1-6與GH1-8一致性最低(38.31%)。在功能區(qū)域內(nèi)所有RhorGH1s具有高度保守的氨基酸殘基，如質(zhì)子供體(E/Q：谷氨酸和谷氨酰胺)和催化親核殘基(E)(圖1)。

圖1 管紋艷虎天牛RhorGH1s蛋白的氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Alignment of amino acid sequences of RhorGH1 proteins in Rhaphuma horsfieldi注：N端黑色方框內(nèi)的氨基酸為信號(hào)肽序列。黑色三角形標(biāo)示的是質(zhì)子供體(E/Q)和催化親核殘基(E)。Note:Signal peptide sequences at N-termini were boxed in black.Putative residues for the proton donors (E/Q) and catalytic nucleophiles (E) were marked in black triangles,respectively.

選取4種鞘翅目昆蟲(光肩星天牛、中歐山松大小蠹、赤擬谷盜和管紋艷虎天牛)、3種細(xì)菌(解糖熱解纖維素菌Caldicellulosiruptorsaccharolyticus、熱纖梭菌Hungateiclostridiumthermocellum和熱解糖熱厭氧桿菌Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)和4種真菌(黑曲霉、尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum、灰腐質(zhì)霉Humicolagrisea和長柄木霉Trichodermalongibrachiatum)GH1家族的 119個(gè)蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果表明，鞘翅目昆蟲的GH1具有物種或科特異聚類的特點(diǎn)，其中3個(gè)分支僅包含天?？评ハx光肩星天牛和管紋艷虎天牛的GH1，而且管紋艷虎天牛具有2個(gè)種特異的擴(kuò)增(RhorGH1-1/GH1-4/GH1-7～GH1-10/GH1-16和RhorGH1-6/GH1-11～GH1-15)。此外，3個(gè)分支呈種特異的聚類，包括2個(gè)中歐山松大小蠹和1個(gè)赤擬谷盜的GH1分支；1個(gè)混合分支與細(xì)菌和真菌的親緣關(guān)系較近，其中管紋艷虎天牛在該分支中僅有RhorGH1-2(圖2)。

圖2 鞘翅目、細(xì)菌和真菌GH1蛋白的進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of GH1 proteins in Coleoptera,bacteria and fungi注：管紋艷虎天牛的RhroGH1s蛋白用黑色箭頭標(biāo)示。用細(xì)菌的GH1作為進(jìn)化樹的根。Agla，光肩星天牛；Dpon，中歐山松大小蠹；Rhor，管紋艷虎天牛；Tcas，赤擬谷盜；Csac，解糖熱解纖維素菌；Hthe，熱纖梭菌；Tthe，熱解糖熱厭氧桿菌；Anig，黑曲霉；Foxy，尖孢鐮刀菌；Hgri，灰腐質(zhì)霉；Tlon，長柄木霉。Note:RhorGH1 proteins from Rhaphuma horsfieldi were indicated with black arrows.GH1 members of bacteria were used to root the tree.Agla,Anoplophora glabripennis;Dpon,Dendroctonus ponderosae;Rhor,Rhaphuma horsfieldi;Tcas,Tribolium castaneum;Csac,Caldicellulosiruptor saccharolyticus;Hthe,Hungateiclostridium thermocellum;Tthe,Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum;Anig,Aspergillus niger;Foxy,Fusarium oxysporum;Hgri,Humicola grisea;Tlon,Trichoderma longibrachiatum.

2.3 RhorGH9/GH13/GH16家族基因的序列及進(jìn)化特征

在GH9、GH13和GH16蛋白的進(jìn)化分析中，3個(gè)家族的成員各自聚類到不同的分支中。其中，管紋艷虎天牛的RhorGH9與其他昆蟲的GH9具有較高的支持率(>0.70)和中等的氨基酸一致性(平均值為58.19%)；4個(gè)RhorGH13s聚類到鞘翅目昆蟲的1個(gè)小分支；2個(gè)RhorGH16s聚類到鞘翅目昆蟲的GH16家族，在該分支中的GH16主要以物種特異的形式聚成不同的小分支(圖3)。

圖3 昆蟲、細(xì)菌和真菌GH9、GH13和GH16蛋白的進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of GH9,GH13 and GH16 proteins in insects,bacteria and fungi注：管紋艷虎天牛的RhroGH9、GH13和GH16蛋白用黑色箭頭標(biāo)示。用細(xì)菌的GH16作為進(jìn)化樹的根。Ador，大蜜蜂；Agly，大豆蚜；Apla，白蠟窄吉?。籄pis，豌豆蚜；Aver，沙漠鐵包甲蟲；Cced，雪松長足大蚜；Dvir，玉米根螢葉甲；Gvir，葉甲；Ldec，馬鈴薯甲蟲；Mdar，達(dá)爾文澳白蟻；Mper，桃蚜；Mrel，薄翅螳螂；Nlug，褐飛虱；Orhi，椰子犀角金龜；Pame，美洲大蠊；Ppyr，螢火蟲；Rfla，北美散白蟻；Tcri，竹節(jié)蟲；Tmol，黃粉蟲；Znev，內(nèi)華達(dá)古白蟻；Amac，麥?zhǔn)辖惶鎲伟籊joo，單胞菌；Pfla，金黃色假交替單胞菌；Bbas，球孢白僵菌；Cmil，蛹蟲草菌；其余物種縮寫見圖2。Note:RhorGH9,GH13 and GH16 proteins from Rhaphuma horsfieldi were indicated with black arrows,respectively.GH16 members of bacteria were used to root the tree.Ador,Apis dorsata;Agly,Aphis glycines;Apla,Agrilus planipennis;Apis,Acyrthosiphon pisum;Aver,Asbolus verrucosus;Cced,Cinara cedri;Dvir,Diabrotica virgifera virgifera;Gvir,Gastrophysa viridula;Ldec,Leptinotarsa decemlineata;Mdar,Mastotermes darwiniensis;Mper,Myzus persicae;Mrel,Mantis religiosa;Nlug,Nilaparvata lugens;Orhi,Oryctes rhinoceros;Pame,Periplaneta americana;Ppyr,Photinus pyralis;Rfla,Reticulitermes flavipes;Tcri,Timema cristinae;Tmol,Tenebrio moliter;Znev,Zootermopsis nevadensis;Amac,Alteromonas macleodii;Gjoo,Gayadomonas joobiniege;Pfla,Pseudoalteromonas flavipulchra;Bbas,Beauveria bassiana;Cmil,Cordyceps militaris.The abbreviation of other species was listed in Fig.2.

2.4 RhorGH28家族基因的序列及進(jìn)化特征

在昆蟲GH28家族的進(jìn)化分析中，考慮到鞘翅目每個(gè)物種具有較少數(shù)量的GH28基因，選取了更多鞘翅目昆蟲的蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果表明，鞘翅目昆蟲的GH28家族主要以種特異的形式聚類，其中管紋艷虎天牛的GH28被分散到3個(gè)分支中(RhorGH28-10、RhorGH28-6/GH28-9和RhorGH28-1～GH28-5/GH28-7～GH28-8)，第3個(gè)分支呈現(xiàn)物種特異的擴(kuò)增；其他種特異的聚類還包括光肩星天牛(1個(gè)分支)、四紋豆象Chrysomelatremula(1個(gè)分支)、中歐山松大小蠹和米象Enterococcussaccharolyticus(2個(gè)分支)。此外，葉甲科昆蟲的GH28具有2個(gè)大的聚類分支，其中管紋艷虎天牛有2個(gè)分支分別與它們具有較近的親緣關(guān)系(圖4)。

圖4 鞘翅目、細(xì)菌和真菌GH28蛋白的進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of GH28 proteins in Coleoptera,bacteria and fungi注：管紋艷虎天牛的RhroGH28蛋白用黑色箭頭標(biāo)示。用細(xì)菌的GH28作為進(jìn)化樹的根。Cmac，四紋豆象；Ctre，山楊葉甲；Pcoc，辣根猿葉蟲；Sory，米象；Esac，解糖腸球菌；Pfon，細(xì)菌；Skue，細(xì)菌；Chig，菜炭疽菌；Lmac，油菜莖基潰瘍病菌；Tter，太瑞斯梭孢殼霉；其余物種縮寫見圖2和圖3。Note:RhorGH28 proteins from Rhaphuma horsfieldi were indicated with black arrows.GH28 members of bacteria were used to root the tree.Cmac,Callosobruchus maculatus;Ctre,Chrysomela tremula;Pcoc,Phaedon cochleariae;Sory,Sitophilus oryzae;Esac,Enterococcus saccharolyticus;Pfon,Paenibacillus fonticola;Skue,Saccharibacillus kuerlensis;Chig,Colletotrichum higginsianum;Lmac,Leptosphaeria maculans;Tter,Thielavia terrestris.The abbreviation of other species was listed in Fig.2 and Fig.3.

以黑曲霉AnigPGA-II的晶體結(jié)構(gòu)為模板，采用同源建模的方法構(gòu)建了RhorGH28家族中RhorGH28-1、GH28-2、GH28-3、GH28-4和GH28-5 等5個(gè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。根據(jù)黑曲霉AnigPGA-II晶體結(jié)構(gòu)的氨基酸序列，選取5個(gè)RhorGH28s蛋白C端相應(yīng)區(qū)域的氨基酸(346～350個(gè))進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果表明，5個(gè)蛋白相互間具有高的氨基酸一致性(57.14%～74.43%)，但它們與AnigPGA-II均只具有中等的一致性(39.66%～43.35%)(圖5-A)。

圖5 管紋艷虎天牛5個(gè)RhorGH28s蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Three-dimensional (3D) structures of five RhorGH28 proteins from Rhaphuma horsfieldi注：(A)管紋艷虎天牛5個(gè)RhorGH28s與黑曲霉AnigPGA-II的氨基酸序列比對(duì)。根據(jù)黑曲霉AnigPGA-II的晶體結(jié)構(gòu)，質(zhì)子供體(D182)、催化親核殘基(D161和D183)和參與底物結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸(N159、H204、H205、R240、K242和Y276)被標(biāo)示。參與二硫鍵形成的8個(gè)半胱氨酸用數(shù)字標(biāo)示；此外，第5對(duì)可能的二硫鍵用虛線標(biāo)示。(B)管紋艷虎天牛5個(gè)RhorGH28的三級(jí)結(jié)構(gòu)。在圖5-A中的關(guān)鍵氨基酸和4對(duì)二硫鍵在三級(jí)結(jié)構(gòu)上被標(biāo)示。Nt，N端；Ct，C端。Note:(A) Alignment of five RhorGH28s and AnigPGA-II amino acid sequences.Based on the crystal structure of AnigPGA-II,the residues for the proton donor (D182),catalytic nucleophile (D161 and D183) and substrate binding (N159,H204,H205,R240,K242 and Y276) were shown,respectively.Eight cysteines involving the formation of disulfide bridges were numbered 1 to 4.The fifth putative disulfide bridge was indicated with a dashed line.(B) 3D models of five RhorGH28s.In Fig.5-A,key amino acids and four disulfide bridges were labeled on their respective 3D structures,respectively.Nt,N-termini;Ct,C-termini.

同源建模結(jié)果表明，5個(gè)RhorGH28s的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由β折疊組成，每個(gè)蛋白包括28個(gè)折疊片、1個(gè)α螺旋、N端和C端，其中三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由4對(duì)二硫鍵和1對(duì)可能的二硫鍵穩(wěn)定。所有RhorGH28s的大部分β折疊間一致性較低，但質(zhì)子供體和催化親核殘基則高度保守。在第一個(gè)親核殘基中，除RhorGH28-5是天冬酰胺(N)外，其余5個(gè)均為天冬氨酸(D)；所有6個(gè)蛋白的第二個(gè)親核殘基均為天冬氨酸(D)；此外，它們也具有相同的質(zhì)子供體氨基酸(D)。除以上3個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)外，在RhorGH28s和AnigPGA-II中還具有高度保守的底物結(jié)合位點(diǎn)，如N159、組氨酸(H204、H205)、精氨酸(R240)、賴氨酸(K242)和酪氨酸(Y276)(圖5-B)。

2.5 RhorGHs基因的組織表達(dá)特征

除RhorGH1-13基因在Unigene數(shù)據(jù)庫中未檢測(cè)到外，研究了7個(gè)GH家族共55個(gè)基因在雌雄蟲觸角、跗節(jié)和殘?bào)w的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在RhorGH1家族中，RhorGH1-1、GH1-3和GH1-20基因在所有組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)的特點(diǎn)，其余基因主要在殘?bào)w中特異或高表達(dá)。在RhorGH13家族中，RhorGH13-2和GH13-3兩個(gè)基因在6個(gè)組織具有廣泛且高表達(dá)的特征，而RhorGH13-4基因在所有組織中的表達(dá)量均較低。RhorGH9基因在所有組織中均具有高表達(dá)。RhorGH16-1基因在6個(gè)組織中均具有較高表達(dá)，尤其是在雌雄蟲觸角和跗節(jié)。大部分RhorGH28s基因主要在兩性殘?bào)w中特異或高表達(dá)，包括RhorGH28-1～GH28-7和GH28-9基因。在RhorGH31家族中，除RhorGH31-1基因外，其余基因在測(cè)試的至少兩個(gè)組織中有表達(dá)。RhorGH45-1基因在所有組織中均具有較高表達(dá)，RhorGH45-3和GH45-4基因在雌雄蟲殘?bào)w中高表達(dá)(圖6)。

圖6 管紋艷虎天牛RhorGHs基因在雌雄蟲不同組織的表達(dá)譜Fig.6 Expression profile of RhorGHs in different tissues of both sexes from Rhaphuma horsfieldi注：不同顏色表示兩次重復(fù)的FPKM平均值。FA，雌蟲觸角；MA，雄蟲觸角；FTa，雌蟲跗節(jié)；MTa，雄蟲跗節(jié)；FB，不含觸角和跗節(jié)的雌蟲身體；MB，不含觸角和跗節(jié)的雄蟲身體。Note:Different colors represented an average FPKM value of two replicates.FA,Female antennae;MA,Male antennae;FTa,Female tarsi;MTa,Male tarsi;FB,Female bodies without antennae and tarsi;MB,Male bodies without antennae and tarsi.

3 結(jié)論與討論

管紋艷虎天牛是一種雜食性的蛀干害蟲，先前報(bào)道的寄主植物僅有豆科的香須樹Albiziaodoratissima和樟科的木姜子屬Litsea(云南省林業(yè)廳等,1987)。2014年，Wickham等采用天牛性信息素(2,3-己二醇2,3-Hexanediol和(2R*,3R*)-2,3-辛二醇(2R*,3R*)-2,3-Octanediol)作為誘芯，在云南林間誘捕到大量的管紋艷虎天牛，暗示其寄主植物很可能具有多樣性(Wickhametal.,2014)。2017年，本課題組從三臺(tái)核桃受害木段中首次發(fā)現(xiàn)管紋艷虎天牛，進(jìn)一步增加了其取食寄主植物的范圍。作為一種以幼蟲蛀食樹木為生的害蟲，不同的寄主植物可能促使昆蟲與其體內(nèi)參與植物細(xì)胞壁降解相關(guān)的酶呈現(xiàn)協(xié)同進(jìn)化。關(guān)于該種天牛已有其形態(tài)特征、主要化感組織感器種類、基因家族(化感基因和解毒代謝酶)等的報(bào)道(尹寧娜等,2019;王政全等,2020;Zhaoetal.,2020a;Zhaoetal.,2020b;李根層等,2021)，但缺乏植物細(xì)胞壁降解酶基因家族(如GH)的相關(guān)研究。昆蟲GH基因是其體內(nèi)一類龐大的水解酶家族，可將植物中的糖類化合物轉(zhuǎn)化為昆蟲消化和吸收的低聚糖或單糖，在植食性昆蟲的取食和寄主適應(yīng)性進(jìn)化中起著重要作用(Pauchetetal.,2010;Watanabe and Tokuda,2010;Fischeretal.,2013)。因此，本研究基于發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組(Zhaoetal.,2020a)，鑒定和研究了管紋艷虎天牛中參與植物細(xì)胞壁降解的重要酶：GH。研究結(jié)果有助于了解管紋艷虎天牛寄主植物范圍與GH家族的相關(guān)性，為其寄主偏好性和適應(yīng)性機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

與同科的光肩星天牛(6個(gè)GH家族：86個(gè)基因)相比，管紋艷虎天牛具有7個(gè)GH家族共56個(gè)基因；通過分析發(fā)現(xiàn)兩種天牛僅有4個(gè)GH家族相同(GH1、GH9、GH28和GH45)，基因數(shù)量的差異主要存在于GH1(管紋艷虎天牛：23個(gè)；光肩星天牛：57個(gè))和GH28(管紋艷虎天牛：10個(gè)；光肩星天牛：18個(gè))家族；此外，管紋艷虎天牛還具有GH13、GH16和GH31家族，而光肩星天牛還包括GH5和GH48家族(McKennaetal.,2016)。與鞘翅目其他科的昆蟲相比，管紋艷虎天牛GH基因的數(shù)量多于赤擬谷盜(5個(gè)GH家族：27個(gè))(Tribolium Genome Sequencing Consortium,2008)，但是明顯少于大足象(55個(gè)GH家族：309個(gè))(Luoetal.,2018)和紅棕象甲(19個(gè)GH家族：224個(gè))(Hazzourietal.,2020)。鞘翅目不同昆蟲間GH基因數(shù)量差異的主要原因可能有：一是基因鑒定的數(shù)據(jù)庫不同，部分物種(管紋艷虎天牛和大足象)是從轉(zhuǎn)錄組中鑒定，而部分物種(光肩星天牛、赤擬谷盜和紅棕象甲)則是從基因組中鑒定；二是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組織差異和測(cè)序深度不同，雖然都來源于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，但是由于測(cè)序深度和組織的不同使得管紋艷虎天牛的GH基因數(shù)量少于其他昆蟲；三是基因組測(cè)序和組裝質(zhì)量存在差異，導(dǎo)致GH基因未能全部得到鑒定；四是取食寄主植物的差異性，由于GH基因的功能主要與糖類化合物的水解有關(guān)，不同寄主植物因糖類物質(zhì)或糖的濃度不同而導(dǎo)致昆蟲GH家族基因的收縮或擴(kuò)張。

在序列比對(duì)分析中，RhorGH1和GH28家族的蛋白在關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)處(如質(zhì)子供體、催化親核殘基以及底物結(jié)合位點(diǎn))高度保守，暗示它們對(duì)糖類物質(zhì)的水解具有高度的底物特異性和保守性，尤其是5個(gè)具有較高相似性的RhorGH28s(RhorGH28-1～GH28-5)。在進(jìn)化分析中，RhorGH1(RhorGH1-6/GH11～15和RhorGH1-4/GH1-7～GH1-10/GH1-16)和GH28(RhorGH28-1～GH28-5/GH28-7～GH28-8)家族的部分成員以物種特異的形式聚類成小分支，且具有較高的支持率(>0.70)，這種物種特異的擴(kuò)增暗示它們可能起源于基因的復(fù)制。據(jù)此推測(cè)其他物種GH1和GH28聚類分支中的成員也通過基因的復(fù)制產(chǎn)生，即它們位于同一條染色體上。在GH1家族中，主要驗(yàn)證了與管紋艷虎天牛兩個(gè)聚類分支進(jìn)化關(guān)系較近的光肩星天牛AglaGH1s和赤擬谷盜TcasGH1s，與預(yù)期結(jié)果一致，光肩星天牛的兩個(gè)聚類分支AglaGH1-6/GH1-8/GH1-10～GH1-12/GH1-15/GH1-17/GH1-48和AglaGH1-5/GH1-13/GH1-22/GH1-28基因均位于Scaffold 278上(McKennaetal.,2016)；赤擬谷盜的TcasGH1-6/GH1-7/GH1-9/GH1-11/GH1-12/GH1-16基因在染色體LG7上(Tribolium Genome Sequencing Consortium,2008)。在GH28家族中，光肩星天牛的AglaGH28-7～GH28-13基因位于5條Scaffold上，而AglaGH28-14～GH28-18基因位于同一條Scaffold 206上(McKennaetal.,2016)。因此，分析認(rèn)為管紋艷虎天牛的兩個(gè)RhorGH1s聚類分支可能分別位于兩條染色體上，且通過基因的復(fù)制產(chǎn)生；而RhorGH28s聚類分支的成員是否位于同一條染色體上仍有待進(jìn)一步研究。

昆蟲GH家族的基因主要在與糖類物質(zhì)消化和吸收有關(guān)的腸道中表達(dá)，并呈現(xiàn)腸道特異或高表達(dá)的特點(diǎn)(Watanabe and Tokuda,2010)。在天?？评ハx桑天牛(AgerGH5、GH45-1和GH45-2)(Leeetal.,2004;Leeetal.,2005;Weietal.,2006)、光肩星天牛(Scullyetal.,2013)、桑樹黃星天牛(PhilGH5)(Sugimuraetal.,2003)、日本桑天牛(AjapGH5和GH45家族基因)(Pauchetetal.,2014)、大足象(Cqbgln5和Cqbgln7)(Luoetal.,2018)、辣根猿葉蟲Phaedoncochleariae(PcocGH11、GH28和GH45家族基因)(Kirschetal.,2012)、玉米根螢葉甲(DvirENGaseI)(Valenciaetal.,2013)、金眼竹節(jié)蟲Peruphasmaschultei(Matanetal.,2014)和豌豆蚜Acyrthosiphonpisum(ApisAPS1)(Priceetal.,2007)中，GH基因均具有中腸特異或高表達(dá)的特點(diǎn)。本研究中管紋艷虎天牛的大部分RhorGHs基因在殘?bào)w中特異或高表達(dá)，鑒于先前GH的表達(dá)特征和消化水解功能，暗示RhorGHs基因很可能主要在管紋艷虎天牛的腸道中表達(dá)，即RhorGHs基因主要參與植物中糖類物質(zhì)的水解。此外，昆蟲GH基因在絲腺、卵、蛹、頭部等組織中也有表達(dá)，說明該家族基因可能還參與到昆蟲其他生理過程(Scharfetal.,2010;Eyunetal.,2014;Moraesetal.,2014;Luoetal.,2018)。在管紋艷虎天牛中，部分RhorGHs基因在化感器官(觸角和跗節(jié))中有表達(dá)，說明它們可能具有嗅覺或味覺功能。